专利名称：：上浓缩有机微对象以便进行显微成像的制作方法
技术领域：
：在第一方面中，本发明涉及一种分析包含有机微对象的样本流体的方法。在第二方面中，本发明涉及一种用于分析包含有机微对象的样本流体的装置或系统。
背景技术：
：本发明涉及微生物学领域，尤其是涉及流体样本的微生物分析。通常，这样的分析旨在确定样本中特定有机微对象的存在/不存在、量化它们的数量或浓度，并且在一些情况下在不同的细节水平识别未知的微生物。术语“有机微对象”可以指生物起源的各种各样的微观对象中的任何对象，尤其是微生物和细胞。微生物包括细菌，真菌，古细菌，原生生物，绿藻，诸如浮游生物、涡虫和阿米巴之类的动物。除了细菌之外，细胞包括植物细胞和哺乳动物细胞，例如血细胞和组织细胞。除了诸如唾液或其他体液的测试之类的临床诊断之外，微生物分析例如在食品和饮料、制药、个人护理产品和环保部门中具有重要的工业应用。当前的标准测试方法基于细胞培养并且得到结果需要数天至数周的时间，这取决于样本和微生物的类型。需要具有增加的通量(throughput)的微生物分析。这种快速方法的一个实例是AESChemunex(www.aeschemunex.com)提出的方法。它们的FDA批准的kanRDI系统提供了从样本到结果的90分钟的通量，并且通过过滤产品的激光扫描血细胞计数执行分析。该方法的步骤是过滤流体样本，利用荧光染料对可能存在的微生物污染物染色，利用大的激光斑(5-10Mffl)光学扫描过滤器的表面以便检测可能存在的微生物污染物，以及利用具有自动化镜台的高分辨率(0.5Mffl)显微镜对污^iIUMIlWISJllcj^ftOJ.-L.Drocourt,P.Desfetes,J.Sanghera,Apparatusandprocessforrapidandultrasensitivedetectionandcountingofmicroorganismsbyfluorescence,EP0713087Bl(1994)中描述了该技术。fluXXion(www.fluxxion.com)提供了一种改进的过滤技术。该技术基于光刻上定义的微筛，这些微筛具有单一良好定义的孔隙尺寸(低至0.2Mffl),是光学平坦的(这从后续光学扫描步骤的观点来看是有利的并且也导致降低的后向散射)且薄的，以便提供低流阻以及因而与从诸如纤维素、尼龙、聚氯乙烯、聚砜、聚碳酸酯和聚酯之类的多孔材料制成的常规膜过滤器相比提供更高的过滤通量。低分辨率成像(经由激光斑扫描)和高分辨率成像(利用显微镜)的两个步骤的可替换方案是以高分辨率对整个过滤区域成像。为了具有合理的过滤通量，事实证明，过滤区域比具有所需的分辨率的标准显微镜物镜的视场大得多。例如，0.5Mffl的分辨率典型地需要具有直径为0.5mm的视场的40X/NA0.65物镜。典型的过滤器具有数mm的直径，因此大约比显微镜物镜大一个数量级。显然，这要求扫描过滤区域，这是耗时的且需要具有高精度的复杂机械部分。在相关的上下文中，快速地检测病原体和测试抗生素耐药性/敏感性可能对于具有传染性疾病的患者的正确治疗是至关重要的。患者样本的经典培养技术典型地从采样到最终结果花费数天，并且必须在大型中心微生物实验室中进行。在该时间期间，患者通常不可能保持不被治疗而不遭受严重后果，这将执业医生限制到使用广泛的抗菌谱的猜谜游戏。这不仅在经济上是昂贵的，而且也增加医院环境中的抗抗生素细菌菌株问题。通过使用微流体设备上的自动化和集成的测试可以增进速度并且可以降低成本。通过减小微流体设备的尺寸以便实现小的试剂体积并且允许使用一次性使用的塑料盒可以进一步增进速度并且可以进一步降低成本。微流体系统通常包括可以将样本注入其中的流体系统。它可以进一步包含用于使细菌丰富并且用于将细菌与人类细胞分离的构件。人类细胞可以以这样的方式分开地检查，所述方式在不同情况下将干扰细菌分析。一些微流体设备适于针对病毒基因筛选哺乳动物细胞。这样的设备可能能够检测所有已知类型的微观病原体。微流体技术例如通过利用例如实时PCR考察基因表达谱或者通过在微流体设备中培养并且分析单细菌分裂而对于快速地诊断传染性疾病具有巨大的潜力。存在用于将细菌与人类细胞分离的各种不同的微流体技术。实例包括电泳(参见A.K.BalasubramanianjK.A.Sonijetal.,Amicrofluidicdeviceforcontinuouscaptureandconcentrationofmicroorganismsfrompotablewater,LabonaChip,vol.7，pp.1315-1321，2007)、介电泳(参见LJ.Yang,P.P.Banadajetal.，Amultifunctionalmicro-fluidicsystemfordielectrophoreticconcentrationcoupledwithimmuno-captureoflownumbersoflisteriamonocytogenes,LabonaChip,vol.6，pp.896-905，2006)和磁珠分离(参见Y.K.ChojJ.G.Leejetal.，One-steppathogenspecificDNAextractionfromwholebloodonacentrifugalmicrofluidicdevice,LabonaChip,vol.7，pp.565-573，2007)。然而，微流体设备通常具有非常有限的样本通量，典型地大约为数μ/min。出于这个原因，存在与例如来自口腔或鼻腔拭子的通常在例如Iml的液体中只包含100个或更少的相关细菌的真实患者样本，或者包含数ml液体(典型地为5-10ml)和仅仅一些自由浮动细菌的血液样本的严重失配。典型地，真实患者样本在l_5ml的样本液体中只包含总共10-100个相关细菌。因此，使用样本的仅仅一定份额不是一个选项。然而，ml体积通常不适合微流体设备。因此，需要宏观流体样本体积与微流体系统之间的连接。除了上述用于在μι体积内分离细菌和人类细胞的微流体技术之外，也存在在实验台上这样做的许多方式。一种简单的方法是使用来自例如SartoriusStedim(www.sartorius-stedim.com)、Whatman(www.whatman.com)或者Millipore(www.millipore.com)的注射器过滤器或离心过滤器。大孔隙尺寸捕获人类细胞，而更小的孔隙捕捉病原体。Wiegum禾口同事们(S.J.WuandC.I.Kado,PreparationofmilksamplesforPCRanalysisusingarapidfiltrationtechnique,JournalofAppliedMicrobiology,vol.96，pp.1342-1346,2004)将过滤器集成到PMMA盒中并且过滤出细胞，然后在膜上分析这些细胞。在这里，流速相当高，为250μ1/πη-750μ1/πη，但是在过滤膜上捕获的细胞未转移到另一个液体体积以供进一步分析。mi和Kado使用过滤器以使样本中的细菌DNA丰富(S.J.WuandC.I.Kado,PreparationofmilksamplesforPCRanalysisusingarapidfiltrationtechnique,JournalofAppliedMicrobiology,vol.96，pp.1342-1346，2004)。这些作者使用具有0.4Mffl孔隙尺寸的过滤器捕获来自牛奶样本的细菌。然后，利用裂解缓冲液处理具有细菌的膜，并且DNA随后用于PCR。该非常简单的技术具有大约每ml牛奶10菌落形成单位(CFU)的灵敏度。为了进行DNA分析，也存在来自SIRS-Lab(www.sirs-lab.com)的将细菌与人类DNA分离的特殊离心过滤器。然而，尽管在实验台上是高效的，但是上面的技术中没有一种直接连接到微流体芯片。其他的分析方法包括荧光激活细胞分类(FACS)或者磁激活细胞分类(MACS)，其中利用用于特定菌株的抗体对细菌加标签并且将其选出。FACS机器可以具有相当高的通量，但是是大而复杂的仪器并且需要利用抗体加特定标签。结合到例如硅胶磁珠的DNA或者加标签的细胞的磁性分离可以用来将病原体或病原体DNA转移到漏斗结构中的小得多的体积。然而，珠和样本的孵化仍然必须发生在大的体积内，这是耗时的。此外，结合到细胞或DNA的磁珠本身的转移在微流体系统中也可能是成问题的。本发明的目的是减少对最初包含在样本流体中的有机微对象成像所需的总时间。
发明内容依照本发明的第一方面，分析样本流体的方法包括步骤-通过在总时间T1内从微对象移除体积为V1的样本流体而上浓缩(up-concentrate)微对象；-将微对象浸没到转移流体中；或者让微对象留在样本流体的剩余部分中，样本流体的剩余部分于是提供转移流体；-在总时间T3内通过过滤器过滤体积为V3的转移流体，从而在该过滤器上积聚微对象；以及-产生在过滤器上积聚的微对象的图像；其中上浓缩步骤的通量V1Zt1大于过滤步骤的通量ν3/τ3。因此，上浓缩步骤与过滤步骤相比是快速的。本发明因而提出了一种双步骤方法，其中在过滤器上收集微对象之前使用快速技术从微对象移除样本流体的部分。当然，可以扩展该双步骤方法以包含附加的步骤。体积V1可以是样本流体的总体积或者其一定份额。类似地，体积V3可以是转移流体的总体积或者其一定份额。通量V1Zt1和通量ν3/τ3是平均通量，因为它们可以通过分别在时间T1和T3上对瞬时变化率进行平均而分别从与样本流体关联和与转移流体关联的瞬时通量(即从瞬时体积变化率)计算。对应的瞬时通量分别在上浓缩步骤和过滤步骤期间可以是但不一定必须是基本上恒定的。通量V1Zt1可以例如是通量V3/T3的超过3、10、30、100、300、1000或3000倍。浸没步骤花费的时间T2与上浓缩步骤相比可以忽略。例如，浸没步骤花费的时间T2可以小于上浓缩步骤花费的时间T3的10%、3%或者1%。因此，与其中通过经由过滤器过滤整个样本流体而从微对象移除基本上所有样本流体的常规方法相比，该过程的总时间可以减少。等价地说，所述过滤器与常规方法中使用的过滤器相比可以具有更低的通量，该更低的通量由需要流经过滤器的更小的样本流体量补偿。给定相同的时间量，所述过滤器因而可以例如更小，以便适合光学显微镜的视场，避免扫描过滤器的需要并且因而进一步减少总的时间量。转移流体可以具有样本流体初始体积的小于20%、小于10%、小于5%或者小于1%的体积。在移除步骤中，可以从微对象移除大于70%、大于90%、大于95%或者大于99%的样本流体。因此，在过滤步骤之前，相当程度地增大了微对象的浓度。上浓缩、浸没、过滤和产生图像的步骤花费的时间！^+!^+!^+!^可以短于由过滤器过滤整个样本流体并且对该过滤器上的微对象成像花费的时间。在这里，应当理解的是，使用了相同的成像方法。由过滤器过滤的转移流体的体积V3可以远小于从微对象移除的体积％。例如，V3可以小于以下之一0.3*V1,0.1*VijO.03*VijO.01*VijO.003*V1和0.001*V10因此，可以相当地减少所述方法的总时间I\+T2+T3+T4。事实上，快速的上浓缩步骤中移除的样本流体的份额越大，则可以预期所述过程的总时间越短。所述方法可以包括步骤-通过预过滤器预过滤样本流体，该预过滤器至多滞留(retain)微对象的不显著的份额；该预过滤步骤在过滤步骤之前执行。因此，可以事先过滤掉大于感兴趣微对象(例如细菌)的对象(例如哺乳动物细胞)，从而有利于后续的分析。所述过滤器可以是第二过滤器，并且上浓缩步骤可以涉及-通过第一过滤器过滤样本流体，从而在第一过滤器上积聚微对象。依照该实施例，上浓缩步骤也通过过滤执行。尽管第二过滤器可以特别地适于过滤小的体积，但是第一过滤器可以特别地适于过滤大的体积。例如，第一过滤器可以大于第■~过滤器ο所述方法可以进一步包括-溶解第一过滤器。一旦第一过滤器被溶解，微对象可以更容易地转移到第二过滤器。第一过滤器可以由例如转移流体溶解。浸没步骤可以涉及-转移流体沿着第一过滤器流动；或者-样本流体的部分回流通过第一过滤器。在后一种情况下，即在样本流体的部分回流通过第一过滤器的情况下，转移流体由样本流体提供。在这两种情况下，转移流体本身将携带微对象。然后，可以将转移流体引导到第二过滤器。上浓缩步骤可以涉及-蒸发体积为V1的样本流体；和/或-将微对象吸引到收集区；和/或-离心分离(centrifugalize)样本流体。因此，提供了浓缩微对象的可替换方式。产生图像可以涉及-产生微对象的光学图像；或者-扫描微对象。这可以通过本领域中已知的任何方法完成，使用例如上面描述的AESChemimex的方法。所述方法可以进一步包括-将染料释放到样本流体或者释放到转移流体。因此，可以在上浓缩过程之前、期间或者之后对微对象染色。特别是在要溶解第一过滤器的情况下，可以将染料嵌入到第一过滤器中。可替换地，染料可以包含于第一过滤器的涂层中。可替换地，它可以包含于预过滤器(如果存在的话)中或者包含于第二过滤器中，或者它可以以其他方式释放。所述方法可以进一步包括-将用于使染料失活的失活剂释放到样本流体或者释放到转移流体。失活剂可以嵌入到第一过滤器中或嵌入到第二过滤器中，或者可以以其他方式释放。依照本发明第二方面的装置或系统包括-用于通过在总时间T1内从微对象移除体积为V1的样本流体而上浓缩微对象的构件；-用于将微对象浸没到转移流体中，或者用于让微对象留在样本流体的剩余部分中的构件，样本流体的剩余部分于是提供转移流体；-用于在总时间T3内通过过滤器过滤体积为V3的转移流体，从而在该过滤器上积聚微对象的构件；以及-用于产生在过滤器上积聚的微对象的图像的构件；其中用于上浓缩的构件的通量V1Zt1大于过滤器的通量ν3/τ3。因此，可以减少总的测定(assay)时间。所述系统或装置可以包括用于产生过滤器上积聚的微对象的光学图像的光学显微镜。所述过滤器可以是第二过滤器，并且用于上浓缩的构件可以包括用于滞留微对象的第一过滤器，第一过滤器具有比第二过滤器更大的面积。在本文中，术语“面积”具有本领域中赋予它的通常含义，即它指的是过滤器表面的暴露于进入该过滤器的流体的部分。过滤器表面的预期不暴露于流入流体的部分不对过滤器的面积产生贡献。例如，第一过滤器的面积可以是第二过滤器的面积的超过3、10、30、100、300、1000、3000或10000倍。因此，第一过滤器可以具有比第二过滤器大得多的最大可能通量。第一过滤器和第二过滤器可以具有相同的孔隙尺寸和/或相同的孔隙结构，例如相同的孔隙几何结构。例如，第一过滤器和第二过滤器可以由相同种类的材料制成。第一过滤器和第二过滤器可以是基本上仅在其面积方面不同的膜过滤器，第一过滤器具有比第二过滤器更大的面积。第一过滤器和第二过滤器可以是仅在其直径方面不同的圆形膜过滤器，第一过滤器具有比第二过滤器更大的直径。所述过滤器可以是第二过滤器，并且用于上浓缩的构件可以包括用于滞留微对象的第一过滤器，第一过滤器具有比第二过滤器更高的最大通量。例如，第一过滤器可以具有比第二过滤器更大的有效过滤面积。可替换地或者此外，用于上浓缩的构件可以例如包括用于离心分离样本流体的离心分离机，或者用于至少蒸发样本流体的相当部分的蒸发器，或者用于将微对象吸引到收集区的吸引器。第一过滤器可以包括用于对微对象染色的染料。该染料可以包含于过滤器的涂层中。当将该过滤器暴露于要分析的液体时，染料将被释放到该液体中。在可溶解过滤器的情况下，染料可以嵌入到该过滤器中。它将在过滤器溶解时释放。此外，染料可以包含于可溶解过滤器的涂层中，并且该过滤器可以包含用于使嵌入到过滤器中的染料失活的物质。第一过滤器可以包括可在有机溶剂中溶解的有机聚合物或者穿孔铝箔。因此，可以在微对象在第一过滤器上积聚之后溶解第一过滤器。所述系统或装置可以包括包含所述过滤器的微流体芯片。该微流体芯片可以具有可以通过其对微对象成像的光学窗口。它可以进一步适于对微对象执行其他测定，例如化学测定。图1示意性地示出了使用第一过滤器和注射器积聚微对象。图2示意性地示出了使用蒸发积聚微对象。图3示意性地示出了通过朝表面吸引微对象而积聚微对象。图4示意性地示出了用于对第二过滤器上的微对象成像的设置。图5为分析包含有机微对象的样本流体的方法的流程图。图6示意性地示出了一个用于浓缩微对象并且用于将它们转移到另一个设备的直ο图7示意性地示出了另一个用于浓缩微对象并且用于将它们转移到另一个设备的装置。图8示意性地示出了另一个用于浓缩微对象并且用于将它们转移到另一个设备的装置。图9示意性地示出了另一个用于浓缩微对象并且用于将它们转移到另一个设备的装置。图10示意性地示出了另一个用于浓缩微对象并且用于将它们转移到另一个设备的装置。图11示意性地示出了另一个用于浓缩微对象并且用于将它们转移到另一个设备的装置。图12示出了细菌的实验确定的数量和浓度。图13示出了利用不同的过滤器收集的DNA的量。图14示意性地示出了用于分离细菌和人类细胞的方法。图15示出了过滤过程期间不同阶段的金黄色葡萄球菌细菌的菌落(colony)形成单位(CFU)的数量。图16示出了过滤过程期间不同阶段的金黄色葡萄球菌细菌的菌落形成单位(CFU)的数量。具体实施例方式除非另有规定，不同附图中出现的相同或相似的附图标记指的是相同或相似的部件。依照本发明的一个优选的实施例，一种用于快速的微生物分析的方法包括用于制备样本、用于上浓缩、用于利用(荧光)染料对微生物染色、用于显微成像以及用于图像分析的步骤，其中用于上浓缩的步骤包括第一步骤，其用于利用大面积过滤器进行过滤；以及第二步骤，其用于将滤渣(包括可能存在的微生物)收集到小面积上，使得该小面积匹配具有所需的分辨率的用于显微成像的显微镜物镜的视场，所述物镜例如具有0.5mm的视场并且允许以0.5Mm分辨率成像的40X/NA0.65物镜。该方法允许利用单次捕获(曝光)进行显微成像并且因而避免了扫描，同时由于利用大面积过滤器(过滤时间与过滤面积成反比)的第一过滤步骤的原因，总体通量为高。换言之，大体积的样本流体由于第一过滤器的大表面面积的原因而被快速过滤，并且其后第二过滤也是快速的，而不管第二过滤器的面积为小，因为样本的体积在第一过滤步骤中减小了(上浓缩)。在第一实施例中，大面积过滤器由可溶解材料制成，并且在第二步骤中，溶剂用于溶解不影响细菌的过滤器。更精确地说，大面积过滤器由不可在要检查的流体(通常为基于水的)中溶解、但是可在其他溶剂中溶解的材料制成。优选地，该材料不影响(染色的)细菌。一个实例可以是穿孔铝箔。该箔不在水中溶解，但是会在醋(稀释的醋酸)中溶解。醋不溶解细菌。其他实例可以是由受有机溶剂影响的有机聚合物制成的过滤器，所述有机聚合物例如当接触到有机溶剂时分解的有机聚合物。在第一步骤中，流体样本在大面积过滤器上过滤，并且在第二步骤中，包括细菌的过滤器在第二流体中溶解。得到的液体样本体积比原始样本小并且因而可以在相对较短的时间跨度内利用不可溶解在第二流体中的小面积过滤器(例如陶瓷过滤器)过滤。在第二实施例中，在第一过滤步骤之后反转泵浦方向，并且将流体的小部分和所有滞留的微生物定向到小面积过滤器。在第三实施例中，在第一过滤步骤之后引发侧流，从而将滤渣收集到过滤器的子区域上。在所有这些实施例中，可以在过滤期间将染料(尤其是荧光染料)添加到流体，使得微生物在过滤步骤期间被染色。这样做的一个优选的实施例是将染料包含于所述过滤器中的至少一个中。这样做存在若干方法(a)将染料作为涂层添加到过滤器。当把过滤器暴露于要分析的液体时，该染料被释放到液体中。(b)在可溶解过滤器(实施例1)的情况下，可以将染料嵌入到该过滤器中。因此，它在该过滤器溶解时释放。(C)像在(a)中一样将染料作为涂层而添加，并且像在(b)中一样添加使嵌入到可溶解过滤器中的染料失活的物质。一个优点是，当过滤器溶解时，染料(除了细菌吸收的染料之外)变得失活，从而没有在第一过滤步骤之后到达的细菌污染物将被染色。这允许非无菌第二过滤通过。图1中所示的是一种用于浓缩包含在样本流体10中的有机微对象12的设备20。宏观体积的样本流体10包含在设备20的腔室中，如图Ia中所示。通过朝第一过滤器16推进注射器活塞14，样本流体10或者至少其相当部分(例如至少50%或至少80%或至少90%)被强迫通过过滤器16。微对象12由第一过滤器16滞留并且在第一过滤器16的表面18上积聚(参见图lb)。因此，从微对象12移除了至少50%或至少80%或至少90%或至少99%的样本流体10。应当指出的是，样本流体10可以包含图中未示出的可以穿过过滤器16的更小的微对象。在后续的步骤(未示出)中，将微对象12浸没到具有比样本流体10更小的体积的转移流体中。然后，通过第二过滤器32(图4中表示)过滤转移流体以便在第二过滤器32的表面34上积聚微对象12。转移流体可以由流经第一过滤器16的样本流体10部分或者由另一流体或者由样本流体10和另一流体的混合物提供。在第二过滤器32上积聚微对象12(参见图4)之后，它们可以通过任何适当的方法(例如通过扫描显微技术)检测或成像。第一过滤器16可以被设计成使得从微对象上浓缩超过一半的样本流体10的步骤比第二过滤器32过滤转移流体的步骤花费更少的时间。这可以例如通过将第一过滤器16选择得足够大来实现。现在参照图2，示出了在其中样本流体10为液体的情况下从微对象12移除样本流体10的全部或相当部分的可替换方法。设备20包括具有侧壁22和底板M的盆状物。包含微对象12的样本液体10被引入到该盆状物20中，如图加中所示。样本液体10具有形成样本液体10与空气或真空或另一气体之间的界面的表面沈。在表面沈(蒸发表面)处，样本液体10蒸发。可以加热样本液体沈以便加速蒸发过程。可替换地或者此外，可以加热在蒸发表面沈处接触样本液体10的空气/气体，或者可以产生沿着蒸发表面沈的热空气/气体流。随着样本液体26的蒸发，微对象12在盆状物20的底板M上积聚，如图2b中所示。在已经在上面参照图1描述的后续步骤中，将微对象12转移到图4中所示的第二过滤器32并且对其成像。同样地，与由第二过滤器32过滤整个样本液体10相比，所提出的方法可以需要更小的时间总量。图3示出了在其中样本流体10为液体的情况下从微对象12移除样本流体10的全部或相当部分的另一种方法。样本液体10包含在具有透明底板M的盆状物中。光源观设置在底板M之下以便经由底板M将光发射到盆状物中，如图3a中所示。光将光敏微生物12吸引到底板M，如图北中所示，这些微生物在那里积聚。可替换地，代替使用光源的是，可以跨样本液体10施加电场以便将带电微对象(例如带负电的细菌)吸引到底板24。在图3c中所示的后续步骤中，样本流体10通过宏观流体出口30释放，微对象在后面留在底板M上。在已经在上面参照图1描述的后续步骤中，将微对象12转移到图4中所示的第二过滤器32并且对其成像。同样地，与由第二过滤器32过滤整个样本液体10相比，所提出的方法可以需要更小的时间总量。图4中所示的是一种用于对在第二过滤器32的表面34上积聚的微对象12成像的示例性成像系统的简化表示。整个第二过滤器32适合显微镜物镜36的视场，该显微镜物镜在图中示为单个透镜，但是通常包括透镜系统。显微镜物镜36在图像传感器38上产生微对象12的光学图像。图像传感器38可以例如包括电荷耦合器件(CXD)。图像传感器38耦合到信息处理设备(未示出)，该信息处理设备例如个人计算机，用于处理由图像传感器38输送的输出信号。图5为分析包含有机微对象的样本流体的方法的流程图。该方法包括连续的步骤-通过在总时间T1内从微对象12移除体积为V1的样本流体10而上浓缩(Si)微对象；-将微对象浸没(S2)到转移流体中；或者让微对象留在样本流体的剩余部分中，样本流体的剩余部分于是提供转移流体；-在总时间T3内通过过滤器32过滤(S3)体积为V3的转移流体，从而在该过滤器上积聚微对象；以及-产生(S4)在第二过滤器上积聚的微对象的图像。在该方法中，上浓缩步骤Sl的通量V1Zt1大于过滤步骤S3的通量V3/T3。上浓缩Si、浸没S2、过滤S3和产生图像S4的步骤花费的时间分别为1\、T2,T3和T4。应当指出的是，上浓缩Si、浸没S2、过滤S3和产生图像S4的步骤花费的总时间Ι\+Τ2+Τ3+Τ4可以远远短于通过过滤器32过滤整个样本流体10并且对该过滤器32上的微对象12成像花费的总时间T3，+T4'。现在参照图6-11，这些图示出了用于将宏观(ml)样本体积减小至可以进一步转移到微流体系统中，同时仍然包含病原体的初始量的微观体积(μι)的设备的不同设计。随着样本体积的减小，病原体的浓度大大增加。预过滤器可以被设置用于在样本进入微流体芯片之前分离出人类细胞，以便有利于下游的分析过程并且从细菌和哺乳动物分析获得最大数量的相关数据。特别地，预过滤器可以增大后续片上(on-chip)分析的灵敏度。此外，提出了将宏观物理过滤器或者不同孔隙尺寸的膜与微流体系统组合。特别地，提出了将一个或多个宏观流体过滤器与微流体系统组合，以便从大体积收获细菌、真菌或酵母并且在微流体体积内洗提(elute)，从而使上述病原体的浓度丰富并且减小样本体积以便进一步处理。优选地，本发明包括至少两个过滤器，其中第一过滤器具有更大的孔隙尺寸以便过滤出例如下游分析不需要的人类细胞，同时让感兴趣细菌通过，并且第二过滤器具有比感兴趣细菌的尺寸更小的孔隙尺寸。现在参照图6，示出了一种用于通过从有机微对象移除最大部分的包含有机微对象的样本流体而减小该流体的体积的宏观到微流体过滤设备20。设备20包括注射器锁或盖板46、注射器活塞14、入口58、预过滤器40(上面的过滤器)、第一环48、第一过滤器16(下面的过滤器)、第二环50、出口30、底板或插塞52、微流体入口42和微流体出口44。微流体出口44连接到预过滤器40下游和下面的过滤器16上游的空间。微流体入口42连接到下面的过滤器16下游的空间。设备20如下操作。具有0.Iml-IOml量级的体积的样本流体经由入口58引入到预过滤器40上游的空间。然后，将活塞14向下推进，迫使样本流体流经预过滤器40并且然后通过下面的过滤器16。预过滤器40分离出例如大的哺乳动物细胞。下面的过滤器16捕获例如细菌。下面的过滤器16具有一直延伸通过它的孔隙。因此，例如细菌不会像例如膜基质的情况可能的那样被卡住。下面的过滤器16可以例如为例如fIuXXion制造的硅膜过滤器或者聚碳酸酯(“核孔”)过滤器。在后续的第二步骤中，将插塞52插入到第二环50中以关闭宏观流体出口30。同时，通过微流体入口42、沿着下面的过滤器16并且通过微流体出口44的微流体通道打开。然后，在例如由活塞(未示出)强迫通过微流体通道的转移液体的微流体体积(例如ΙΟΟμΙ)内洗提下面的过滤器16上的细菌。可以洗提全部细菌以供进一步处理，或者仅仅DNA可以利用转移液体转移。在后一种情况下，转移液体(洗提缓冲液)也可以是裂解缓冲液，或者裂解可以通过某种其他的机制发生，例如在Whatman洗提裂解纸上使用加热或超声而发生。微流体和宏观流体通道可以经由例如(机械地、用热方法地或者以其他方式激活的)阀门，或者如图中所示通过移除或插入插塞52打开和关闭。图7a为与上面参照图6所述类似的设备20的示意性表示。具有大约l_5ml的体积的液体样本10借助于注射器(未示出)推送通过设备20并且流经包括预过滤器40(上面的过滤器)和第一过滤器16(下面的过滤器)的宏观通路58、40、16、30。在关闭宏观通路之后，将卡在下面的过滤器16上的病原体浸没到转移液体(洗提缓冲液)中，该转移液体经由微流体入口42流入设备20，沿着下面的过滤器16流动，并且经由微流体出口44流出设备20。在所示的实例中，盖板46(在图7b中鲜明地示出)、上面的环48(在图7c中鲜明地示出)和下面的环50(在图7d中鲜明地示出)借助于双面胶带实现。在这种情况下，宏观流体通路的末端可以在宏观流体液体(即流体样本)被泵浦通过之后通过将带粘附到固体衬底而关闭。此外，可以每带集成超过一个流体连接。可替换地，包含预过滤器40和第一过滤器16并且提供外壳的设备20部分可以由例如塑料制成。依照图8中表示的另一个实施例，转移流体由穿过第一过滤器16的样本液体10部分提供。在第一过滤器16上积聚微对象之后，强迫所述样本液体10部分(即转移流体)回流通过第一过滤器16(在图中向上的方向上)。这通过压缩包含例如水、空气或油的腔室54(参见图8b)实现。从而，将先前在第一过滤器16上积聚的微对象浸没到转移流体中。转移流体的体积比最初引入到设备20中的样本液体10的体积小大约一个数量级。因此，经由微流体出口44离开设备20的转移流体具有更高浓度的微对象。可以在下游，例如在连接到微流体出口44的微流体芯片中进一步处理转移流体。可以在可压缩腔室M与第一过滤器16上积聚微对象的空间之间设置阀门(图中未示出)。阀门和可压缩腔室二者可以利用例如温度进行控制。在图9中以简化的方式示出的该方案的一个不同版本中，经由DC或AC(介电泳)电场将在第一过滤器16上面或之中捕获的诸如细菌或DNA之类的带电或偶极微对象从第一过滤器16转移到小腔室56。应当指出的是，细菌通常携带负电荷。电场可以通过在第一过滤器16与腔室56之间施加电压而产生。在所示的实例中，将第一过滤器16设置为零电位(GND)，而将腔室设置为正电位(V)。腔室56可以连接到微流体芯片。第一过滤器16可以包括凝胶材料，例如多孔凝胶。从而，可以有利于微对象(例如细菌或DNA)在沿着或通过第一过滤器16的横向(图中的水平)方向上的运动。图10中示意性表示的是依照另一个实施例的设备20。设备20的工作原理与上面参照图9所述的类似之处在于，微对象12在穿过预过滤器40(上面的过滤器)之后转移到小腔室56。然而，依照当前实施例，第一过滤器16不存在。电场将微对象(例如细菌)与样本流体10的主流(在图中向下的方向上)分离并且将它们转移到腔室56中。可以提供小凝胶插塞以便防止宏观流(即样本流体10流)扩散进入腔室56中。图11示出了又一个实施例。第一过滤器16(例如膜)由在酸性(高pH)或热(高温)环境值中分解的凝胶或过滤材料制成。在高PH下溶解的凝胶的实例是聚阴离子，例如(聚)丙炼酸禾口(聚)甲基丙炼酸(Y.QiuandK.Park,Environment-sensitivehydrogelsfordrugdelivery,AdvancedDrugDeliveryReviews,vol.53,pp.321-339，2001)。温度敏感凝胶包括(聚)环氧乙烷和(聚)环氧丙烷的共聚物(参见引用的Qiu和Park的论文)。在图Ila所示的第一步骤中，沿着包括入口58、预过滤器40、第一过滤器16和宏观流体出口30的宏观通道58、40、16、30推进或抽吸宏观体积的样本流体10通过设备20。同时，微流体出口44例如借助于阀门(未示出)而保持关闭。在第二步骤中，经由入口58将小体积的NaOH引入设备中。NaOH本身或者与热组合增大pH并且从而分解第一过滤器16。此外，NaOH可以裂解例如在第一过滤器16上积聚的微对象(例如细菌)以便释放DNA。在图lib所示的第三步骤中，微流体出口44借助于提到的阀门或者借助于另一个阀门(未示出)打开。通过暂时阻挡宏观流体出口30和微流体出口44，可以提供一定的孵化时间。在下文中，描述其中从宏观流体样本制备微流体样本的实验。使用预过滤器和第一过滤器分离人类细胞和细菌在夜间在脑心浸液中培养大肠杆菌(埃布氏菌)并且利用BacLight活/死染剂对其染色。利用荧光标记对THP-I细胞染色。在这种情况下，在离心分离步骤中将细胞生长培养基(medium)换成PBS。在PBS中将500μ1的细菌悬液与500μ1的人类THP-I细胞混合。该Iml的细胞+细菌液体首先通过Whatman5Mm孔隙尺寸聚碳酸酯过滤器过滤。使用2ml的空气以便从过滤器移除该液体。使用荧光显微镜分析滤出的悬浮液和过滤器。然后，通过0.22微孔过滤器第二次过滤500μ1的滤液悬浮液。利用切物镜，只检测到单核细胞，而埃布氏菌利用20χ清晰可见。如预期的那样，在这些样本中细菌的浓度远高于THP-I细胞的浓度(近似109对106细胞/ml)。埃布氏菌太多而无法计数，但是单核细胞在切放大率下平均为沈士4细胞/帧(3帧)。来自5x物镜和20x物镜的帧示出通过5Mm聚碳酸酯过滤器(预过滤器)过滤之后的悬浮液。预过滤器移除了大多数或者全部单核细胞并且允许细菌通过。然而，Whatman过滤器固定器(holder)中的死体积相当大，并且因而大约一半的样本在那里损失掉。利用切物镜，单核细胞的数量在所有帧(4帧)中为0。根据电镀实验，可见当通过5Mm过滤器过滤低浓度的细菌(<500CFU/ml)时，大致100%的细菌通过，这表明很少的(如果有的话)细菌附着到聚碳酸酯过滤器。在最终通过0.22Mm过滤器过滤之后，样本液体中不再发现细胞。通过在实验台上洗提0.22Mffl过滤器上浓缩细菌在下一个步骤中，我们也做了这样的实验，其中在0.22ΜΠ1过滤器上捕获的细菌随后在更小的体积内洗提以便增大浓度。进行了三个这样的实验，它们具有非常相似的结果。在埃布氏菌的情况下，通过0.22Mm过滤器过滤500μ1的细菌悬浮液。然后，将该过滤器置于50μ1的PBS缓冲液中并且涡旋(vortex)。在5分钟之后，移除过滤器并且培养悬浮液。开始的悬浮液包含200CFU/ml(500μ1中100CFU)，并且来自过滤器的洗提包含1000CFU/ml(50μ1中50CFU)，意味着切的上浓缩。此外，以相同的方式过滤和洗提金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌)(在更小的体积内涡旋+等待5分钟)。在这些实验中，通过0.22Mm过滤器过滤分别具有160和98CFU/ml的Iml悬浮液。细菌然后在100μ1的TBS生长培养基中洗提和培养。100μ1培养基中的金黄色葡萄球菌的数量在这种情况下分别为84(“840CFU/ml”)和78(“780CFU/ml”)。这些实验之后的最终浓度是起始浓度的525%和795%。在所有上面的实验中，滤液(通过过滤器的溶液)也培养作为对照(control)，并且得到0个菌落。图12中概括了这些结果。实验台上的NaOH裂解和洗提在与上面所述类似的实验中，具有来自包含98CFU/ml的Iml细菌悬浮液的捕获的金黄色葡萄球菌的过滤器置于100μ1的NaOH中，涡旋并且孵化5分钟。其后，移除过滤器并且利用乙醇沉淀提取NaOH中的DNA。图13概括了相应的qPCR结果。0.22Mm过滤器上捕获的细菌同时利用NaOH裂解和洗提。由SA过滤器-样本可见，相当数量的金黄色葡萄球菌的DNA被洗提。当以仅仅每ml98个细菌开始时，相当数量(接近0.Olng参考)的金黄色葡萄球菌的DNA从应当捕获细菌的两个过滤器(“SA过滤器NaOH25C”和“SA过滤器NaOH95C”)恢复。除了一个过滤器与仅仅TSB培养基(“TSB过滤器25C”)一起使用外，所有的阴性对照和滤液表现出很少或者没有DNA含量。上浓缩细菌和与人类细胞分离图14示出了用于分离细菌和人类细胞，之后跟随第二过滤器上的富集的实验方案。在两个过滤器(5Mm和0.22Mm)的相应过滤实验中，输入液体为10000U937人类细胞/ml和22金黄色葡萄球菌/ml的混合溶液。2ml的混合样本溶液通过5Mm过滤器过滤。Iml的该滤液随后通过0.22Mffl过滤器过滤。细菌在100μ1培养基中从这两个过滤器洗提5分钟。来自过滤序列的所有阶段的样本通过培养进行分析。实验结果示于图15和图16中。由于使用的过滤器固定器的“死体积”的原因，不是所有的通过第一过滤器的液体可以经过第二过滤器。然而，几乎没有细菌在第一过滤器上损失掉，并且来自第二过滤器的洗提与输入样本相比具有浓度高得多的金黄色葡萄球菌。总之，上面的实验证明，过滤器的组合可以用来将细菌与人类细胞分离并且通过减小样本体积而增大细菌的浓度。图15示出了过滤过程的每个阶段的金黄色葡萄球菌的绝对数量。应当指出的是，只有一半来自过滤器ι的滤液用作过滤器2的输入液体。οομ的该滤液为了分析而被培养，但是Iml通过过滤器2而被过滤。在过滤器2的滤液中不能检测到细菌。图16示出了过滤过程的每个阶段的金黄色葡萄球菌的浓度。“通过过滤器1”中的浓度应当等于或小于输入浓度。略有高估的值归因于根据仅仅ΙΟΟμΙ(在该情况下平均包含3个细菌)的分析计算浓度。在过滤器2的滤液中不能检测到细菌。总而言之，提出了用于从ml到μ减小初始样本体积而不显著损失用于进一步分析的细菌数量的特定技术。尤其是在低浓度的细菌使得以“大”体积的样本液体开始成为必要的时候，这样获得的ml体积可以使用微流体片上实验室系统进一步加以分析，或者可以由光学显微镜在单次捕获中成像。本发明可以在用于工业应用(食品加工、制药、个人护理产品、饮料、环境和工业加工部门)以及用于临床应用的快速微生物分析中得到应用。所提出的方法可以特别地非常适合检测和列举微生物。此外，特定染剂的使用(例如免疫标记)可以提供选择性检测和识别的路线。本发明的一个特定应用可以是造成传染性疾病的细菌的片上检测以及筛选抗生素敏感性。其他的应用是例如食品和水质测试以及哺乳动物细胞中的病毒检测。本发明是在研究项目“Xyall:Digitalcellimagingforlifesciencesandpathology”的框架内提出的，并且涉及保健孵化器中的快速微生物投资(venture)。尽管在所述附图和前面的描述中已经详细地图示和描述了本发明，但是所述附图和描述应当被认为是示例性的而不是限制性的。本发明并不限于所公开的实施例。在不脱离本发明范围的情况下也可以实现上面未描述的等效物、组合和修改。动词“包括”及其派生词并没有排除在“包括”所指的内容中存在其他的步骤或元件。不定冠词“一”并没有排除多个该冠词所指的对象。特别地，术语“微对象”并没有排除存在其他的微对象。例如，除了权利要求1中涉及的微对象之外，样本流体10也可以包括未转移到第二过滤器32或者在所述过程中损失的微对象。也应当指出的是，单个单元可以提供权利要求中提到的若干构件的功能。在相互不同的从属权利要求中陈述特定特征这一事实并不意味着这些特征的组合不可以加以利用。权利要求书中的任何附图标记都不应当被视为对范围的限制。权利要求1.一种分析包含有机微对象(12)的样本流体(10)的方法，该方法包括步骤-通过在总时间T1内从微对象移除体积为V1的样本流体(10)而上浓缩(Si)微对象；-将微对象浸没(S2)到转移流体中；或者让微对象留在样本流体的剩余部分中，样本流体的剩余部分于是提供转移流体；-在总时间T3内通过过滤器(32)过滤(S3)体积为V3的转移流体，从而在该过滤器上积聚微对象；以及-产生(S4)在过滤器上积聚的微对象的图像；其中上浓缩步骤(Si)的通量VZT1大于过滤步骤(S3)的通量V3/T3。2.依照权利要求1的方法，其中上浓缩步骤使用第一过滤器(16)执行，并且过滤步骤使用第二过滤器(32)执行，第一过滤器具有比第二过滤器更大的面积。3.如权利要求1所述的方法，其中上浓缩(Si)、浸没(S2)、过滤(S3)和产生图像(S4)的步骤花费的时间短于通过过滤器(32)过滤整个样本流体(10)并且对该过滤器(32)上的微对象(12)成像花费的时间。4.如权利要求1所述的方法，其中V3小于0.2*V105.如权利要求1所述的方法，包括步骤-通过预过滤器(40)预过滤样本流体(10)，该预过滤器至多滞留微对象(12)的不显著的份额；该预过滤步骤在过滤步骤(S3)之前执行。6.如权利要求1所述的方法，其中过滤器(32)是第二过滤器，并且上浓缩步骤(Si)涉及-通过第一过滤器(16)过滤样本流体(10)，从而在第一过滤器(16)上积聚微对象；-溶解第一过滤器(16)。7.如权利要求6所述的方法，其中浸没步骤(S2)涉及-转移流体沿着第一过滤器(16)流动；或者-样本流体的部分回流通过第一过滤器。8.如权利要求1所述的方法，其中上浓缩步骤(Si)涉及-蒸发体积为V1的样本流体(10)；和/或-将微对象(12)吸引到收集区；和/或-离心分离样本流体(10)。9.如权利要求1所述的方法，其中产生图像涉及-产生微对象(12)的光学图像；或者-扫描微对象(12)。10.如权利要求1所述的方法，包括-将染料释放到样本流体(10)或者释放到转移流体中。11.一种用于分析包含有机微对象(12)的样本流体(10)的装置或系统，该装置或系统包括-用于通过在总时间T1内从微对象移除体积为V1的样本流体(10)而上浓缩微对象的构件(20)；-用于将微对象浸没到转移流体中，或者用于让微对象留在样本流体的剩余部分中的构件(22J4；42，44)，样本流体的剩余部分于是提供转移流体；-过滤器(32)，其用于在总时间T3内过滤体积为V3的转移流体，从而在该过滤器上积聚微对象；-用于产生在过滤器上积聚的微对象的图像的构件(36)；其中用于上浓缩的构件的通量V1Zt1大于过滤器的通量V3/T3。12.如权利要求11所述的系统或装置，其中过滤器(32)是第二过滤器，并且用于上浓缩的构件(20)包括用于滞留微对象的第一过滤器(16)，第一过滤器(16)具有比第二过滤器(32)更大的面积。13.如权利要求11所述的系统或装置，其中过滤器(32)是第二过滤器，并且用于上浓缩的构件(20)包括用于滞留微对象的第一过滤器(16)，第一过滤器(16)具有比第二过滤器(32)更高的最大通量。14.如权利要求12或13所述的系统或装置，其中第一过滤器(16)包括用于对微对象(12)染色的染料。15.如权利要求12或13所述的系统或装置，其中第一过滤器(16)包括可在有机溶剂中溶解的有机聚合物或者穿孔铝箔。16.如权利要求11所述的系统或装置，包括包含过滤器(32)的微流体芯片。全文摘要提出了一种分析包含有机微对象的样本流体的方法。该方法包括步骤通过在总时间T1内从微对象移除体积为V1的样本流体而上浓缩(S1)微对象；将微对象浸没(S2)到转移流体中，或者让微对象留在样本流体的剩余部分中，样本流体的剩余部分于是提供转移流体；在总时间T3内通过过滤器过滤(S3)体积为V3的转移流体，从而在该过滤器上积聚微对象；以及产生(S4)在过滤器上积聚的微对象的图像；其中上浓缩步骤(S1)的通量V1/T1大于过滤步骤(S3)的通量V3/T3。过滤器可以是第二过滤器，并且上浓缩步骤(S1)可以涉及通过第一过滤器过滤样本流体，从而在第一过滤器上积聚微对象。也公开了一种用于分析包含有机微对象的样本流体的装置或系统。文档编号G01N15/06GK102395870SQ201080016767公开日2012年3月28日申请日期2010年4月14日优先权日2009年4月14日发明者E.G.范米尔伯根B.,J.伊萨克森B.,胡尔斯肯B.,W.G.庞杰M.,凯珀S.,斯塔林加S.,S.尤纳伊Z.申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司