专利名称：显微镜的制作方法
技术领域：
本发明涉及显微镜。
背景技术：
光学显微镜领域早已建立并且目前已经开发出了多种类型的显微镜。另外，随着包括激光技术和电子成像技术的外围技术的发展，近年来已经开发出了更加高级的显微镜技术。在这样的背景下，人们提出了一种高功能性显微镜，其通过用多波长光来照明样本而诱发双谐振吸收过程，而使得不仅能够控制所获得图像的对比度，而且能够对它进行科学分析(例如，参见日本专利特开No. 8-184552)。这种显微镜能够通过选择具有双谐振吸收的特定分子来观察由特定光学跃迁造成的吸收和荧光性。下面将参照
图19至图22对其原理进行描述。图19示出了组成样本的分子的价电子轨道的电子结构。首先，用波长为λ 1的光来激发图19所示基态(SO态: 稳定状态)下分子的价电子轨道上的电子，从而使其跃迁至第一激发态(Si态)。接下来， 按相似方式用波长为λ 2的光来激发该电子，以便使其跃迁至图21所示的第二激发态(S2 状态)。在这种激发态下，该分子发射荧光或磷光并且返回到图22所示的基态。采用双谐振吸收过程的显微术被用于利用图21的吸收过程和诸如荧光性或磷光现象的光发射来观察吸收图像和发射图像。根据这种显微术，首先，通过谐振波长为λ 1的激光等将组成该样本的分子激发至Sl态，如图20所示。这时，单位立方体积中Sl态的分子数与所发射光的强度成比例地增加。这里，通过将每分子吸收截面积乘以单位立方体积中的分子数来获得线性吸收系数。因此，在图21所示的激发过程中，随后照射的谐振波长为λ 2的光的线性吸收系数取决于最初照射的谐振波长为λ 1的光的强度。S卩，波长λ 2的线性吸收系数λ 2可以由谐振波长为λ 1的光的强度来控制。这表明，通过用波长为λ 1的光和波长为λ 2的光来照明样本并且用波长λ 2来拍摄透射图像，能够完全通过波长为λ 1的光来控制透射图像的对比度。另外，如果可以利用荧光性或磷光现象来执行从图21的激发态向图22的基态的去激发过程，则其发射强度与Sl态下的分子数成比例。因此，也可以利用显微镜作为荧光显微镜来控制图像的对比度。而且，采用双谐振吸收过程的显微术不仅可以如上所述来控制图像的对比度，而且可以进行化学分析。即，因为图19所示最外侧电子的轨道具有特定于每个分子的能级，所以波长λ 1在这些分子当中改变，同时，波长λ2也特定于这些分子。这里，即使用常规的单一波长的光来照射样本，也可以在一定程度上观察到特定分子的吸收图像或者荧光图像。然而，一般来说，因为某些分子的吸收频带的波长范围彼此交叠，所以当用单一波长的光来照射样本时，不能精确地识别出该样本的化学成分。与此相反，采用双谐振吸收过程的显微术利用两个波长λ 1和λ 2来限制分子吸收光或发射光，其使得能够比常规方法更精确地识别样本的化学成分。另外，在激发价电子方面，只有那些相对于分子轴具有特定电场矢量的光被强烈吸收，由此通过判定波长λ 1 的光和波长λ2的光的偏振方向来拍摄吸收图像或荧光图像实现了对相同分子的取向方向的识别。另外，近来提出了一种能够通过采用双谐振吸收过程来提供超出衍射极限的空间分辨率的荧光显微镜(例如，参见日本专利特开No. 2001-100102)。图23示出了分子的双谐振吸收过程的概念图，其中，处于基态SO的分子被波长为 λ 1的光激发至第一激发态并进一步被波长为λ 2的光激发至第二激发态S2。应注意到， 图23示出了来自处于S2状态的特定类型分子的荧光极其弱。具有如图23所示光学特性的分子呈现了非常有趣的现象。与图23 —样，图M也是双谐振吸收过程的概念图，其示出了表示空间距离的扩展的垂直轴X、被波长为λ 2的光照射的空间区域Al，以及没有被波长为λ 2的光照射的空间区域AO。在图M中，处于Sl态的多个分子是通过在空间区域AO中用波长为λ 1的光激发而生成的，这时，可以观察到来自空间区域AO的、由波长为λ3的光发射的荧光。然而，因为将波长为λ 2的光照射至空间区域Al，所以处于第一激发态Sl的大多数分子都立即被激发至更高状态-第二激发态S2，没有分子保留在第一激发态Sl。针对某些分子来识别这种现象。因为这种现象，自从开始起在空间区域Al中就完全消除了波长为λ 3的荧光并且没有来自第二激发态S2的荧光，荧光本身在空间区域Al中被完全抑制(荧光抑制效应)并且仅发射来自空间区域AO的荧光。另外，当波长为λ 2的光交叠了荧光发射频带时，分子因诱发发射过程而被迫从第一激发态Sl跃迁至基态SO的更高振动级。因而，更加增强了荧光抑制效应。换句话说， 随着波长为λ 2的光的发射，从第一激发态Sl发射的荧光量减小了。因此，如果分子被迫跃迁至量子能级(quantum level)，则呈现了荧光抑制效应。具有这种特性的材料是光致变色分子、包括稀土元素的荧光物质、量子点等。从显微镜的应用领域来看，这种现象具有非常重要的意义。即，常规扫描显微镜等利用会聚透镜将激光束会聚成微光束(microbeam)，以便在要观察的样本上进行扫描。这时，微光束的尺寸降至衍射极限，后者取决于会聚透镜的数值孔径(numerical aperture) 和波长。因此，原理上不能预计进一步的空间分辨率。然而，在图对所示的情况下，因为通过空间上部分交叠的波长为λ 1和波长为入2 的两个不同光来控制荧光区域，所以当注意力集中在波长为λ 1的光的发射区域上时，例如可以根据会聚透镜的数值孔径和波长使荧光区域比衍射极限窄，这导致空间分辨率的显著提高。因此，采用这种原理的优点，可以实现超过衍射限制分辨率的、采用双谐振吸收过程的超高分辨率显微镜，即，例如超高分辨率荧光显微镜。在利用若丹明(rhodamine)6G方面，例如，如果发射了波长为532nm的光(泵浦光；第一照明光)，则若丹明6G分子从基态SO被激发至第一激发态Si，并且发射了峰值在波长560nm的荧光。这时，如果照射了波长为599nm的光(消除光；第二照明光)，则造成双谐振吸收过程，致使若丹明6G分子跃迁至荧光发射非常困难的第二激发态。更具体地说， 向若丹明6G同时照射泵浦光和消除光抑制了荧光性。图25是常规提出的超高分辨率显微镜的主截面构造图。这种超高分辨率显微镜基于激光扫描型通用荧光显微镜并且包括三个独立单元，即，光源单元210、扫描单元230 以及显微镜单元250。光源单元210具有泵浦光源211和消除光源212。从泵浦光源211发射的泵浦光入射到二向色棱镜213并被其反射。从消除光源212发射的消除光在其相位经过调制光学部件215的空间调制之后入射至二向色棱镜213，透射过二向色棱镜213并接着按照与泵浦光同心组合的方式出射(exit)。这里，在观察利用若丹明6G染色的样本时，利用Nd:YAG激光器来设置泵浦光源 211，以发射波长为532nm的光，它是该激光器的二次谐波。另外，利用Nd: YAG激光器和拉曼移相器(Raman shifter)来设置消除光源212，以通过拉曼移相器来发射作为Nd: YAG激光器的、被调制成波长为599nm的光的二次谐波的光，作为消除光。例如，调制光学部件215调制消除光的相位并且具有被围绕光轴径向划分成8个区域的光瞳面，如图26所示。这些区域都是通过形成彼此相差消除光的波长的λ/8相位的光学多层膜，使得消除光的相位差围绕光轴以旋转，或者通过蚀刻玻璃基板而形成的。当透射过调制光学部件215的消除光被会聚时，它产生了抵消光轴上的电场的中空消除光。扫描单元230在通过半棱镜231传递从激光源单元210同轴发射的泵浦光和消除光之后，利用两个检电镜(galvano mirror) 232、233在二维方向上进行摆动扫描，以便向下面将描述的显微镜单元250发射光。另外，扫描单元230分支从显微镜单元250入射的荧光，利用半棱镜231反向跟踪(track back)其路径，使得所分支的荧光经由投影透镜234、 针孔235以及陷波滤波器236、237被光电倍增器接收。为简化附图起见，检电镜232、233在图25中可按共平面方式摇摆。陷波滤波器 236、237消除了混合在荧光中的泵浦光和消除光。另外，针孔235是组成共焦光学系统的重要光学部件，并且仅允许在所观察样本的特定截面上发射的荧光通过。显微镜单元250是通用荧光显微镜，其在半棱镜251上反射从扫描单元230入射的泵浦光和消除光，并且利用显微镜物镜252将光会聚在要观察的、包含有三种电子状态 (至少包括基态)的分子的样本上。另外，样本253上发射的荧光再次通过物镜252准直并且在半棱镜251上反射，从而返回至扫描单元230，而穿过半棱镜251的一部分荧光被导向目镜254，从而被可视地观察为荧光图像。根据这种超高分辨率显微镜，除了靠近光轴(在那里，消除光的强度在样本253的聚焦点上变为零)的荧光以外，其它荧光都被控制，结果，能够仅测量在比泵浦光的宽度窄的区域中的荧光标记(Iabeler)分子。因此，通过在计算机上按二维排列每个测量点处的荧光信号，可以形成分辨率超出衍射极限的空间分辨率的显微镜图像。应注意到，调制光学部件可以被设置成调制消除光的偏振，以便生成抵消光轴上的电场的中空消除光(例如，参见Y. Iketaki等人的Rev. Sci. Instrum 75(2004)5131)。另外，调制光学部件可以设置在泵浦光和消除光的公共光路上(例如，参见日本专利特开 No. 2010-150260)。在这种情况下，调制光学部件被形成为具有同心分离的中央区域和外周区域的环状。该中央区域具有形成在透明光学基板(如玻璃基板等)上的光学多层，以反射泵浦光而使消除光相位反转η而透过。该外周区域例如由光学基板形成，并且使泵浦光和消除光无相位调制地透过。另选的是，调制光学部件具有围绕光轴径向划分的多个区域， 每个区域都由光学多层形成，以使泵浦光以相同相位透射，而调制消除光的相位，以便形成相位分布按2 31旋转的拉盖尔高斯(Laguerre-Gaussian)光束。
发明内容
根据本发明第一方面的显微镜包括调制光学元件，该调制光学元件具有用于对照明光进行空间调制的多个区域；以及调节元件，该调节元件用于调节由所述调制光学元件进行了调制的照明光的光学特性。本发明的第二方面是根据本发明第一方面的显微镜，其中，所述调节元件对已经通过了所述调制光学元件的照明光进行调节，使得光轴周围的透射率和相位中的至少一方的非对称分量在所述调制光学元件的所述多个区域之间抵消。本发明的第三方面是根据本发明第一方面的显微镜，其中，假设Si表示由所述调制光学元件空间调制的照明光的光瞳面上的与所述多个区域相对应的各个区域i的尺寸，θ i表示通过了区域i的光的相位，Ti表示透射率，Ui表示能量密度，则所述调节元件按满足以下关系式的方式进行调节
权利要求
1.一种显微镜，该显微镜包括调制光学元件，该调制光学元件具有用于对照明光进行空间调制的多个区域；以及调节元件，该调节元件用于调节由所述调制光学元件进行了调制的照明光的光学特性。
2.根据权利要求1所述的显微镜，其中，所述调节元件对已经通过了所述调制光学元件的照明光进行调节，使得光轴周围的透射率和相位中的至少一方的非对称分量在所述调制光学元件的所述多个区域之间抵消。
3.根据权利要求1所述的显微镜，其中，假设Si表示由所述调制光学元件空间调制的照明光的光瞳面上的与所述多个区域相对应的各个区域i的尺寸，θ 1表示通过了区域i的光的相位，Ti表示透射率，Ui表示能量密度，则所述调节元件按满足以下关系式的方式进行调节
4.根据权利要求1所述的显微镜，其中，所述调节元件一体地形成在所述调节光学元件中。
5.根据权利要求1所述的显微镜，其中，作为所述多个区域，所述调制光学元件包括绕光轴径向划分的多个区域。
6.根据权利要求5所述的显微镜，其中，假设对于所述调制光学元件的所述多个区域， 区域a具有透射率Ta、尺寸&和相位θ a，而隔着所述光轴与区域a相对的区域b具有透射率Tb、尺寸&和相位θ b，则满足下面的等式，TaSaSin θ a+TbSbsin θ b = 0。
7.根据权利要求6所述的显微镜，其中，所述区域a和所述区域b具有相同尺寸。
8.根据权利要求1所述的显微镜，其中，作为所述多个区域，所述调制光学元件包括同心划分的多个区域。
9.根据权利要求1所述的显微镜，其中，所述照明光具有第一照明光和第二照明光，所述第一照明光通过将具有至少两个激发量子态的材料从稳定态激发至第一量子态而使该材料发光，所述第二照明光通过使所述材料进一步跃迁至另一量子态而抑制发光；所述显微镜还包括照明光学系统，该照明光学系统包括物镜，该物镜通过局部地使得所述第一照明光和所述第二照明光交叠来将这些光会聚在包括所述材料的试样上；并且所述调制光学元件和所述调节元件设置在所述照明光学系统中。
10.根据权利要求9所述的显微镜，其中，所述调制光学元件调制所述第二照明光的相位。
11.根据权利要求10所述的显微镜，其中，所述调制光学元件使所述第一照明光透射， 而不改变电场的符号。
12.根据权利要求11所述的显微镜，其中，所述调制光学元件具有光学多层。
13.根据权利要求9所述的显微镜，其中，所述照明光学系统按空间匹配方式交叠所述第一照明光的光轴和所述第二照明光的光轴。
14.根据权利要求13所述的显微镜，其中，所述照明光学系统具有单模光纤；并且所述第一照明光和所述第二照明光经由所述单模光纤入射在所述调制光学元件和所述调节元件上。
15.根据权利要求9所述的显微镜，其中，所述调节元件包括用于调节所述照明光的光通量的直径的光阑。
16.根据权利要求15所述的显微镜，其中，所述光阑能够在与进入的照明光的光轴正交的方向上移动。
17.根据权利要求9所述的显微镜，该显微镜包括多个照明光源，这些照明光源能够产生至少三种波长的照明光，其中，从所述多个照明光源同时产生所述第一照明光和所述第二照明光。
18.根据权利要求17所述的显微镜，该显微镜包括光检测器，该光检测器检测所述试样在被来自所述照明光学系统的所述第一照明光和所述第二照明光照射时发出的光；共焦针孔，该共焦针孔具有尺寸可变的孔径，设置在所述光检测器的入射侧的与所述物镜的焦点位置共轭的位置处；驱动单元，该驱动单元改变所述共焦针孔的所述孔径的尺寸；以及控制单元，该控制单元通过控制所述多个照明光源来同时产生所述第一照明光和所述第二照明光，并且还根据所述第一照明光和所述第二照明光，经由所述驱动单元控制所述共焦针孔的所述孔径，以满足下式NA 物镜的数值孔径 M 光检测器在物侧会聚像的倍率 λ p:第一照明光的波长 λ…第二照明光的波长 ο dip 荧光抑制截面积 Ce0 第二照明光的峰值强度 ε 第二照明光的光子通量。
全文摘要
本发明提供一种显微镜，该显微镜能够在焦平面上按希望形状形成射束点。该显微镜设置有调制光学元件(38)和调节元件(37)，所述调制光学元件(38)具有用于对照明光进行特殊调制的多个区域，所述调节元件(37)用于调节由所述调制光学元件进行了调制的照明光的光学特性。
文档编号G01N21/64GK102288588SQ20111016240
公开日2011年12月21日 申请日期2011年6月16日 优先权日2010年6月17日
发明者池泷庆记 申请人:奥林巴斯株式会社