专利名称：一种应用于转基因作物根际土壤微生态安全性评价的pcr-dgge技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种应用于转基因作物根际土壤微生态安全性评价的PCR-DGGE技术，属转基因生物安全性评估和微生物生态学领域。
背景技术：
自1983年世界上首例转基因植物获得成功以来，利用基因工程对农作物进行改良和优化后在提高产量、改善农产品营养成分、缩短育种周期、增强抗病虫性等方面均取得了巨大成就。许多转基因作物如玉米、棉花、大豆等已经进入了商业化生产。然而这些转入了外源基因的作物是否会给人们带来不可预料的风险却备受争议，转基因作物的安全问题也是目前国际社会关注的热点。土壤是生态系统中物质循环和能量转化的重要场所，土壤生态系统的稳定与否直接关系到赖以其生存的作物的生长和发育，并最终影响到整个农业系统的稳定性。土壤生态系统中蕴含着极其丰富的微生物群落，参与土壤中诸多生物化学过程、营养物质循环、有机物的分解转化等，是土壤养分转化及有机物质分解的基础。土壤微生物在生态系统中起着举足轻重的作用，是土壤生态系统的重要组成部分，其多样性与活性的保持是农业生态系统健康、稳定的基础，因此，评价转基因作物对土壤微生物数量、群落结构及功能的影响具有重要的生态学意义。目前，国内关于转Bt基因水稻对根际土壤微生物群落结构影响的研究主要采用传统的微生物培养方法，误差极大，远不如分子生物学方法准确、简便、直观。变形梯度凝胶电泳(DGGE)技术因稳定性强，重复性好，灵敏度高，能提供群落中优势种群信息并且可同时分析多个样品等优点，被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。目前国内外关于运用PCR-DGGE技术进行转Bt基因作物对根际土壤微生物安全性评价的报道较少，建立适用于评价转Bt基因作物对根际土壤微生物群落结构影响的PCR-DGGE技术，对于完善转基因作物土壤生态安全评价技术体系至关重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种快速、稳定、直观的应用于转基因作物根际土壤微生态安全性评价的PCR-DGGE技术，以解决传统培养方法工作量繁重、误差大、 不全面、分辨水平低等问题，从而将PCR-DGGE技术成功应用于转基因作物对根际土壤微生态安全性评价中。本发明根据植物根际土壤特性，结合土壤微生物多样性研究方法，摸索出一种适用于评价转基因作物根际土壤微生物群落影响的PCR-DGGE技术体系，该技术可以不经过培养而直接提取根际土壤微生物基因组总DNA。DNA分子的种类及相对比例可以反应土壤样品中微生物种群的数量及相对比例，使在获得的DGGE图谱中，每一条带可以代表一种微生物的基因组DNA片段，即条带信息反应该样品微生物群落组成，这样根际土壤微生物群落结构信息就被间接的记录在DGGE图谱上，分析该图谱并结合聚类分析就可以比较分析转基因作物对根际土壤微生物群落的影响。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现。本发明所述的应用于转基因作物根际土壤微生态安全性评价的PCR-DGGE技术， 具体包括以下步骤1)收集不同生育期的转基因作物、非转基因作物的根际土壤样品，进行基因组 DNA提取通过采用酶裂解、化学裂解并结合反复冻融裂解法，以及重复氯仿、异戊醇抽提步骤，有效提高了细胞裂解效率和DNA得率，并减少了土壤中腐植酸、有机分子等杂质对核酸提取和PCR扩增过程的抑制作用，提高了所得DNA的纯度。其中，所述的生育期包括苗期、分蘖期、拔节期、抽穗期、成熟期；所述的转基因作物优选转Bt基因作物，更优选转Bt基因水稻。2)分别用细菌、真菌、放线菌的特异性引物对对上述提取的各基因组DNA片段进行PCR扩增，扩增程序采用降落PCR由于DGGE电泳要求在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段，扩增所用一条引物的5’-端含有一段约40bp的GC夹子，其退火温度较高，使得使用常规的PCR扩增方法效率较低。因此，本发明设计了一种降落PCR扩增方法，即以高于退火温度10°C的温度为起点，每个循环降低0. 5°C，反应20个循环后温度降为退火温度，在此退火温度下再进行15 个循环，从而大大提高了 PCR扩增质量及扩增效率。具体来讲，本发明采用种群特异性引物，即细菌引物对341f_GC/518r、真菌引物对 NS7-GC/NS8、放线菌引物对R513-GC/F243分别针对性的研究了不同生育期转Bt基因和非转Bt基因作物根际土壤中主要的三大类微生物群落的结构。其中细菌引物对序列如下341f-GC :cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg cctacgggag gcagca (参看 SEQ ID No 1)；518r :gtattaccgc ggctgctgg(参看 SEQ ID No 2)；真菌引物对序列如下NS7-GC :cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccc aggcaataac aggtctg (参看 SEQ ID No 3)；NS8 :tccgcaggtt cacctacgga(参看 SEQ ID No 4)；放线菌引物对序列如下R513-GC :cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccc cgcggctgct ggcacgta (参看 SEQ ID No 5)；F243 :ggatgagccc gcggccta (参看 SEQ ID No 6)。PCR 反应体系(50μ 1) :2. 5mmol/l MgCl2,0. 2mmol/l dNTPs，0. 2pmol/L 引物， IXPCR buffer (试剂盒)，IU Taq DNA聚合酶(试剂盒)，1 μ 1 DNA模板，ddH20补齐。每个基因组样品平行扩增3管，混合之后用于后续试验。降落PCR扩增程序94 V解链5min ；94 V解链45s，55 °C (细菌)/50 V (真菌)/63°C (放线菌)退火45s，72°C延伸45s，运行32个循环；72°C延伸lOmin。PCR扩增产物通过1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测。3)DGGE电泳分离得指纹印记图谱^t DCode Universal Mutation Detection System(Bio-Rad)巾iiif DGGE ^}。 具体为在7. 5%的聚丙烯酰胺凝胶上，200V电压、60°C温度下运行5个小时，细菌、真菌和放线菌DGGE电泳的变性剂浓度梯度分别是20-70%、30-60%和30_70%。其中100%变性剂中含有7M的尿素和40% (ν/ν)的去离子甲酰胺。电泳后，在400ml 0. 25 μ g/ml的溴化乙锭溶液中染色，洗涤数次后于Gel Doc2000紫外凝胶成像系统(Bio-Rad，USA)上成像检测。4)对图谱进行数字化处理及聚类分析首先应用Bio-rad的Quantity One软件获得DGGE图谱的数字化信息，然后使用 NTSYSpc软件分析获得UPGMA聚类图，从而直观比较转基因作物与非转基因亲本作物根际土壤微生物群落结构的差异。有益效果本发明建立了一种适用于评价转基因作物对根际土壤微生物群落结构影响的 PCR-DGGE技术体系，为转基因植物的土壤微生物安全性评价体系的建立提供了新的思路和依据。此方法直接提取根际土壤样品中总DNA，避免了传统培养过程中的筛选和富集作用， 能更真实、直接的反应根际土壤样品中微生物多样性及群落组成情况，与传统方法相比，节省了大量时间和财力，避免了传统方法菌种培养和筛选过程导致的微生物信息的缺失。另外此方法又可同时分析多个土壤样品，从而更直观、客观地分析不同样品间微生物群落结构差异。
图1为不同生育期转Bt基因水稻与非转Bt基因水稻亲本根际土壤DNA提取的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DNA分子量标准DL15000，1 10依次为苗期Bt，苗期non Bt ； 分蘖Bt，分蘖non Bt ；拔节Bt，拔节non Bt ；抽穗Bt，抽穗non Bt ；成熟Bt，成熟non Bt。 其中苗期Bt指苗期转Bt基因水稻，苗期non Bt指苗期非转Bt基因水稻，其他类推。图2为PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中A为细菌，B为真菌，C为放线菌； M为DNA分子量标准DL2000，0为空白对照，1 10与图1所述相同。图3为不同生育期转Bt基因水稻与非转Bt基因水稻亲本根际土壤细菌、真菌、放线菌的DGGE电泳图，其中A为细菌，B为真菌，C为放线菌；1-10与图1所述一致。图4为不同生育期的转Bt基因水稻与非转Bt基因水稻亲本根际土壤细菌、真菌、 放线菌的UPGMA聚类图，其中A为细菌，B为真菌，C为放线菌，其中苗期Bt指苗期转Bt基因水稻，苗期non Bt指苗期非转Bt基因水稻，其他类推。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。实施例1
以转Bt基因水稻为研究对象，采用PCR-DGGE技术研究盆栽条件下不同生育期 (如苗期、分蘖、拔节、抽穗、成熟)下该转Bt基因水稻与非转Bt基因水稻亲本根际土壤的微生态安全性情况。1)转Bt基因水稻与非转Bt基因水稻根际土壤微生物基因组DNA的提取分别提取转Bt基因水稻与非转Bt基因亲本水稻在各个生育期的根际土壤，采用反复冻融法进行DNA提取将0. 5g样品放入2ml离心管中，加入Iml抽提缓冲液(lOOmmol/L Tris-HCl, 1 OOmmo 1/L EDTA (pH 8. 0)，IOOmmol/L 磷酸钠缓冲液(pH 8. 0)，1. 5mol/L NaCl，
CTAB)，加入 50 μ 1 浓度为 100mg/ml 的溶菌酶，37°C水浴 IOmin ；加入 200 μ 1 20% SDS, 65°C水浴0. 5h ；6000Xg离心5min ；取上清液，分别置于_70°C超低温冰箱中及微波炉中反复冻融三次，6000Xg离心5min;上清液中加入等体积氯仿异戊醇(体积比对1)， 6000Xg离心lOmin，收集上层水相，重复抽提一次；加入0. 6倍等体积异丙醇过夜沉淀， 12000Xg离心IOmin ；沉淀用70%预冷的冰乙醇洗涤1次，室温下晾干后用100 μ 1 TE溶解沉淀。应用同样方法，提取了非转Bt基因水稻各个生育期的根基土壤基因组DNA。图1为不同生育期转Bt基因水稻与非转Bt基因水稻亲本根际土壤基因组DNA 提取的琼脂糖凝胶电泳图。可以看出，从根际土壤样品中提取得到了较高质量的的基因组 DNA，点样孔无蛋白残留，基因组无拖尾现象。因此，使用该方法获得了完整、无降解、纯度高的各个生育期的转Bt基因水稻和非转Bt基因的根际土壤基因组DNA，充分说明该提取方法适用于转基因植物根际土壤基因组DNA的获取。2)分别用细菌、真菌、放线菌的特异性引物对对上述提取的不同生育期的各基因组DNA片段进行PCR扩增，扩增程序采用降落PCR其中采用的特异性引物对分别为细菌引物对341f_GC/518r、真菌引物对NS7-GC/ NS8、放线菌引物对R513-GC/F243。细菌的引物对序列如下341f-GC :cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg cctacgggag gcagca (参看 SEQ ID No 1)；518r :gtattaccgc ggctgctgg(参看 SEQ ID No 2)；真菌的引物对序列如下NS7-GC :cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccc aggcaataac aggtctg (参看 SEQ ID No 3)；NS8 :tccgcaggtt cacctacgga(参看 SEQ ID No 4)；放线菌的引物对序列如下R513-GC :cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccc cgcggctgct ggcacgta (参看 SEQ ID No 5)；F243 :ggatgagccc gcggccta (参看 SEQ ID No 6)。PCR 反应体系(50μ 1) :2. 5mmol/l MgCl2,0. 2mmol/l dNTPs，0. 2pmol/L 引物， IXPCR buffer (Fermentas)，IU Taq DNA 聚合酶(Fermentas)，1 μ 1 DNA 模板，ddH20 补齐。 每个基因组样品平行扩增3管，混合之后用于后续试验。扩增程序如下94 V解链5min ；94 V解链45s，55 °C (细菌)/50 V (真菌)/63°C (放线菌)退火45s，72°C延伸45s，运行32个循环；72°C延伸IOmin。PCR扩增产物通过1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果参看图2。可以看出三对引物对扩增后分别获得了长度约为200bp、350bp、310bp不等的细菌、真菌、放线菌DNA片段， 扩增产物条带单一，扩增效果良好。3)DGGE电泳分离得指纹印记图谱将上述扩增得到的DNA片段进行DGGE电泳，DGGE电泳在DCode Universal Mutation Detection System(Bio-Rad)中进行。即在7. 5%的聚丙烯酰胺凝胶上，200V电压、60°C温度下运行5个小时，其中细菌、真菌和放线菌DGGE电泳的变性剂(100%变性剂含有7M的尿素和40% (ν/ν)的去离子甲酰胺)浓度梯度分别是20-70^^30-60%和30-70%。 电泳后，在400ml 0. 25 μ g/ml的溴化乙锭溶液中染色，洗涤数次后于Gel Doc2000紫外凝胶成像系统(Bio-Rad，USA)上成像检测，结果如图3所示。可以看出转Bt基因水稻与非转Bt基因水稻根际土壤细菌和放线菌的DGGE指纹图谱在同一生育时期的差异不大，只有一些微弱的变化，然而真菌的DGGE图谱差异稍微明显；另外，在不同生育期内转Bt基因水稻与非转Bt基因水稻的根际土壤细菌、真菌及放线菌群落均表现出差异性，这可能与水稻不同生育期的生理代谢不同有关。由此可见，从DGGE图谱可以直观的分析比较转Bt基因水稻与非转Bt基因水稻根际土壤微生物群落结构的差异，从而判断转Bt基因水稻对根际土壤微生物群落结构的影响程度。4)对图谱进行数字化处理及聚类分析首先应用Bio-rad的Quantity One软件获得DGGE图谱的数字化信息，然后使用NTSYSpc软件对不同生育期转Bt水稻与非转Bt水稻根际土壤细菌、真菌、放线菌进行 UPGMA聚类分析，结果如图4所示。结果可以看出在苗期转Bt基因水稻与非转Bt基因水稻根际土壤细菌、真菌、放线菌群落的相似性分别为83^^78^^89%,在各生育期中相似性最高；在分蘖期转Bt基因水稻与非转Bt基因水稻根际土壤细菌和真菌群落未聚在一起，表现一定的差异性，而放线菌群落有高达80 %的相似性；在拔节期转Bt基因水稻与非转Bt 基因水稻根际土壤细菌群落有80%的相似性，真菌群落相似性较低，放线菌群落有72%的相似性；抽穗期转Bt基因水稻与非转Bt基因水稻根际土壤细菌、真菌、放线菌群落的相似性分别为70^,52^,80% ；在成熟期转Bt基因水稻与非转Bt基因水稻根际土壤细菌、真菌、放线菌群落的相似性是相对各生育期中最低的，分别为61 %，41 %和72%。从上述相似性指数可以看出，转Bt基因水稻与非转Bt基因水稻根际土壤细菌和放线菌群落结构在同一生育期内差异较小，只有真菌群落差异稍大；在不同生育期内三个微生物群落具有一定差异。从上述试验可以确定本发明所采用的土壤微生物基因组DNA提取方法、PCR扩增方法及其DGGE电泳技术对于研究转Bt基因作物对根际土壤微生物群落结构的影响是可行的。并且本发明用非加权配对算数平均法UPGMA聚类分析方法比较了转Bt基因水稻与非转Bt基因水稻对根际土壤微生物群落结构的影响，成功地鉴别了不同生育期转Bt基因水稻与非转Bt基因水稻根际土壤微生物群落结构差异，此方法也可应用于评价其他转Bt基因作物对根际土壤中微生物群落结构影响的研究。
权利要求
1.一种应用于转基因作物根际土壤微生态安全性评价的PCR-DGGE技术，其特征在于， 包括以下步骤1)收集不同生育期的转基因作物、非转基因作物的根际土壤样品，进行基因组DNA提取；2)分别用细菌、真菌、放线菌的特异性引物对对上述提取的各基因组DNA片段进行PCR 扩增，扩增程序采用降落PCR;3)DGGE电泳分离得指纹印记图谱；4)对图谱进行数字化处理及UPGMA聚类分析。
2.根据权利要求1所述的PCR-DGGE技术，其特征在于，所述的生育期包括苗期、分蘖期、拔节期、抽穗期、成熟期。
3.根据权利要求1所述的PCR-DGGE技术，其特征在于，所述转基因作物优选转Bt基因作物。
4.根据权利要求1所述的PCR-DGGE技术，其特征在于，采用酶裂解、化学裂解并结合反复冻融裂解法，以及重复氯仿、异戊醇抽提步骤，进行基因组DNA提取。
5.根据权利要求1所述的PCR-DGGE技术，其特征在于，所述细菌、真菌、放线菌的特异性引物对序列如SEQ ID No 1 6所示。
6.根据权利要求1所述的PCR-DGGE技术，其特征在于，所述降落PCR扩增程序以高于退火温度10°c的温度为起点，每个循环降低0. 5°C，反应20个循环后温度降为退火温度，在此退火温度下再进行15个循环。
7.根据权利要求1所述的PCR-DGGE技术，其特征在于，所述DGGE电泳是在7.5 %的聚丙烯酰胺凝胶上，200V电压、60°C温度下运行5个小时，细菌、真菌和放线菌DGGE电泳的变性剂浓度梯度分别是20-70%、30-60%和30-70%。
8.根据权利要求1所述的PCR-DGGE技术，其特征在于，所述对图谱进行数字化处理及聚类分析是指首先应用Bio-rad的Quantity One软件获得DGGE图谱的数字化信息，然后使用NTSYSpc软件做聚类分析。
9.权利要求1 8任一项所述的PCR-DGGE技术在转基因作物根际土壤微生态安全性评价中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种应用于转基因作物根际土壤微生态安全性评价的PCR-DGGE技术，具体包括以下步骤1)收集不同生育期的转基因作物、非转基因作物的根际土壤样品，进行基因组DNA提取；2)使用细菌、真菌、放线菌的特异性引物对对上述提取的各基因组DNA片段进行PCR扩增，扩增程序采用降落PCR；3)DGGE电泳分离得指纹印记图谱；4)对图谱进行数字化处理及UPGMA聚类分析。本发明可用于评价转基因作物对根际土壤微生物群落结构的影响，并由此评价转基因作物对根际土壤微生态系统的潜在安全风险。
文档编号G01N27/447GK102286618SQ20111020619
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月22日 优先权日2011年7月22日
发明者唐雪明, 朱宏, 王金斌, 程凯, 赵凯, 魏曼曼 申请人:上海市农业科学院