专利名称：用于样品结构显微成像的方法和设备的制作方法
技术领域：
本发明涉及根据权利要求1或10前序部分的用于样品结构显微成像的方法和设备。
背景技术：
近些年开发有一些光学显微成像方法，用这些方法可基于一些单个标记、特别是荧光分子的连续、随机的定位显示出样品结构，这些样品结构小于传统的光学显微镜的衍射条件下的分辨率极限。这样的方法例如被描述在WO 2006/127692 A2 ； DE 10 2006 021 317 B3 ；WO 2007/128434 Al, US 2009/0134342 Al ；DE 10 2008 024 568 Al ；"Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) ” Nature Methods 3，793-796 (2006)，Μ. J. Rust, M. Bates, X. Zhuang ； “Resolution of Lambda/10 in fluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching",Geisler C. et al, Appl. Phys. A, 88, 223-226 (2007)中。该新的显微技术分支也被称为定位显微技术。所应用的方法例如在文献中以符号(F) PALM((荧光)光敏化定位显微)，PALMIRA (具有独立执行获取的PALM)，GSD(IM)(基态损耗单分子返回)显微)或者(F)ST0RM((荧光)随机光学重构显微)公开。新的方法通常是用一些标记预先准备待成像的样品结构，这些标记具有两个可区别的状态，也就是“亮”状态和“暗”状态。如果例如使用荧光着色剂作为标记，则亮状态是能发荧光的状态及暗状态是不能发荧光的状态。为了用高于传统成像光学系统的分辨率极限的分辨率成像样品结构，将标记的一小部分重复地转化为亮状态。该部分在下面被称为活性部分。在此，形成该“活性”部分的标记的密度被这样选择，使得在亮状态及由此在可光学显微成像的状态中的相邻标记的平均间距大于成像光学系统的分辨率极限。形成活性部分的标记被成像在传感器元件的空间分辨装置上，使得由每个标记检测到一个光斑形式的光分布，光斑的大小由透镜系统的分辨率极限确定。如果包含在活性部分中的标记的密度这样地小，使得如前所述的标记的平均间距超过了由光学显微成像装置的分辨率极限预先确定的最小间距，则是处在所希望的活化状态。该活化状态保证了，由传感器元件装置检测到的光斑的每一个精确地出自一个活化的标记。之前所述的方法被在图1中形象地说明。在图1的左侧部分中示出了一个原始数据-单幅图像的序列，所述单幅图像被用1，...，N逐一编号。示出在这些原始数据-单幅图像中的光斑分别来自一个活化的标记部分，所述部分处在所希望的活化状态中，也就是说， 它的标记密度这样得小，使得确保了这些标记的平均间距大于由光学显微成像装置的分辨率极限预先确定的最小间距。在图1的右上部分中示出了一个整体图，该整体图由原始数据-单幅图像1，...， N叠加而成。该整体图具有一个模糊的、在空间上未被分辨的光分布，该光分布在细节上没有描述出待成像的样品结构。
在图1的左下部分中示出了一个整体图，该整体图由光分布的由原始数据-单幅图像确定出的质心叠加而成。该整体图具有明显更高的分辨率，使得可良好地在细节上-在本例中以其三个同心的圆环-识别该样品结构。为了量化在上述方法中可达到的定位精度，参阅图2，示出在图1中的事实情况被再次纯示意性地在图2中说明。在图2上部中示出了一个原始数据-单幅图像的序列。待成像的、由一些同心圆环组成的样品结构被在图2中以虚线画出并用参考标号2标记。活性部分的各个标记产生光分布4，这些光分布的大小由成像光学装置的分辨率能力给出并且在图2中用ΔΧ_标识出。如在图2中示意性示出地，所述标记彼此具有小于所述大小Δ xAbb的平均间距，使得这些光分布4不叠加。在图2下部中示出了光分布6，这些光分布通过质心确定由光分布4得出。可实现
的定位精度由光分布6的大小Axsp给出。对于定位精度适用于 ΔχAxSFa—^
Vn其中，η表示根据光分布4检测到的光子数量。位置精度典型地位于大约10 至50nm的范围中。在拍摄原始数据-单幅图像之前建立前述的活化状态。基于哪种起始状态来调节所述活化状态，方法与方法之间是不同的。原则上可分为两个方法，即，一个称为“自下而上”的方法及一个称为“自上而下”的方法。在自下而上的方法中所有标记首先处于暗状态中。对于高分辨率的定位所需的活性标记部分的产生由相应的活化、例如由活化光线的辐射引起。这例如是在(F)PALM方法中的情况。相反，在自上而下的方法中所有标记首先处于其亮、也就是可光学显微成像的状态中。为了产生活性标记部分，这些标记的大部分随后转变到其暗状态中，例如再次通过光的辐射。在此，这些标记可以是所谓的“可转换的”标记，例如可转换的蛋白质。这些标记也可以是一些确定的常规荧光着色剂，这些着色剂通过激发光线的辐射转变为长期的暗状态、例如三重态(且由此在本质上是不可转换的标记)。 例如在GSD (IM)方法中以此方式工作。在自下而上的方法和自上而下的方法中都比较困难的是，以可复制的方式调节预先确定的活化状态，该活化状态能够实现各个标记的高分辨率的定位。至今尤其是不能以简单的方式确定，该预先确定的活化状态是否存在。因此通常会出现，太多的标记处于其亮状态中，使得在原始数据-单幅图像中由标记产生的光分布在空间上彼此不可分离。这样使得对样品结构的光学显微成像、尤其是对决定何时可开始实质上的测量造成困难，也就是何时在亮状态中仅还实际上存在少量标记，使得由标记产生的光分布以足够高的概率具有能够实现光分布的可分离检测的空间分布。
发明内容
本发明的任务在于，对根据权利要求1前序部分的、用于光学显微成像样品结构的方法进行改进，使得可简单及精确地确定，是否存在预先确定的活化状态，在该状态中标记彼此具有足够大的平均间距。本发明按照权利要求1的特征部分由此解决了该任务，即，检验预先确定的活化状态的存在，其方式是，相距一个时间间隔地产生至少两个单幅检验图像，至少对于传感器元件的一部分分别检测图像信号在两个单幅检验图像之间的变化，并且在检测到的图像信号的变化在总体上超过了预先确定的大小时确定存在预先确定的活化状态。本发明所基于的认识是，在一个可在空间上彼此分离地检测由标记发出的光信号的状态中，所述信号的时间变化在其总体上大于光信号在一个未被彼此分离地检测的情况中的时间变化。在第一种情况中，似乎可识别在显微图像中的闪光，该闪光由此被典型地用于标记的所希望的活化状态的存在。这由此实现了，总是随机分配地将一些标记从其亮的、 也就是可光学显微成像的状态(例如通过光漂白)变换到其暗状态中及其它标记从其暗状态变换到其亮状态中，在亮状态中这些标记在其再次转变到暗状态之前还发射一定数量的光子。本发明利用前面所述的现象，用于检验是否存在预先确定的活化状态。这如此实现，即相距一个时间间隔地拍摄至少两个单幅检验图像并且由传感器元件产生的图像信号的变化被确定为用于前面所述的闪光有多强的标准。如果标记在亮状态中的空间密度这样大，使得由各个标记发出的光信号叠加，则闪光特性略微强。越多标记发出其光信号到一个及同一传感器元件上，则闪光特性在显微图像中越弱。在此情况下也就是进行了对各个传感器元件接收到的光信号的时间平均。本发明规定了，借助在相距一个时间间隔地拍摄的两个单幅检验图像之间的变化检测用于闪光活性的标准，及根据其决定何时可开始对样品结构的实质性成像。优选地，根据检测到的图像信号的改变确定两个单幅检验图像的彼此相应的图像信号的时间相关性并且当该时间相关性低于预先确定的相关性阈值时确定存在预先确定的活化状态。两个前后相继的单幅图像的时间相关性是一个适于确定闪光活性及由此存在所希望的活化状态的测量参数。因此，两个单幅检验图像之间的时间相关性越小，则闪光活性越高。在根据本发明的方法的一个有利的进一步改进中规定，在检测到的图像信号位于一个第一值域中时，为检测到的两个单幅检验图像的图像信号分别配置一个第一值，及在检测到的图像信号位于一个与第一值域互补的第二值域中时，为检测到的两个单幅检验图像的图像信号分别配置一个与第一值不同的第二值。例如可以将小于一个预先确定的阈值的图像信号配置值0，而将等于或大于该阈值的图像信号配置值1。因此，由这两个单幅检验图像得出一些分别仅包含值1和0的数据记录，并且由此特别好地适于例如通过确定时间相关性来检测闪光活性。相距产生两个单幅检验图像的时间间隔优选被这样调节，使得该时间间隔约等于标记在可光学显微成像的状态中的平均停留时间的1倍至3倍。只要时间间隔在该范围中运动，则确保了在存在预先确定的活化状态时具有足够高的及由此可根据两个单幅检验图像检测到的闪光活性。优选地，在存在预先确定的活化状态的前提条件下，活化状态在减小相距产生两个单幅检验图像的时间间隔时被重复地检验，直到检测到的图像信号的变化在其整体上不再超过一个预先确定的大小，并且在考虑时间间隔的情况下调节传感器元件的曝光时间， 在该时间间隔中检测到的图像信号的变化在其整体上不再超过预先确定的大小。所述方法的优选构型规定了，基于所希望的活化状态可逐步地缩短相距产生两个单幅检验图像的时间间隔，直到不再存在活化状态。通过这种实施方式可得出一个特别有利的曝光时间，即一个尽可能短的时间，但是该时间也足够长，以便能可靠地检测存在的活化状态。通常，如开始部分所说明地，拍摄一个由多个单幅图像构成的图像序列，以便可成像样品结构。在此情况下，在拍摄每个单幅图像之前进行根据本发明的检验步骤，也就是说，在拍摄每个单幅图像之前检验预先确定的活化状态的存在。在此还具有优点，将在检验步骤期间拍摄的单幅检验图像(必要时以修改的形式)考虑作为图像序列的单幅图像，只要在该检验步骤中确定了预先确定的活化状态存在。也可以仅将这些单幅检验图像中的一个用作图像序列的单幅图像。此外，本发明规定了一个具有在权利要求10中说明的特征的、用于光学显微成像样品结构的装置。本发明被在下面根据附图详细说明。其中示出了
图1 一个原始数据-单幅图像的序列以及在质心确定之前和之后的由此组合成的整体图；图2图1中的图像序列在质心确定之前及之后的示意图；图3用于实施根据本发明的方法的光学显微镜的构造；图4用于根据一个实施例来说明根据本发明方法的流程图；及图5分别在不存在预先确定的活化状态的情况中及在存在预先确定的活化状态的情况中的两个前后相继的原始数据-单幅图像。
具体实施例方式图3示出了一个作为实施例的光学显微镜20，该光学显微镜适于实施根据本发明的用于光学显微成像一个样品结构的方法。光学显微镜20包括一个光源22，该光源发射激发光线到一个由两个透镜M和沈构成的透镜系统上。该透镜系统用于以所希望的方式准直从光源22发射出的激发光线。 该准直的激发光线随后入射到一个会聚透镜观上。该会聚透镜观使激发光线聚焦到物镜 30的孔径中。在此，激发光线首先穿过一个二向色镜32，该二向色镜对于激发光线是可穿透的。从物镜30穿透出的激发光线随后入射到一个样品结构34上，该样品结构被安置在一个物镜支架36上。样品结构34被如开头所述用标记、例如荧光分子预先准备。在此可应用开始部分所述的方法，以便将所述标记的一部分分别转变到所述亮的、也就是可光学显微成像的状态中并且由此产生一个活性部分。由该样品结构34发出的光穿过物镜30并且入射到二向色镜32上。该二向色镜 32被这样构造，使得它反射由样品结构34发出的光并且这样向着透镜38定向，该透镜将所述光聚束到一个可空间分辨的光检测器40上。该光检测器40由传感器元件、例如CCD元件的一个矩阵形式的装置构成。这些传感器元件的每一个将由其接收的光转换成电图像信号。这些图像信号随后被输出到一个控制单元42上。控制单元42控制各个显微镜组件并且尤其具有对由光检测器40接收的图像信号进行处理的功能。在使用示出在图3中的光学显微镜20时，如开头结合图1所述地成像样品结构34。也就是，拍摄一个原始数据-单幅图像的序列，对于这些图像分别成像一个另外的标记活性部分。随后，在图像分析过程中，控制单元42在每个原始数据-单幅图像中确定光分布的质心，这些质心表示处于亮状态中的标记。由原始数据-单幅图像求得的光分布的质心随后被组合成一个高分辨率的整体图。根据本发明的方法规定，在产生各个原始数据-单幅图像之前检验对于高分辨率的光学显微成像所必需的活化状态是否已存在，也就是说，包含在各个活性标记部分中的标记是否彼此具有一个平均间距，该平均间距大于由光学显微成像装置的分辨率极限预先确定的最小间距。这在下面结合图4的流程图来说明。示出在图4中的进程以步骤Sl开始。在步骤S2中，运行变量ρ被赋值1，原始数据-单幅图像借助该运行变量P被逐一地编号。跟随步骤S2的、由步骤S3至S6构成的循环用于产生所希望的N个单幅图像(ρ = 1，...，Ν)的序列。因此，在第一次运行用于作为待产生的第一个原始数据-单幅图像的步骤S3 (ρ = 1)时，标记的一部分被转变到可光学显微成像的状态中，以便产生一个第一活性标记部分。本发明在步骤S4中规定了，检测包含在该第一活性标记部分中的标记彼此是否具有一个平均间距，该平均间距大于由光学显微成像装置的分辨率极限预先确定的最小间距。根据本发明的检测最后还会被详细说明。如果在步骤S4中的检测得出预先确定的活化状态已存在，则该进程按照图4以步骤S5继续进行，在步骤S5中产生第ρ个原始数据-单幅图像。接着在步骤S6中，运行变量ρ增加值1。相反，如果在步骤S4中得出，还不存在预先确定的活化状态，则该进程跳返回步骤S3，在该步骤S3中重新进行尝试，使具有所希望的空间密度的标记转变到其可光学显微成像的状态中，以便建立所希望的活化状态。由步骤S3和S4构成的循环被这样长时间地运行，直到步骤S4中的检测得出，存在预先确定的活化状态。在步骤S7中每次都检验，是否运行变量ρ已经达到了单幅图像的总数N。如果还未达到，则该进程跳返回步骤S3。一旦运行变量ρ达到了值N，也就是说产生了单幅图像的所希望的数目N，则示出在图4中的进程结束。如开头所述，必须在原始数据-单幅图像中确定质心，以便得到具有所希望的高分辨率的整体图。在本实施例中，质心可已经在步骤S4中被确定或者在示出在图4中的进程结束之后才被确定。下面详细说明在步骤S3中进行的活化状态的检测。为了在步骤S3中检测活化状态，首先彼此相距一个时间间隔地、以原始数据-单幅图像形式拍摄两个单幅检验图像。在本实施例中，该时间间隔通过曝光时间给出，光检测器40需要曝光时间用于产生图像信号。这意味着，光检测器40在产生第一个原始数据-单幅图像之后直接开始产生第二个原始数据-单幅图像。随后借助这两个单幅检验图像检测闪光活性，以便确定所希望的活化状态是否存在。闪光活性在本实施例中通过确定两个单幅检验图像的时间相关性而被检测。这例如根据下述关系式进行
权利要求
1.一种用于光学显微成像样品结构(34)的方法，其中用标记来准备所述样品结构(34)，所述标记可转变到可光学显微成像的状态，产生活性标记部分，其中所述标记的一部分被转变到该可光学显微成像的状态中，在存在预先确定的活化状态时，该样品结构(34)被成像在传感器元件的装置GO)上， 在所述活化状态中，包含在活性标记部分中的标记彼此之间具有平均间距，该平均间距大于由光学显微成像装置的分辨率极限预先确定的最小间距，这些传感器元件分别产生图像信号，其中，这些图像信号以其整体给出样品结构(34)的单幅图像，其特征在于，检验该预先确定的活化状态的存在，其中相距一个时间间隔地产生至少两个单幅检验图像，至少对于传感器元件的一部分分别检测图像信号在两个单幅检验图像之间的变化，并且在检测到的图像信号的变化在其整体上超过预先确定的大小时，确定该预先确定的活化状态存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，根据检测到的图像信号的变化确定两个单幅检验图像的图像信号的彼此相应的时间相关性并且在该时间相关性低于预先确定的相关性阈值时，确定该预先确定的活化状态存在。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该时间相关性根据下述关系式来确定
4.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，在检测到的图像信号位于第一值域中时，两个单幅检验图像的检测到的图像信号分别被配置一个第一值，及在检测到的图像信号位于与该第一值域互补的第二值域中时，两个单幅检验图像的检测到的图像信号分别被配置一个与第一值不同的第二值。
5.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，调节产生两个单幅检验图像的时间间隔，使得该时间间隔大约等于标记在该可光学显微成像的状态中的平均停留时间的1 倍至3倍。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，调节传感器元件的曝光时间，使得它大约等于标记在该可光学显微成像的状态中的平均停留时间。
7.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，在预先确定的活化状态存在的前提条件下，在产生两个单幅检验图像的时间间隔减小的情况下重复检验该活化状态，直到检测到的图像信号的变化在其整体上不再超过预先确定的大小为止，以及，在考虑时间间隔的情况下调节传感器元件的曝光时间，在该时间间隔中检测到的图像信号的变化在其整体上不再超过该预先确定的大小。
8.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，拍摄单幅图像的图像序列及在拍摄每个单幅图像之前检验预先确定的活化状态的存在。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在该预先确定的活化状态被确定存在时， 将两个单幅检验图像中的至少一个考虑作为图像序列的单幅图像。
10.一种用于光学显微成像样品结构的装置，具有适于用标记准备所述样品结构的机构，所述标记可转变到可光学显微成像的状态中，适于产生活性标记部分的机构，其中标记的一部分转变到该可光学显微成像的状态中，适于在存在预先确定的活化状态时将样品结构成像在一个传感器元件的布置上的机构，在所述活化状态中，包含在该活性标记部分中的标记彼此之间具有平均间距，该平均间距大于由光学显微成像装置的分辨率极限预先确定的最小间距，所述传感器元件分别产生图像信号，其中，这些图像信号以其整体得出样品结构的单幅图像，其特征在于适于检验该预先确定的活化状态的存在的机构，其中相距一个时间间隔地产生至少两个单幅检验图像，至少对于传感器元件的一部分分别检测图像信号在两个单幅检验图像之间的变化，并且在检测到的图像信号的变化在其整体上超过预先确定的大小时，确定该预先确定的活化状态存在。
全文摘要
用于光学显微成像样品结构(34)的方法和装置。用标记准备样品结构，这些标记可转变到可光学显微成像的状态，产生活性标记部分，其中标记的一部分被转变到可光学显微成像的状态，且在存在预定的活化状态时，包含在活性标记部分中的标记彼此具有大于由光学成像装置的分辨率极限预定的最小间距的平均间距，该样品结构被成像在传感器元件的布置(40)上，传感器元件分别产生图像信号，后者以其整体给出样品结构的单幅图像。此外检验预定活化状态的存在，其中相距一个时间间隔地产生至少两个单幅检验图像，及至少对传感器元件的一部分分别检测图像信号在两个单幅检验图像间的变化。在检测到的图像信号的变化整体上超过预定大小时确定预定活化状态存在。
文档编号G01N21/64GK102539395SQ20111031759
公开日2012年7月4日 申请日期2011年10月18日 优先权日2010年10月19日
发明者J·佛林 申请人:徕卡显微系统复合显微镜有限公司