专利名称：一种生物芯片杂交系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种杂交系统，特别涉及一种集成杂交反应、清洗与干燥功能的生物芯片杂交系统。
背景技术：
生物芯片是借助微加工和微电子技术将大量已知序列的大量探针分子有序高密度地固定在支持物上形成，探针分子可以是DNA、RNA、蛋白质、糖等。通过检测探针是否与样品中的靶物质进行杂交，可以对基因表达特征、遗传缺陷、蛋白质分布、反应特性等等进行分析。基于生物芯片的分析方法主要包含样品前处理、芯片制备、芯片杂交、芯片清洗及干燥、芯片检测等步骤。目前生物芯片的制备与检测均有比较成熟的技术与配套仪器，例如目前最普遍的玻璃基生物芯片可采用芯片点样仪进行微阵列制备，其检测也有相应的芯片扫描仪。除了芯片制备与检测外，芯片杂交包括芯片的清洗与干燥是生物芯片技术最为关键的内容之一，以及如何提高杂交过程的可控性及准确性成为生物芯片技术的研究重点与执占。传统的芯片杂交多采用空气浴或水浴控温模式下的静态杂交方法，该方法中由于杂交样品中的靶分子仅依靠分子扩散机制与芯片表面的探针分子进行杂交反应，往往需要较长的反应时间，杂交效率低，而且还容易造成整张芯片的杂交不均勻现象，不利于定量分析。此外，杂交完成后需要另配专门的洗干仪器或装置进行芯片的清洗与干燥，过程繁琐。为克服静态杂交的缺点，已有一些基于振动混合、连续流或往复流的动态杂交方法与装置被提出。例如，Lee等人提出采用蠕动泵促使杂交样品在微阵列表面循环流动的动态杂交方式，将杂交时间从静态杂交所需的6小时缩短至2小时(参见H. H. Lee, J. Smoot, Z. McMurray, D. A. Stahl，P.Yager, Lab Chip,2006，6，1163—1170)。基于类似的循环流杂交原理，美国Affymetrix公司(US Patent6391623)开发出自动化杂交系统，虽然该系统可实现杂交、清洗与干燥的集成化，但是由于使用了蠕动泵和循环流体通道，因此一方面需要大量的样品，另一方面容易造成泵内部污染。此外，其装置上的插槽只能使用从Affymetrix公司购得的芯片，即该设备不具有兼容性与通用性。 Quake课题组利用PDMS(聚二甲基硅氧烷)微流控芯片中的气动微阀技术实现杂交样品溶液在杂交腔室中的往复运动，从而显著提高了反应速度与杂交信号(J. Liu,B. A. Williams, R. Μ. Gwirtz, B. J. Wold, S. Quake, Angew. Chem. Int. Ed. 2006，45，3618—3623)。利用类似的原理，Roche NimebleGen公司开发的NimbleGen Mixers杂交仪 (http //www. nimblegen. com/products/instruments/)采用气云力阀鼓气泡获得往复流杂交的方法，将检测灵敏度提高了 3倍，并且缩短杂交反应时间。然而，该设备只具备杂交反应功能，而芯片清洗和干燥分别需要专门的设备进行，未能实现杂交、清洗与干燥的集成。综上所述，现有的生物芯片杂交系统或是杂交耗时长、效率低，或是操作流程繁琐，集成度和自动化程度不高。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种集成杂交、清洗与干燥功能的生物芯片杂交系统，包括生物芯片，由具有探针点阵的基片以及至少两个通孔的盖片封接形成，所述基片与盖片之间形成杂交腔室；至少两条分别通过所述两个通孔与杂交腔室连通的流体通道；与所述流体通道连通的流体控制装置。在使用时，所述流体通道至少有一条为流体流入通道，一条为流体流出通道。作为优选，所述流体控制装置包括至少一个用于提供气体压强的泵和一个控制流体流动的阀，所述泵通过阀与所述流体通道连接，其可以选择通过阀与作为流体流入通道的流体通道连通，或选择与作为流体流出通道的流体通道连通。其功能主要用于控制以下流程样品溶液在探 针点阵表面的往复流动以实现动态杂交反应、清洗液在探针点阵表面的连续流动以实现芯片清洗、惰性气体连续流入杂交芯片以排出废液、惰性气体在探针点阵表面的连续流动以实现芯片干燥。所述泵主要包括控制样品溶液往复流的流体驱动泵、控制清洗液连续流的流体驱动泵和干燥气体连续流的流体驱动泵。任何通过使用电信号可升高或降低空气通道中气压的泵都可用于本发明中。然而，所述的控制样品溶液往复流的流体驱动泵优选使用可控制到微米级单位体积的步进电动式注射泵或柱塞泵，其可以对其相应通道中的流体(包括气体和液体)提供精确的往返运动控制；所述的控制清洗液连续流的流体驱动泵优选使用可实现流体连续流动的压电型微泵，可以提供液体的连续、稳定流动，并能够精确控制液体流速。所述干燥气体连续流的流体驱动泵，优选使用具有较大流速范围的气泵，提供气体的连续、稳定与高速流动。所述的阀装置，可以是集成在流路内部的内部阀，也可以是外部阀。优选使用具有少量死体积的微电磁阀，但不仅限于此。本发明提供的生物芯片杂交系统的泵和阀，其功能均为满足芯片的杂交、清洗和干燥过程控制，具体数量可以根据流路设计而改变。可以是每个流路都采用一个泵和一个阀，也可以是多个流路共用一个泵，而每个流路分别使用一个阀控制流路的通与断。当其中一个阀打开，其它的阀关闭，利用泵提供动力使该阀控制的流体流动。阀可以具有分支阀来控制对杂交腔室的流体供应。分支阀指与多个通道相连接的阀。在这种情况下，每个通道可以独立地打开或关闭。任何通过使用电信号可升高或降低通道中气压的泵都可用于本发明中。然而，优选使用可控制到微米级单位体积的步进电动式微泵。作为优选，所述生物芯片杂交系统的生物芯片基片的生物探针点阵的生物分子可选自由以下物质构成的组DNA、RNA、PNA (肽核酸)、LNA (锁核酸)、肽和蛋白质，但不仅限于此。所述生物芯片基片、盖片材料可以是玻璃、硅和PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、 PDMS (聚二甲基硅氧烷)、PC (聚碳酸酯)、PET (聚对苯二甲酸乙二醇酯)、C0C (环烯烃类共聚物)等高分子聚合物。
在本发明的具体实施例中，提供一种基于往复流的生物芯片，由盖片、微流体层、 和基片封固形成，所述盖片有至少两个通孔，所述微流体层有一个镂空的杂交腔室和至少两个镂空的微流体通道，每个微流体通道一端与杂交腔室连通，另一端分别与盖片的一个通孔连通，微流体层的杂交腔室与基片的生物探针点阵连通。作为优选，所述微流体层的微流体通道截面的面积在0. Ol-IOmm2之间，长度在 Imm-IOOmm 之间。所述杂交腔室提供溶液往复流动的空间，其位置和形状应保证样品溶液与下层基片上的生物探针反应的均勻性；所述通孔通过微流体通道与杂交腔室连通，注射泵或柱塞泵产生的气体压强作为驱动力促使溶液液流通过通孔在微流体通道和杂交腔室中地往复流动。往复流动的往复频率优选为O-lOOHz，提供往复流驱动的气体压强优选为0-lMPa。更优选地，盖片的下表面即与微流体层封固的表面具有亲水特性，最优选的，所述盖片的与微流体层接触的表面对样品溶液的接触角小于90度，另一表面对样品溶液的接触角为90-180度。在盖片的通孔处加样时，可利用液体的表面张力为驱动力实现样品溶液自动进入并充满杂交腔室和微流体通道。更优选地，本发明所述生物芯片杂交系统还包括温度控制装置。所述的温度控制装置包括热板、加热体、制冷体、温度传感器和温控仪。所述热板材料可以是金属或合金，也可以是硅或玻璃等导热系数高的非金属，用于放置芯片及传热，其温度控制方式可以是对芯片进行上表面或下表面的温度控制，也可以采用同时对芯片的上下两表面进行温度控制。所述加热体具体可以为电阻丝、电阻膜或Peltier等装置。所述制冷体具体可以为散热风扇、半导体制冷器等装置。所述温度传感器和温控装置可以采用商品化的温度传感器和温控仪，也可以采用控制电路，用于控制芯片的升降温或保持一定温度。本发明提供的生物芯片杂交系统，还包括与流体通道连通的流体存储装置。所述流体存储装置为玻璃瓶或塑料瓶等器皿或具有流体腔体的芯片，用于存储生物芯片检测过程所需的各种流体。所述流体包括用于芯片杂交后清洗的清洗液、用于废液排除和芯片干燥的流体。用于废液排除和芯片干燥的流体是不会与样品溶液和清洗液发生扩散、溶解和反应的气体或液体，优选惰性气体，可以是空气或氮气。所述流体通道可以提供样品溶液、 清洗液和惰性气体的流入与排出。作为优选，本发明所述生物芯片杂交系统还包括控制电路。所述控制电路为单片机系统，自动地控制所述阀的开合、泵的工作、以及加热器的温度。更优选地，本发明所述生物芯片杂交系统还包括显示器，用于显示系统的操作。本发明提供的生物芯片杂交系统，利用流体控制装置提供的动力，在本发明的具体实施方式
中，利用泵阀装置提供的气体压强作为驱动力促使液流在杂交通道和腔室中自动地往复流动，实现动态的杂交反应，从而提高杂交效率与均勻性。该系统集成了芯片杂交、清洗和干燥功能，且不同功能的运行顺序及运行时间都可以通过单片机实现自动化控制。本发明提供的生物芯片杂交系统还可利用温度控制装置对杂交芯片中的样品溶液进行程序升降温或保持一定温度，既能够缩短杂交时间，提高杂交效率，又能够整合集成清洗与干燥功能，实现杂交反应、清洗和干燥的全自动化操作，具有推广意义。
图1为本发明所述生物芯片杂交系统组成示意图；图2为本发明所述生物芯片杂交系统的生物芯片结构示意图，1为基片，2为盖片， 3为生物探针点阵，4为通孔，5为杂交腔室；图3为本发明所述生物芯片杂交系统的温度控制装置示意图；图4为本发明所述生物芯片杂交系统的流体控制装置示意图；图5为实施例2提供的用于本发明所述生物芯片杂交系统的生物芯片结构示意图，其中1为基片；2为盖片；3为生物探针点阵；4为通孔；5为杂交腔室，6为微流体通道， 7为微流体层。
图6为本发明所述生物芯片杂交系统的玉米基因芯片杂交实验结果，(a)为杂交前的荧光显微照片；(b)为杂交后的荧光显微照片；图7为相同浓度样品，荧光强度随杂交时间的变化曲线；图8为相同杂交时间，荧光强度随样品浓度的变化曲线；图9为本发明所述生物芯片杂交系统的耳聋芯片杂交实验结果，(a)为杂交前的荧光显微照片；(b)为杂交后的荧光显微照片。
具体实施例方式本发明公开了一种生物芯片杂交系统，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品、使用方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例1本实施例提供一种用于单样品杂交的生物芯片杂交系统，整套系统由以下部分组成生物芯片、分别与生物芯片上两个通孔连通的两条流体通道、与所述流体通道连通的流体控制装置、控制电路、温度控制装置和流体存储装置。其中，控制电路发出指令至温度控制装置，对芯片及样品溶液的温度进行自动化控制；控制电路还发出指令至流体控制装置， 对芯片杂交、清洗和干燥过程中的流体进行自动化控制。清洗液与空气在泵阀装置驱动下， 从流体存储装置经流体通道加入杂交反应腔室，再通过流体通道排入废液存储装置，本发明所述生物芯片杂交系统示意图见图1，各组成部分详述如下图2为本发明所述生物芯片杂交系统的生物芯片结构示意图；其中1表示生物芯片基片，2表示生物芯片盖片，3表示基片上的生物探针点阵，4表示生物芯片的通孔，5表示杂交腔室。所述两个通孔分别与两条流体通道连通。本发明所述生物芯片杂交系统的温度控制装置示意图见图3，生物芯片置于两个导热板之间，每个导热板分别通过加热膜进行加热，温度传感器实时检测导热板的温度输入到温度控制电路，采用温度控制电路设定程序输出至加热膜，对杂交芯片的温度进行自动化控制。本发明所述生物芯片杂交系统的流体控制装置与流体存储装置，如图4所示，流体控制装置包括两个泵、四个电磁阀及导管，其中泵1用于控制杂交芯片中的样品往复流动态杂交过程，一端通过管道直接与空气连接，另一端通过阀1与生物芯片的通孔连通；泵 2用于控制清洗和干燥过程，一端通过阀2与空气连接同时通过阀3、阀4与清洗液瓶连接， 另一端通过阀1与芯片的通孔连接；芯片的另一通孔通过另一流体通道与废液瓶连接。阀 2、3、4为两通阀，阀3与4用于控制清洗过程中清洗液流路的通和断，阀2用于控制干燥过程中空气流路的通和断，阀1为三通阀，用于控制泵1和泵2两个流路中任一流路的通断， 其公共端与芯片进口相连。实施例2: 本实施例提供的一种用于单样品杂交的生物芯片杂交系统，与实施例1不同的是，生物芯片为基于往复流的生物芯片，其结构如图5所示，其中1为基片；2为盖片；3为生物探针点阵；4为通孔；5为杂交腔室，6为微流体通道，7为微流体层。所述生物芯片由盖片、微流体层、和基片三层封固形成，盖片2具有亲水特性，设置有两个通孔4，用于溶液的进出，盖片2下表面即与微流体层的接触面经化学修饰后对水的静态接触角为15度，上表面经疏水化处理后对水的静态接触角为100度；微流体层7厚度约为0. 2mm,设置镂空的杂交腔室5和微流体通道6，微流体通道6 —端与杂交腔室5连通，另一端与盖片2的通孔4连通；微流体层6的上表面与盖片2的下表面封接，微流体层 7的下表面与基片1封接形成一个往复流杂交芯片，杂交腔室5与基片1的生物探针点阵区3连通，其形状与面积与生物探针点阵区3相对应。基片1可为玻璃基的DNA芯片或蛋白质芯片。实施例3 实施例1或实施例2所述生物芯片杂交系统的操作流程如下通过生物芯片上的通孔加样品溶液后，将两条流体通道分别与生物芯片上的两个通孔连通，调整热板温度为60°C，启动杂交步骤，泵1开启，同时三通阀1开启泵1所在流路，驱动样品溶液在杂交芯片的腔室内部往复运动从而实现动态杂交；杂交结束后，关闭泵 1阀1，调整芯片温度为42°C，启动清洗步骤，泵2阀3均开启，驱动第一种清洗液进入芯片进行清洗，随后，阀3关闭同时阀4开启，驱动第二种清洗液进入芯片进行清洗；清洗结束后，阀4关闭同时阀2开启，启动干燥步骤，驱动空气进入芯片，将废液从芯片排至废液瓶， 并最终将芯片表面完全吹干。杂交结束后，取出芯片，到LuxScan扫描仪上进行扫描检测。具体实验条件为所用芯片为玉米基因芯片，探针分子结构为NH2-(T) GCACTCGCACAACCCAAGAACCT,探针浓度为 2 μ mol/L，样品浓度为 lnmol/L，进样量为 63 μ L, 分子结构为 Cy5-TCAGCGACGCCATCAGGTTCTTGGGTTGTGCGAGAGAGATTGGGGATGCA ；杂交时往复流流速0. lmL/min，杂交时间IOmin ；清洗时清洗液流速3mL/min，清洗时间2min ；干燥时空气流速100mL/min，吹干时间5min。图6为杂交芯片的荧光显微镜照片。杂交前的探针点阵区域并无荧光信号，如图 6a所示；经本发明所述生物芯片杂交系统处理后，出现很强的荧光信号，并且点间的均勻性高，点间信号偏差小于10%，表现出显著的杂交效率，如图6b所示。
实施例4 所述生物芯片杂交系统的杂交流程及实验条件与实施例3类似，其不同在于样品浓度为0. lnmol/L，杂交时间分别为5min、lOmin、15min和20min。杂交结果如图7所示，相同样品浓度下，荧光信号强度随着杂交时间增加而增大。实施例5所述生物芯片杂交系统的杂交流程及实验条件与实施例3类似，其不同在于样品浓度分别为lpmol/L、10pmol/L、100pmol/L和1000pmol/L。杂交结果如图8所示，相同杂交时间下，荧光信号强度随着样品浓度增加而增大。实施例6本发明所述生物芯片杂交系统的杂交流程及实验条件与实施例3类似，其不同在于所用芯片和试剂采用博奥生物有限公司的晶芯九项遗传性耳聋基因检测试剂盒，样品浓度为lOnmol/L，进样量为65 μ L ；杂交温度50°C，往复流流速5 μ L/min,杂交时间15min ；清洗温度42°C，清洗液流速2mL/min，清洗时间2min ；干燥温度42°C，空气流速lOOmL/min，吹干时间5min。，具体实验条件为芯片和试剂均采用博奥生物有限公司的晶芯九项遗传性耳聋基因检测试剂盒，样品浓度为lOnmol/L，进样量为65 μ L ；杂交温度50°C，往复流流速 5 μ L/min，杂交时间15min ；清洗温度42°C，清洗液流速2mL/min，清洗时间2min ；干燥温度 420C，空气流速100mL/min，吹干时间5min。杂交结果如图9所示，杂交前的探针点阵区域荧光扫描图像见图9a，仅有参照点有荧光信号，而其他的样品点并无荧光信号；全自动杂交系统杂交、清洗与干燥处理后的荧光图像见图％，除了参照点外，样品点均出现很强的荧光信号，并且点间的均勻性高，点间信号偏差小于10%，表现出显著的杂交效率。以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的实施范围。所有依本发明精神所作的温度控制方式及流体控制方式的改变，均属于本发明专利涵盖的范围内。
权利要求
1.一种生物芯片杂交系统，包括生物芯片，包含具有探针点阵的基片以及有至少两个通孔的盖片，所述基片与盖片之间形成杂交腔室；至少两条分别通过所述两个通孔与杂交腔室连通的流体通道； 与所述流体通道连通的流体控制装置。
2.根据权利要求1所述生物芯片杂交系统，其特征在于所述流体控制装置包括至少一个用于提供气体压强的泵和一个控制流体流入的阀，所述泵通过所述阀与流体通道连接。
3.根据权利要求1所述生物芯片杂交系统，其特征在于所述生物芯片的探针选自 DNA、RNA、PNA、LNA、肽和蛋白质中任意一种。
4.根据权利要求1所述生物芯片杂交系统，其特征在于所述生物芯片盖片材料为玻璃、硅和高分子聚合物。
5.根据权利要求1所述生物芯片杂交系统，其特征在于所述生物芯片基片材料为玻璃、硅和高分子聚合物。
6.根据权利要求4或5所述生物芯片杂交系统，其特征在于所述高分子聚合物包括聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、环烯烃类共聚物。
7.根据权利要求1所述生物芯片杂交系统，其特征在于还包括温度控制装置。
8.根据权利要求7所述生物芯片杂交系统，其特征在于所述的温度控制装置包括热板、加热体、制冷体、温度传感器和温控仪。
9.根据权利要求8所述生物芯片杂交系统，其特征在于所述热板材料为金属或合金或导热系数高的非金属如硅或玻璃。
10.根据权利要求8所述生物芯片杂交系统，其特征在于所述加热体为电阻丝、电阻膜或Peltier装置。
11.根据权利要求8所述生物芯片杂交系统，其特征在于所述制冷体为散热风扇、半导体制冷器装置。
12.根据权利要求1所述生物芯片杂交系统，其特征在于还包括与流体通道连通的流体存储装置。
13.根据权利要求12所述生物芯片杂交系统，其特征在于所述流体存储装置为玻璃瓶或塑料瓶等器皿或具有流体腔体的芯片。
14.根据权利要求1所述生物芯片杂交系统，其特征在于还包括控制电路。
15.根据权利要求1所述生物芯片杂交系统，其特征在于所述控制电路为单片机系统。
16.根据权利要求1所述生物芯片杂交系统，其特征在于还包括显示器。
17.根据权利要求1-16任一项所述生物芯片杂交系统，其特征在于所述生物芯片还包括设置于盖片和基片之间的微流体层，所述微流体层有一个镂空的杂交腔室和至少两个镂空的微流体通道，每个微流体通道一端与杂交腔室连通，另一端分别与盖片的一个通孔连通，微流体层的杂交腔室与基片的探针点阵连通。
18.根据权利要求17所述生物芯片杂交系统，其特征在于所述盖片的与微流体层接触的表面对样品溶液的接触角小于90度。
19.根据权利要求18所述生物芯片杂交系统，其特征在于其特征在于所述盖片的另一表面对样品溶液的接触角为90-180度。
20.根据权利要求17-19任一项所述生物芯片杂交系统，其特征在于所述微流体层的微流体通道截面的面积在0. Ol-IOmm2之间，长度在Imm-IOOmm之间。
全文摘要
本发明涉及一种杂交系统，具体公开一种集成杂交、清洗与干燥功能于一体的生物芯片杂交系统，包括生物芯片，包含具有探针点阵的基片以及有至少两个通孔的盖片，所述基片与盖片之间形成杂交腔室；至少两条分别通过所述两个通孔与杂交腔室连通的流体通道；与所述流体通道连通的流体控制装置。本发明提供的生物芯片杂交系统以流体控制装置提供的动力作为驱动力促使液流在杂交通道和腔室中自动地往复流动，实现动态的杂交反应，从而提高杂交效率与均匀性，且可实现自动化控制。
文档编号G01N21/64GK102199529SQ20111006901
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月22日 优先权日2011年3月22日
发明者叶嘉明, 宋秀梅, 张锦秀, 段立清, 王东, 王品虹, 王国青, 赵凯军, 邢婉丽, 高华方 申请人:博奥生物有限公司, 清华大学