专利名称：猴空泡病毒的实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中病毒的分子生物学检测方法，特别是涉及猴空泡病毒 的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。
背景技术：
猴空泡病毒(SimianVirus 40，SV40)属于乳多空病毒科(Papovaviruidae)，多 瘤病毒属(Polyomavirus)，是一种DNA肿瘤病毒。由三种病毒外壳蛋白质Vpl、Vp2和Vp3 构成，中间包装着一条环形的病毒基因组DNA。通过不同的剪辑途径，早期初级转录本加工 成2种不同的早期mRNA，而晚期的初级转录本加工成3种不同的晚期mRNA。2种早期mRNA 分别编码大T抗原的小t抗原(即肿瘤蛋白质或抗原)。晚期转录本按照其特定的沉降系 数，分为16S、18S和19S三种mRNA，它们分别编码Vpl、Vp3和Vp2衣壳蛋白([1]动物病毒 学(第二版)，殷震，刘景华主编，科学出版社，1997。[2]实验动物病毒性疾病，军事医学科 学院实验动物中心主编，农业出版社，1992。)。SV40最早是在未接种病毒的猴肾细胞培养物中分离得到的，它能够转化灵长类细 胞，其虽然不会对灵长类动物致病，但在物种间的传播会引起致病性的改变。近年来，SV40 与人类肿瘤的关系得到了大量的研究，表明SV40与癌症有密切关系，比如肾脏疾病和出血 性膀胱炎，进行性多灶性白质脑病，原发性脑癌和骨癌，间皮瘤和非霍奇金淋巴瘤等。根据 SV40感染作用的不同效应，可将其寄主细胞分成三种不同的类型。SV40在感染了 Vero和 BSC-I猴肾细胞系之后，便产生感染性的病毒颗粒，并使寄主细胞裂解。猴的细胞系属于受 纳细胞(permissive cell)。而啮齿动物(如小鼠)的细胞，就不会产生感染性颗粒，此时 病毒基因组整合到寄生细胞的染色体上，于是细胞便被转化，就会发生癌变。这种啮齿动 物细胞为SV40的非受纳细胞(non-permissive cell)。人的细胞是SV40的半受纳细胞 (semi-permissive cell)，因为同SV40接触的人体细胞中，有 2%会产生出感染性的 病毒。基于这些特性，SV40是第一个被用作哺乳动物克隆载体的病毒。因SV40在猴体内主要成隐性感染，已有文献报道在我国猴群中广泛存在SV40 感染(实验动物病毒性疾病，军事医学科学院实验动物中心主编，农业出版社，1992。)， 极有可能造成猴源性生物制品的污染，所以提高实验用猴和猴源性生物制品的病毒检测 能力既能够保证疫苗等生物制品的安全，又可以避免或减少由于SV40感染引发肿瘤的情 况° 目前，国夕卜临床已经有应用 specific real time quantitative polymerase chain reaction(RQ-PCR)方法检测临床样本中多瘤病毒BKV，JCV以及SV40感染的检测，以及分 析猴源性生物制品(如脊髓灰质炎减毒活疫苗)的SV40污染情况。PCR技术由于其快速、 安全且具有较高敏感性和特异性等优点被广泛应用。作为相关疫苗的生产原料，对猴源性 生物制品SV40污染的检测变得尤为重要。我国药典中对于SV40的检测提供了 PCR的检测 方法，但在实际工作中发现存在扩增效果不佳的情况，极有可能出现漏检。因此，研究人员 进一步优化了引物等相关条件，对PCR方法进行了改进，对猴的组织器官、脊髓灰质炎减毒 活疫苗糖丸进行了 SV40核酸的检测，在检测中获得了不错的效果。同时建立了间接免疫荧
3光实验(IFA)检测猴血清中的SV40大T抗原抗体，但是IFA的结果判定存在主观因素，因 此影响了特异性。然而随着分子生物学的不断发展，以及我国对生物制品安全要求的不断 提高，要求有更高敏感性和特异性的检测方法应用于检测。近年来，实时荧光定量PCR (real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR) 技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析、突变和多态性研究、病 原体的定性和定量检测等方面得到广泛应用。实时荧光定量PCR是一种高通量的荧光分析 技术，是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物 的量，并据此推断目的基因的初始量，可推算出组织中病毒的含量。综上所述，为了实现猴群的批量检测，分析猴群中猴空泡病毒的感染状况，提高检 测的灵敏度，建立猴空泡病毒的实时荧光定量PCR检测方法，以及研制相应的检测试剂变 得十分迫切，对于控制SV40传播和人民用药安全具有深远意义。
发明内容
本发明提供了用于对猴空泡病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探 针。本发明所提供的引物和TaqMan探针，是根据猴空泡病毒Large T基因的保守区域 设计的，用以定量检测猴淋巴细胞或相关生物制品中的猴空泡病毒核酸拷贝数。具体来讲，所述引物的上游引物具有序列表中SEQ ID NO :1的核苷酸序列，下游引 物具有序列表中SEQ ID NO 2的核苷酸序列；所述TaqMan探针具有序列表中SEQID NO 3 的核苷酸序列。所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5 ’端标记有报告荧光基团，3 ’端标记有淬 灭荧光基团。所述报告荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为Eclipse。本发明的第二个目的是提供一种灵敏度较高且可准确定量的猴空泡病毒的实时 荧光定量PCR检测方法。本发明所提供检测方法，是以本发明的引物和TaqMan探针进行的实时荧光定量 PCR检测方法。所述20ul实时荧光定量PCR反应体系可包括上游引物Iul (IOuM)，下游引物 Iul (IOuM)，TaqMan 探针 0. 5ul (IOuM)，样品 DNA Iul (1 μ g/mL)，无 RNA 酶水 6. 5ul, Taqman Mix (TaqMan Gene Expression Master Mix 4369016，购自美国应用系统(ABI)公司)10ul。所述实时荧光定量PCR反应条件可为先50°C 2min;然后95°C lOmin;最后95°C 15s,60°C lmin，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。所述检测方法还包括标准曲线的建立，方法为用含有目的片段的质粒作为标准 品，将其10倍系列稀释成①6x1ο—1拷贝/μ 1 ；②6X10_2拷贝/μ 1 ；③6Χ10_3拷贝/ μ 1 ；④6Χ10_4拷贝/ μ 1 ；⑤6Χ10_5拷贝/ μ 1。将质粒作为模板进行实时荧光定量PCR 检测，得到用于猴空泡病毒检测的标准曲线。所述标准曲线的20ul实时荧光定量PCR反应体系包括上游引物Iul (IOuM)，下 游引物 Iul (IOuM)，TaqMan 探针 0. 5ul (IOuM)，质粒 DNA Iul (0. lmg/mL)，无 RNA 酶水 6. 5ul, Taqman Mix (TaqMan Gene Expression Master Mix 4369016，_ 自胃· (ABI) ,k
4司)10ul。实时荧光定量PCR反应条件与上述相同。本发明的第三个目的是提供一种用于对猴空泡病毒进行实时荧光定量PCR检测 的试剂盒。本发明所提供的试剂盒，包括上述用于对猴空泡病毒进行实时荧光定量PCR检测 的引物和TaqMan探针。本发明提供了一种猴空泡病毒的实时荧光定量PCR检测方法。该方法是以待检样 品中的核酸为检测对象，准确度及精密度均较好。本发明具有以下优点1、建立了猴空泡病毒探针法荧光定量PCR检测方法，利用此检测方法可以对实验 用猴的组织样品及相关生物制品进行批量检测。2、本检测方法与猴空泡病毒的其它常规检测方法如病毒的分离培养鉴定、全病毒 ELISA法、IFA法和普通PCR相比，灵敏度较高，比普通PCR高16000倍，特异性更强，与其它 猴源性DNA病毒没有交叉反应，检测准确性得到了很大的提高，其操作程序化，并可进一步 制成检测试剂盒。3、本检测方法不仅能够评价猴群的猴空泡病毒感染状况，同时也为猴空泡病毒的 流行病学、致病机理等相关领域的研究提供了依据。4、本检测方法也可用于检测猴源性生物制品如脊髓灰质炎疫苗、实验室常用猴源 性细胞中猴空泡病毒的残留状况，从而评价相关生物制品的质量。综上所述，本发明能准确的检测出猴群SV40的感染情况及相关生物制品中SV40 的残留状况，对控制实验猴群的质量具有重要意义，能够保证相关生物制品的质量，对于控 制SV40传播和人民用药安全意义重大。本发明的检测方法及试剂盒可用于猴空泡病毒的 诊断及生物制品的猴空泡病毒检定，应用前景广阔。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为10倍系列稀释pCR2. 1_SV40_LT质粒标准品的实时荧光定量PCR扩增曲线图2为猴空泡病毒的实时荧光定量PCR检测的标准曲线图3为猴空泡病毒实时荧光定量PCR检测的特异性试验及检测应用结果图4为猴空泡病毒实时荧光定量PCR检测的敏感性试验结果
具体实施例方式下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人所编《分子克隆实验指南》中所 述的条件，或按照制造厂商建议的条件。所用引物及TaqMan探针由TaKaRa公司合成，所有 序列测定工作均由宝生物工程(大连)有限公司完成。实施例1、用于对猴空泡病毒(SV40)进行实时荧光定量PCR检测的引物及TaqMan 探针的设计参照GenBank收录的乙脑病毒SA14基因组全序列(GeneBank :U14163)，将与猴空 泡病毒基因组结构极为相似的JC病毒(JCV)、BK病毒(BKV)和猴嗜淋巴多型瘤病毒(LPV) 分别进行序列比对，选择猴空泡病毒Large T抗原基因保守区域，采用ABI PrimerExpress
53. 0实时荧光定量PCR引物设计软件，设计合成TaqMan探针及引物。探针的荧光标记选择 FAM(5‘端)作为报告发光基团，EclipSe(3’端)为淬灭基团。序列如下
权利要求
用于对猴空泡病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针，是根据猴空泡病毒Large T基因的保守区域设计的，用以定量检测猴淋巴细胞或相关生物制品中的猴空泡病毒核酸拷贝数。
2.根据权利要求1所述的引物和TaqMan探针，其特征在于所述引物的上游引物具有 序列表中SEQ ID NO :1的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO :2的核苷酸序列； 所述TaqMan探针具有序列表中SEQ ID NO 3的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的引物和TaqMan探针，其特征在于所述TaqMan探针为经过 荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
4.根据权利要求3所述的引物和TaqMan探针，其特征在于所述报告荧光基团为FAM， 荧光淬灭基团为Eclipse。
5.一种猴空泡病毒的实时荧光定量PCR检测方法，是以权利要求1所述的引物和 TaqMan探针进行的实时荧光定量PCR检测方法。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述20ul实时荧光定量PCR反应 体系包括上游引物Iul (IOuM)，下游引物Iul (IOuM)，TaqMan探针0. 5ul (IOuM)，样品DNA Iul (1 μ g/mL)，无 RNA Sl/jC 6. 5ul, Taqman Mix IOul。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述实时荧光定量PCR反应条件为 先50V 2min;然后95°C IOmin ；最后95°C 15s，60°C lmin，共40个循环，在每个循环的延 伸结束时进行荧光信号检测。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述检测方法还包括标准曲线的建 立，方法为用含有目的片段的质粒作为标准品，将其10倍系列稀释成①jXlCT1拷贝/ μ 1 ；②6Χ10_2 拷贝 / μ 1 ；③6X 10_3 拷贝 / μ 1 ；④6Χ10_4 拷贝 / μ 1 ；⑤6Χ10_5 拷贝 /μ 1。将质粒作为模板进行实时荧光定量PCR检测，得到用于猴空泡病毒检测的标准曲线。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于所述标准曲线的20ul实时荧光定量 PCR反应体系包括上游引物Iul (IOuM)，下游引物Iul (IOuM)，TaqMan探针0. 5ul (IOuM)， 质粒 DNA Iul (0. lmg/mL)，无 RNA 酶水 6. 5ul, Taqman Mix IOul ；实时荧光定量 PCR 反应条 件与权利要求7相同。
10.一种用于对猴空泡病毒进行实时荧光定量PCR检测的试剂盒，包括权利要求1所述 用于对猴空泡病毒进行实时荧光定量PCR检测的弓I物和TaqMan探针。
全文摘要
本发明公开了一种猴空泡病毒的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。所用引物和TaqMan探针是根据猴空泡病毒Large T基因的保守区域设计的，用以定量检测猴淋巴细胞或相关生物制品中的猴空泡病毒核酸拷贝数。所述检测方法是上述引物和TaqMan探针进行的实时荧光定量PCR检测方法。本发明能准确的检测出猴群SV40的感染情况及相关生物制品中SV40的残留状况，对控制实验猴群的质量具有重要意义，能够保证相关生物制品的质量，对于控制SV40传播和人民用药安全意义重大。本发明的检测方法及试剂盒可用于猴空泡病毒的诊断及生物制品的猴空泡病毒检定，应用前景广阔。
文档编号G01N21/64GK101962693SQ201010530058
公开日2011年2月2日 申请日期2010年10月29日 优先权日2010年10月29日
发明者贺争鸣, 邢进 申请人:中国药品生物制品检定所