专利名称：利用聚集诱导发光监测β淀粉样蛋白聚集过程的方法
技术领域：
本发明涉及β淀粉样蛋白聚集过程的监测方法，尤其涉及利用聚集诱导发光法监测β淀粉样蛋白聚集过程的方法，属于生物医学研究和临床检测技术领域。
背景技术：
阿尔兹海默氏病(Alzheimer’ s Disease, AD)是引起老年性痴呆最常见的一种疾病。目前，AD是老年人群中继心脑血管病、癌症、中风之后的第四大杀手。AD的病理学特征是在患者的大脑中可以观察到细胞外衰老斑块和细胞内的神经元纤维缠结，这是因为 β-淀粉样蛋白(amyloid β -protein, A β )在细胞内外异常聚结可以形成对神经元细胞具有毒害作用的短肽聚集体。在血浆、脑脊髓液和短肽聚集体中最常见的Aβ是Αβ 40和 Αβ 42 (Αβ 42更容易聚集，毒性更强)，它们是由淀粉样蛋白前体依次经过β和Y-分泌酶定点酶切而产生的。对AD患者的诊断当前主要是依据其记忆和行为的部分丧失，对于潜伏期患者的病理诊断是一个具有挑战意义的世界前沿课题。据医学相关资料显示，在全球已有的MOO万老年性痴呆患者中，我国约占1/4， 并以每年100万的速度递增。当前，对无症状的AD患者的检测最常用的技术有磁共振成像(magnetic resonance Imaging，MRI )、正电子发身寸成像(positron emission tomography，PET)禾口光学成像(optical imaging)、表面增强拉曼(surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)光谱、扫描电化学显微镜(scanning electrical microscopy, SEM)技术和电化学方法等。MRI的灵敏度较低，在临床医学难以有效利用；PET价格太高， 而且目前可供选择的同位素标记的PET探针较小，这些大大限制了其广泛应用。电化学方法需要复杂的电极制备过程。内源荧光法检测β淀粉样蛋白聚集体的文献也有报道，但是，发内源荧光的色氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸的激发波长和发射波长都处于紫外区，难以直接成像观察，且量子产率较低，检测灵敏度较低。荧光探针可以吸附或者共价结合到蛋白质上，导致其荧光特性(发射波长、荧光强度、荧光偏振度等)发生变化，进而可以对蛋白质进行定性和定量研究。目前，在A β的荧光检测中最常用的荧光探针有硫磺素(Thioflavin， ThT)、刚果红(Congo Red, CR)和 8-苯氨基-1-萘磺酸(8-Anilino-l-naphthalenesulfon ic acid，ANS)等。这些探针都是通过疏水作用和蛋白质相结合，引起荧光探针荧光特性的变化，所以，特异性很差；另外，这些探针的检测重复性都很差；这些探针也无法检测淀粉体形成过程中出现的一些中间体。再加上，β淀粉样蛋白在体液中含量低，聚集速度较慢， 所以，设计合成能监测β淀粉样蛋白聚集过程的超灵敏促动器和传感器，开发出对老年性痴呆患者早期诊断的医用试剂盒，可以使很多早期患者早发现、早治疗，大大减少患者的身体痛苦和经济负担。Roberti等发现将Αβ的姊妹蛋白α-同核蛋白(α-synuclein)修饰在量子点(Qdot 605)上之后，形成一个可以促进α-synuclein聚集的成核中心，该方法可以快速、灵敏地研究a-synuclein在活细胞内的聚集过程。Jovin等在荧光物质芘上通过共价键偶联马来酰亚胺(maleimide)，在a -synuclein上将惰性的丙氨酸突变为含有羟基的半胱氨酸((Cysteine，Cys))，利用马来酰亚胺与巯基的高亲和性，在a-synuclein的三种突变体上标记了芘分子。利用芘聚集后形成激基缔合物(excimer)后产生的发射峰来检测α -synuclein的聚集。尽管芘分子可以形成激基缔合物，但是，由于激基缔合物在470 nm处的荧光峰较小，所以，只能定性地说明形成了聚集体，无法准确地定量说明聚集程度。7 (aggregation induced emission enhancement,AIEE)Mit^ 物是近年来荧光探针方面的一个研究热点。由于其特殊的分子结构，其在有机溶剂中荧光很弱甚至不发光，如果其存在的溶剂环境极性增加，或者化合物以聚集体或者固体形式存在时，分子内本来可以自由旋转的一些取代基旋转受阻，这样强烈地抑制了荧光分子的非辐射失活过程，导致AIEE型化合物的荧光大大增强。如果在A β 42或者A β 40上特异性地标记上一种AIEE型化合物分子，A β 42或者A β 40分子的聚集必然导致AIEE型化合物的聚集，荧光增强。可以定性或定量地监测β淀粉样蛋白聚集过程，将用其于潜伏期老年性痴呆患者的病理诊断，具有很好的应用前景，目前还未见相关文献报导。
发明内容
本发明目的是提供一种可以高灵敏、高选择性地监测β淀粉样蛋白聚集过程的聚集诱导发光新方法，为老年痴呆症等疾病的早期诊断提供有益信息。为实现本发明目的，本发明利用马来酰亚胺与半胱氨酸上巯基的高亲和性，将β 淀粉样蛋白特异性地结合在聚集诱导荧光探针上，基于聚集诱导发光增强现象，高灵敏、高选择性地监测β淀粉样蛋白聚集过程，从而定性或定量地监测人体内β淀粉样蛋白变化。具体技术方案首先合成具有聚集诱导发光增强效应的荧光探针，利用共价键在聚集诱导荧光探针分子上偶联马来酰亚胺，将β淀粉样蛋白42分子上的第2位的甘氨酸突变成半胱氨酸，利用马来酰亚胺与半胱氨酸上巯基的高亲和性，将β淀粉样蛋白特异性地结合在聚集诱导荧光探针上，用聚集诱导发光增强法监测β淀粉样蛋白的聚集过程。具体通过以下步骤实现
1)将Αβ42分子上的第2位的甘氨酸突变成半胱氨酸的β-淀粉样蛋白溶解在磷酸盐缓冲溶液中；
2)然后加入如下结构的具有聚集诱导发光增强效应的荧光探针
权利要求
1. 一种利用聚集诱导发光监测β淀粉样蛋白聚集过程的方法，其特征在于，通过以下步骤实现1)将Αβ42分子上的第2位的甘氨酸突变成半胱氨酸的β-淀粉样蛋白溶解在磷酸盐缓冲溶液中；2)然后加入如下结构的具有聚集诱导发光增强效应的荧光探针
2.如权利要求1所述的一种利用聚集诱导发光监测β淀粉样蛋白聚集过程的方法，其特征在于，磷酸盐缓冲溶液为0. 2 Μ，ρΗ 7. 4缓冲溶液。
全文摘要
本发明公开了一种利用聚集诱导发光监测β淀粉样蛋白聚集过程的方法，属于生物医学研究和临床检测技术领域。该方法利用马来酰亚胺与半胱氨酸上巯基的高亲和性，将β淀粉样蛋白特异性地结合在聚集诱导荧光探针上。基于聚集诱导发光增强现象监测β淀粉样蛋白的聚集过程。该方法具有高灵敏、高选择性、稳定性好，易控制，制作成本低廉等优点。可以监测微摩尔甚至纳摩尔的Aβ42和Aβ40含量，且检测速度比利用ANS(8-苯胺-1-萘磺酸)等探针的监测方法提高15倍。可以定性或定量地监测β淀粉样蛋白聚集过程，将用其于潜伏期老年性痴呆患者的病理诊断，具有很好的应用前景。
文档编号G01N33/68GK102279270SQ20111010579
公开日2011年12月14日 申请日期2011年4月27日 优先权日2011年4月27日
发明者宋胜梅, 徐茂田, 朱旭, 王永祥, 王静, 瞿鹏 申请人:商丘师范学院