专利名称：一种基于上转换发光十通道免疫层析的食源性致病菌检测试纸盘的制作方法
技术领域：
一种基于上转换发光十通道免疫层析的食源性致病菌检测
试纸盘
发明领域本实用新型涉及一种基于上转换发光十通道免疫层析的食源性致病菌检测试纸 盘，其可经一次加样即完成样品中十种食源性致病菌的定性定量检测。
背景技术：
食品安全已成为全球重要的公共卫生问题，食源性疾病是食品安全的主要问题， 世界卫生组织将食源性疾病定义为“凡是通过摄食进入人体的，使人体患感染性或中毒性 的疾病。”这里包括了由食品微生物污染和化学性物质引起的食源性疾病。而微生物引起 的食源性疾病是食品安全的主要问题。世界卫生组织2002年3月公布，全球每年因食源性 微生物污染引起的腹泻病例达到数十亿，死亡的0-15岁儿童约170万。在发达国家至少有 1/3的人患食源性疾病，在食源性疾病上花费达数十亿美元。近年来，在国外食源性疾病事 件频频发生，如英国的疯牛病，日本的出血性大肠埃希氏菌0157:H7和雪印牛奶的葡萄球 菌肠毒素中毒暴发，法国的李斯特氏菌中毒等。在我国尽管沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄 色葡萄球菌引起的食物中毒仍占主要位置，但近年来其它新的病原菌如出血性大肠埃希氏 菌0157:H7、单核细胞增生李斯特氏菌等引起的食物中毒报道呈上升趋势。1999年苏皖等 地引起的0157:H7大规模暴发流行，急性肾功能衰竭患者195人，死亡人数177人，病死率 为 90. 8%。快速高效的对水源、食品以及食品加工、贩售环境中的食源性致病菌进行检测与 监测是降低食源性疾病的关键环节。食源性致病菌检测与常规病原体检测的突出区别在于 食源性致病菌种类繁多，因而监测时无法针对性检测只能大范围筛查。如对人致病的沙门 氏菌就包括甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏 菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌等十数种，此外还有霍乱弧菌、大肠杆 菌、副溶血弧菌等等不一而足，而监测样品与环境中可能含有其中的任何一种或任何几种。 传统的单靶标检测技术，无论是核酸检测还是免疫检测，均需对一份样品重复多次操作，方 可完成多靶标的一一检测，这样不仅增加监测的繁冗费时费力，且极易出现人工错误、延长 检测时间、现场可操作性差。若一次加样即可实现多靶标的同步检测，则可在最大程度上预 防以及控制食源性疾病的发生。十通道免疫层析试纸盘是基于免疫层析技术的高通量检测方法，其利用试纸盘的 独特内部设计使得样品在各通道内试纸之间的均勻分配以及后续的同步层析得以实现，由 此将免疫层析的快速便捷与高通量得以融合(见附图1)。然而，传统免疫层析中所使用的 胶体金、染料等颜色示踪物则由于敏感性低、稳定性差、无法定量等缺陷限制了这一技术的 发展。上转换发光材料(Up-Converting Phosphor，UCP)的出现弥补了这一不足。UCP颗 粒是一种稀土金属的杂合晶体颗粒，其由于独特的化学组成以及物理结构，因而具有了自 然界中独一无二的上转换发光现象，即其可由低能的红外光激发发射高能的可见光。这一 上转换发光的特性使UCP颗粒作为免疫层析的示踪物可抵抗样品的荧光背景干扰，因而保证了检测的敏感性、稳定性与特异性。此外，以光学信号取代颜色变化作为结果的指征，使 得基于UCP颗粒的免疫层析可实现精确定量。若能将UCP颗粒与十通道免疫层析试纸盘相 结合则可实现高通量的现场快速定量检测。
实用新型内容为了克服上述缺陷，本实用新型公开了一种基于上转换发光十通道免疫层析的食 源性致病菌检测试纸盘，其可克服在先技术无法实现食源性致病菌的高通量现场检测以及 传统免疫层析技术敏感性低、稳定性差、不可定量的问题，将UCP颗粒作为示踪物与十通道 免疫层析试纸盘相结合，最终实现了高通量的现场快速定量检测。本实用新型的技术方案为—种基于上转换发光十通道免疫层析的食源性致病菌检测试纸盘，其结构组成包 括上盖[1]与底壳[2](如附图2所示)，底壳[2]中均勻放置有针对甲型副伤寒沙 门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增 李斯特菌、副溶血弧菌、大肠杆菌0157、霍乱弧菌01群和霍乱弧菌0139群十种食源性致病 菌的十种单靶标检测试纸[3]，每种单靶标检测试纸[3]针对一种食源性致病菌的特异性 检测；试纸盘内十种单靶标检测试纸[3]上放置有引流片W]，引流片[4]将上盖[1]的加 样孔[5]与十种单靶标检测试纸[3]的样品垫[6]相互连通；装配完整的试纸盘中，加样孔 [5]对应于引流片W]，结果扫描窗[7]对应于分析膜[8]，终点指示窗[9]对应于吸水垫 [10]。其中，单靶标检测试纸的结构组成为样品垫W]、结合垫[11]、分析膜[8]、吸水 垫[10]和粘性底衬[12]；其中，结合垫[11]中固定有UCP结合物[13] ；UCP结合物[13]由 作为示踪物的UCP颗粒[14]以及作为液相探针的某靶标特异性抗体A[15]结合而成；分析 膜[8]上设置有检测带T[16]与质控带C[17]；检测带T[16]为某靶标特异性抗体B[18]， 质控带C[17]为某靶标特异性抗体A的二抗[19]；样品垫[6]、结合垫[11]、分析膜[8]和 吸水垫[10]依次粘贴于粘性底衬[12]上，其中，分析膜[8]贴于粘性底衬[12]的中间， 吸水垫[10]贴于分析膜[8]的一侧，两者重合部分为吸水垫[10]长度的1/4-1/2 ；结合垫 [11]贴于分析膜[8]的另一侧，两者重合部分为结合垫[11]长度的1/12-1/5 ；样品垫[6] 贴于结合垫[11]的另一侧，两者重合部分为样品垫[6]长度的1/4-1/2。本实用新型食源性致病菌检测试纸盘的制备方法为A.结合垫[11]制备将针对甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型 副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌、大肠杆菌 0157、霍乱弧菌01群和霍乱弧菌0139群十种食源性致病菌的十种UCP结合物[13]分别制 备各自的结合垫，制备方法相同，均为将某种靶标的UCP结合物[13]用结合物稀释液稀释 至终浓度为ang/ml，结合物稀释液为pH= 7. 2 0. 03M PB含5% BSA、5%海藻糖、5%蔗糖 和0. 5% Tween20，将某种靶标的UCP结合物[13]加于可作为结合垫[11]的玻璃纤维、聚 酯膜或无纺布上，于40°C下池，烘干备用；B.分析膜[8]制备针对甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒 沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌、大肠杆菌0157、霍乱弧菌01群和霍乱弧菌0139群十种食源性致病菌分别制备各自的分析膜，制备方法相同， 均为将1.5mg/ml某靶标特异性抗体B [18]、1. 5mg/ml某靶标特异性抗体A的二抗[19]喷 点于可作为分析膜的硝酸纤维素膜或尼龙膜上分别作为检测带T[16]和质控带C[17]，于 37°C下60min，烘干备用；C.单靶标检测试纸[3]剪切成型针对甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏 菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌、大 肠杆菌0157、霍乱弧菌01群和霍乱弧菌0139群十种食源性致病菌分别制备各自的单靶标 检测试纸[3]，制备方法相同，均为将样品垫[6]、结合垫[11]、分析膜[8]和吸水垫[10] 依次粘贴于粘性底衬[12]上，确保相互之间的重叠关系(如附图3所示)；将单靶标检测 试纸[3]剪切为4mm宽的成品；D.试纸盘装配将与甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙 门氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌、大肠杆菌0157、霍乱 弧菌01群和霍乱弧菌0139群十种食源性致病菌对应的十种单靶标检测试纸[3]置于试纸 盘底壳[2]上，确保每种试纸位置序号固定可查，将引流片[4]置于十种单靶标检测试纸 [3]上并与样品垫[6]重叠，盖上上盖[1]即得本实用新型可对一份样品进行十种靶标检测 的成品试纸盘。使用食源性致病菌检测试纸盘检测食源性致病菌的方法为A.样品预处理水样、食品、粪便样品直接检测或用增菌液增菌4. 5h后再进行检 测；B.样品处理将1倍体积经过预处理的样品与1倍体积样品处理液混合，样品处 理液为 0. IM pH = 7. 2PB 含 0. 2M NaCl,0. 1% SDS,0. 3% NP40，0. 2% Tween20 的混合液；C.添加样品将处理后的液体样品滴加至本实用新型食源性致病菌检测试纸盘 的加样孔[5]中；D.层析反应静置15min待层析反应完成；E.结果判读(如附图4所示)用上转换发光生物传感器通过试纸盘上的结果扫 描窗[7]依次对每个通道中试纸的分析膜[8]上的检测带T[16]与质控带C[17]进行扫描 分析，每扫描完一个通道即旋转36度进行下一个通道的扫描；定性检测对某种靶标而言只有质控带C[17]有信号产生，则样品为某种靶标 [20]阴性(如附图5A所示)；若检测带T[16]与质控带C[17]均有信号产生，则样品为某 种靶标阳性[20](如附图5B所示)；若检测带T[16]与质控带C[17]均无信号产生，则层 析系统异常检测失败，需进行再次检测；某几种靶标检测均为阳性，则说明该样品中同时存 在某几种靶标；定量检测在某种靶标检测中将检测带T[16]、质控带C[17]的信号强度(即峰面 积)依次赋值于T、C，τ/c值即为检测值，经标准浓度菌液标定并绘制定量曲线后，通过任 意样品的检测值即可获得该样品中十种食源性致病菌的有无及具体浓度，从而实现定量检 测。本实用新型基于上转换发光十通道免疫层析的食源性致病菌检测试纸盘通过UCP 颗粒与十通道免疫层析试纸盘的结合使得一次加样即可实现十种靶标的检测，实现了高通 量的现场快速定量检测。而具有极强兼容性的样品处理液则保证了检测结果的特异性与敏感性。最终为食源性病原体的现场检测、监测提供了有效的技术手段，有助于食源性疾病的 预防与控制。
图1 十通道免疫层析试纸盘图2 食源性致病菌检测试纸盘结构图；图3 单靶标检测试纸粘贴示意图；图4 食源性致病菌检测试纸盘定性定量检测示意图；图5 食源性致病菌检测试纸盘定性检测示意图。1、上盖、2、底壳、3、单靶标检测试纸、4、引流片、5、加样孔、6、样品垫、7、结果扫描 窗、8、分析膜、9、终点指示窗、10、吸水垫、11、结合垫、12、粘性底衬、13、UCP结合物、14、UCP 颗粒、15、某靶标特异性抗体A、16、检测带T、17、质控带C、18、某靶标特异性抗体B、19、某 靶标特异性抗体A的二抗、20、靶标。a 液体流动方向，b 靶标1，c 靶标2，d 靶标3，e 传感器扫描方向，f 试纸盘旋 转方向，g 质控带1，h 检测带1，i 质控带2，j 检测带2，k 质控带3，1 检测带3，m 靶 标1定量曲线，η 靶标2定量曲线，ο 靶标3定量曲线，ρ 传感器扫描方向，q 某靶标阴性 样品层析与扫描状态，r 某靶标阳性样品层析与扫描状态，Xl 试纸检测信号，yl 试纸位 置，x2 被检物浓度，y2 传感器检测信号。
以下结合附图进一步说明本实用新型。
具体实施方式
实施例1 本实用新型食源性致病菌检测试纸盘的制备一种食源性致病菌检测试纸盘，其结构组成包括上盖[1]与底壳[2](如附图2所示)，底壳[2]中均勻放置有针对甲型副伤寒沙 门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增 李斯特菌、副溶血弧菌、大肠杆菌0157、霍乱弧菌01群和霍乱弧菌0139群十种食源性致病 菌的十种单靶标检测试纸[3]，每种单靶标检测试纸[3]针对一种食源性致病菌的特异性 检测；试纸盘内十种单靶标检测试纸[3]上放置有引流片W]，引流片[4]将上盖[1]的加 样孔[5]与十种单靶标检测试纸[3]的样品垫[6]相互连通；装配完整的试纸盘中，加样孔 [5]对应于引流片W]，结果扫描窗[7]对应于分析膜[8]，终点指示窗[9]对应于吸水垫 [10]。其中，单靶标检测试纸的结构组成为样品垫W]、结合垫[11]、分析膜[8]、吸水 垫[10]和粘性底衬[12]。结合垫[11]中固定有UCP结合物[13] ；UCP结合物[13]由作 为示踪物的UCP颗粒[14]以及作为液相探针的某靶标特异性抗体A[15]结合而成；分析膜 [8]上设置有检测带T[16]与质控带C[17]；检测带T[16]为某靶标特异性抗体Β[18]，质控 带C[17]为某靶标特异性抗体A的二抗[19]；样品垫[6]、结合垫[11]、分析膜[8]和吸水 垫[10]依次粘贴于粘性底衬[12]上，其中，分析膜[8]贴于粘性底衬[12]的中间，吸水垫 [10]贴于分析膜[8]的一侧，两者重合部分为吸水垫[10]长度的1/3 ；结合垫[11]贴于分 析膜[8]的另一侧，两者重合部分为结合垫[11]长度的1/8 ；样品垫[6]贴于结合垫[11]的另一侧，两者重合部分为样品垫[6]长度的1/3。本实用新型食源性致病菌检测试纸盘的制备方法为A.结合垫[11]制备将针对甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型 副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌、大肠杆菌 0157、霍乱弧菌01群和霍乱弧菌0139群十种食源性致病菌的十种UCP结合物[13]分别制 备各自的结合垫，制备方法相同，均为将某种靶标的UCP结合物[13]用结合物稀释液稀释 至终浓度为ang/ml，结合物稀释液为pH= 7. 2 0. 03M PB含5% BSA、5%海藻糖、5%蔗糖 和0. 5% Tween20，将某种靶标的UCP结合物[13]加于可作为结合垫[11]的玻璃纤维上， 于40°C下浊，烘干备用；B.分析膜[8]制备针对甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒 沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌、大肠杆菌0157、霍 乱弧菌01群和霍乱弧菌0139群十种食源性致病菌分别制备各自的分析膜，制备方法相同， 均为将1. 5mg/ml某靶标特异性抗体B[18]、1. 5mg/ml某靶标特异性抗体A的二抗[19] 喷点于可作为分析膜的硝酸纤维素膜上分别作为检测带T[16]和质控带C[17]，于37°C下 60min，烘干备用；C.单靶标检测试纸[3]剪切成型针对甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏 菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌、大 肠杆菌0157、霍乱弧菌01群和霍乱弧菌0139群十种食源性致病菌分别制备各自的单靶标 检测试纸[3]，制备方法相同，均为将样品垫[6]、结合垫[11]、分析膜[8]和吸水垫[10] 依次粘贴于粘性底衬[12]上，确保相互之间的重叠关系(如附图3所示)；将单靶标检测 试纸[3]剪切为4mm宽的成品；D.试纸盘装配将与甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙 门氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌、大肠杆菌0157、霍乱 弧菌01群和霍乱弧菌0139群十种食源性致病菌对应的十种单靶标检测试纸[3]置于试纸 盘底壳[2]上，确保每种试纸位置序号固定可查，将引流片[4]置于十种单靶标检测试纸 [3]上并与样品垫[6]重叠，盖上上盖[1]即得本实用新型可对一份样品进行十种靶标检测 的成品试纸盘。使用食源性致病菌检测试纸盘检测食源性致病菌的方法为A.样品预处理水样、食品、粪便样品直接检测或用增菌液增菌4. 5h后再进行检 测；B.样品处理将1倍体积经过预处理的样品与1倍体积样品处理液混合，样品处 理液为 0. IM pH = 7. 2PB 含 0. 2M NaCl,0. 1% SDS,0. 3% NP40，0. 2% Tween20 的混合液；C.添加样品将处理后的液体样品滴加至本实用新型食源性致病菌检测试纸盘 的加样孔[5]中；D.层析反应静置15min待层析反应完成；E.结果判读(如附图4所示)用上转换发光生物传感器通过试纸盘上的结果扫 描窗[7]依次对每个通道中试纸的分析膜[8]上的检测带T[16]与质控带C[17]进行扫 描分析，每扫描完一个通道即旋转36度进行下一个通道的扫描；定性检测对某种靶标而言只有质控带C[17]有信号产生，则样品为某种靶标[20]阴性(如附图5A所示)；若检测带T[16]与质控带C[17]均有信号产生，则样品为某 种靶标[20]阳性(如附图5B所示)；若检测带T[16]与质控带C[17]均无信号产生，则层 析系统异常检测失败，需进行再次检测；某几种靶标检测均为阳性，则说明该样品中同时存 在某几种靶标； 定量检测在某种靶标检测中将检测带T[16]、质控带C[17]的信号强度(即峰面 积)依次赋值于T、C，τ/c值即为检测值，经标准浓度菌液标定并绘制定量曲线后，通过任 意样品的检测值即可获得该样品中十种食源性致病菌的有无及具体浓度，从而实现定量检 测。
权利要求1.一种基于上转换发光十通道免疫层析的食源性致病菌检测试纸盘其特征在于该 试纸盘的结构组成为上盖[1]与底壳[2]，底壳[2]中均勻放置有十种单靶标检测试纸[3]；试纸盘内十种 单靶标检测试纸[3]上放置有引流片[4]，引流片[4]将上盖[1]的加样孔[5]与十种单 靶标检测试纸[3]的样品垫[6]相互连通；装配完整的试纸盘中，加样孔[5]对应于引流片 [4]，结果扫描窗[7]对应于分析膜[8]，终点指示窗[9]对应于吸水垫[10]。
2.如权利要求1所述的食源性致病菌检测试纸盘，其特征在于其中单靶标检测试纸 [3]的结构组成为样品垫[6]、结合垫[11]、分析膜[8]、吸水垫[10]和粘性底衬[12]。
3.如权利要求2所述的食源性致病菌检测试纸盘，其特征在于其中结合垫[11]中固定 有UCP结合物[13] ；UCP结合物[13]由作为示踪物的UCP颗粒[14]以及作为液相探针的 某靶标特异性抗体A[15]结合而成；分析膜[8]上设置有检测带T[16]与质控带C[17]；检 测带T[16]为某靶标特异性抗体Β[18]，质控带C[17]为某靶标特异性抗体A的二抗[19]； 样品垫[6]、结合垫[11]、分析膜[8]和吸水垫[10]依次粘贴于粘性底衬[12]上，其中，分 析膜[8]贴于粘性底衬[12]的中间，吸水垫[10]贴于分析膜[8]的一侧，两者重合部分为 吸水垫[10]长度的1/4-1/2 ；结合垫[11]贴于分析膜[8]的另一侧，两者重合部分为结合 垫[11]长度的1/12-1/5 ；样品垫[6]贴于结合垫[11]的另一侧，两者重合部分为样品垫 [6]长度的 1/4-1/2。
专利摘要本实用新型基于上转换发光十通道免疫层析的食源性致病菌检测试纸盘通过UCP颗粒与十通道免疫层析试纸盘的结合使得一次加样即可实现十种靶标的检测，实现了高通量的现场快速定量检测。而具有极强兼容性的样品处理液则保证了检测结果的特异性与敏感性。最终为食源性病原体的现场检测、监测提供了有效的技术手段，有助于食源性疾病的预防与控制。
文档编号G01N21/63GK201892678SQ201020297929
公开日2011年7月6日 申请日期2010年8月19日 优先权日2010年8月19日
发明者周蕾, 杨瑞馥, 王浩然, 郭兆彪 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所