专利名称：用于肥料和肥料添加剂中双氰胺的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种(应用高效液相色谱法)检测双氰胺含量的方法，特别是一种用于肥料和肥料添加剂中双氰胺的测定方法(高效液相色谱检测法)。
背景技术：
双氰胺(D⑶)，也称为二氰二胺，是一种已被公认价廉质优的硝化抑制剂，是在生产实际中得到应用的为数不多的硝化抑制剂之一。1918年首次报道双氰胺具有硝化抑制特征，上世纪七、八十年代美国开始把它作为一种硝化抑制剂商品在农业上推广应用，前西德SKW公司利用双氰胺注册了商品名为Didin的硝化抑制剂产品，国内中国科学院沈阳应用生态研究所等科研院所以及部分肥料生产企业，也都利用双氰胺生产长效新型肥料、稳定性肥料、肥料增效剂等产品。当前双氰胺已在国内外广泛应用于缓释肥料或肥料添加剂的生产，系列产品受到世界各国的关注，尤其是在中国、美国和欧洲的市场上。双氰胺在肥料或肥料添加剂的生产过程中，部分将分解产生氨(双氰胺水溶液在 80°c以上时易分解)，必将影响着肥料或肥料添加剂成品中双氰胺的含量，从而影响其应用效果。农田双氰胺的应用，大多的研究结果支持适量的双氰胺对环境和作物无毒害作用的结论(双氰胺在土壤中70天左右降解)，但也有研究表明，双氰胺易随水淋失，施用不当或过量时，容易对作物造成毒害甚至在农产品中残留。双氰胺在肥料或肥料添加剂加工生产中降解情况如何，含有双氰胺的肥料或肥料添加剂中的双氰胺淋失进入水体为人体吸入， 以及过量双氰胺导致的农残为人体食用是否会影响人类健康目前尚无确切报道。双氰胺微毒或基本无毒，急性毒性很小，在药品生产上，双氰胺作为药物加工中间体，是国内外药物成品中必要的检测项。双氰胺作为单氰胺的二聚体，其对小鼠毒害症状与单氰胺三聚体三聚氰胺类似，13000mg/kg剂量的双氰胺和三聚氰胺给药后的小鼠出现一致毒害症状，均出现不安，跳跃，呼吸急促，随后在几十分钟内便死亡。含双氰胺的肥料或肥料添加剂长期或过量施用，其中的双氰胺是否会像三聚氰胺成为一种潜在的危险试剂目前不得而知。因此，虽然目前尚未发现农业生产上出现的施用含双氰胺的肥料或肥料添加剂引起的淋失和农残的现象，尽管如此，鉴于双氰胺作为药物的必要检测项，以及其具有与三聚氰胺相似的小鼠毒害症状，科研人员和生产应用者很有必要对广泛应用于肥料或肥料添加剂生产中的双氰胺进行监测，明确双氰胺的实际含量，防患于未然。目前国内应用高效液相色谱法对双氰胺的测定，都集中在对药物如盐酸二甲双胍片、盐酸苯乙双胍等中杂质双氰胺的检测，其中双氰胺主要是作为药物加工中间体使用，检测方法大多参照2005年版《中华人民共和国药典》中的方法或修订的方法来测定双氰胺含量。这些方法的不足之处在于，色谱柱价格较高、寿命短，色谱分离时双氰胺峰(峰值)的保留时间较短，难于与溶剂峰基线分离，专属性不够强，色谱条件重现性欠佳，检测限较高， 检测灵敏度较低，难以满足微量双氰胺的检测要求等等。此外，更为关键的是应用其中某些方法的色谱条件来检测肥料中的双氰胺含量，未能很好的将双氰胺色谱峰与其它杂峰分开。我国目前对双氰胺作为硝化抑制剂添加入肥料或作为肥料添加剂成分之一的监测尚缺乏，即针对肥料或肥料添加剂中双氰胺含量的检测尚缺乏，因此，很有必要结合我国的实际情况，探索一种适合于肥料和肥料添加剂中双氰胺的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于肥料和肥料添加剂中双氰胺的测定方法(高效液相色谱检测法)，使得成为一种检测限低、检测灵敏度高、回收率高和快速的高效液相色谱检测法。本发明的创新思路是采用高效液相色谱法对肥料和肥料添加剂中双氰胺含量进行检测时，都需要摸索和寻找合适的色谱条件，包括色谱柱、流动相、流速、进样体积、柱温、 柱压、检测波长等。此外，还需要确定一套与提取方法相匹配的检测方法，这些都直接关系到提取和检测方法的回收率、准确性和灵敏度。所以，为了实现上述目的，本发明需要探索建立一种适用于肥料和肥料添加剂中双氰胺的提取条件和新的色谱条件。鉴于以上创新思路，本发明所提供的一种用于肥料和肥料添加剂中双氰胺的测定方法，其特征在于该测定方法包括如下步骤①备好双氰胺标准溶液，及样品前处理其中样品前处理是指称取定量的样品(包括肥料样品和/或肥料添加剂样品)，加入2倍体积的超纯水，超声提取离心后，上清液经过滤器过滤后得到样品滤液，加水定容；②样品测定 将样品滤液和备好的双氰胺标准溶液分别注入高效液相色谱中，按照色谱条件测定标准溶液和样品中双氰胺吸收峰面积；③结果计算通过双氰胺标准溶液的浓度与对应吸收峰面
ν ν /-C
积的线性关系曲线，查得样品滤液中双氰胺的浓度，按照F = ^公式计算样品中双
m
氰胺的含量。式中W-试样中双氰胺的质量分数，mg/kg ；C-由标准曲线上查出的样液中双氰胺的浓度，ug/mL ；V-样液最终定容体积，mL ；ts_分取倍数；m-试样质量(烘干样质量)，g。上述样品处理为准确称取10. 000-20. OOOg的肥料或肥料添加剂样品，加入40mL 的超纯水，超声提取30min，提取液4000r/min离心lOmin，上清液用0. 45um的针头式过滤器过滤，过滤后定容至50mL。上述双氰胺标准溶液制备为准确称取0. OOlg双氰胺分析纯试剂，用超纯水定容至100ml，得Cfe= 100ug/mL，置于4°C冰箱中保存。上述使用仪器为Waters Alliance沈95二极管阵列检测器，色谱条件为色谱柱采用Waters XTerra RP-18 (4. 6mmX 150mm, 5um)；流动相A为乙腈，流动相B为四丁基硫酸氢铵((C4H9)4NHSO4)和磷酸二氢钠(NaH2PO4)混合液，流动相A与流动相B的体积比为(流动相A 流动相B为)5 95，流速为0. 7000mL/min,进样体积为IOuL ；柱温为30°C，柱压为 14Mpa,紫外检测波长为220nm。上述高效液相色谱法在2. 60-3. 30min有一专一的色谱峰，该峰与标准溶液中的色谱峰一致，为双氰胺的特征吸收峰。
由于目前国内应用高效液相色谱法测定双氰胺主要是针对药品中杂质双氰胺的测定，若应用已有技术的样品制备、色谱条件及检测波长来测定肥料料和肥料添加剂中双氰胺含量，其它物质可能与双氰胺色谱峰有重叠，不能准确检测双氰胺含量。与现有技术相比，本发明具有以下优点本发明适用于肥料和肥料添加剂中双氰胺含量的测定，且不受其它杂峰的干扰，该方法快速(方法简单、易行)、灵敏度高(检测的精度高)、检测限低、回收率高。使用本发明的高效液相色谱法测定肥料和肥料添加剂中双氰胺含量，提取过滤后的固体样品检测限为0. lmg/kg,回收率为91. 27% 98. 48%。
四
图1为双氰胺标准品色谱图；图2为一种含有双氰胺的缓释复合肥样品色谱图；图3为一种含有双氰胺的肥料添加剂样品色谱图。
五具体实施例方式利用高效液相色谱法对一种缓释肥料和肥料添加剂中双氰胺的含量进行检测1、仪器设备Waters Alliance洸95高效液相色谱仪，配有Waters四96 二极管阵列检测器。2、选用试剂乙腈(色谱纯)；四丁基硫酸氢铵Qmmol/L)准确称取0. 679g四丁基硫酸氢铵分析纯试剂，用超纯水定容至IOOOml ；磷酸二氢钠05mmol/L)准确称取3. OOOg磷酸二氢钠分析纯试剂，用超纯水定容至 IOOOml ；双氰胺标准液准确称取0. OOlg双氰胺分析纯试剂，用超纯水定容至100ml，得C 标=100ug/mL，置于4°C冰箱保存。3、操作步骤①样品处理准确称取10. 000-20. OOOg的缓释肥料或肥料添加剂，加入一定量的超纯水，超声提取30min，提取液4000r/min离心lOmin，上清液用0. 45um的针头式过滤器过滤，过滤后定容至50mL，供高效液相色谱测定。②样品测定将双氰胺标准溶液，样品滤液注入高效液相色谱中，按照色谱条件测定标准溶液和样品中双氰胺吸收峰面积。色谱条件为色谱柱采用Waters XTerra RP-18 (4. 6謹X 150mm, 5um)；流动相A为乙腈，流动相B为四丁基硫酸氢铵((C4H9) 4NHS04) 和磷酸二氢钠(NaH2PO4)混合液，流动相A与流动相B的体积比(流动相A 流动相B)为 5 95，流速为0. 7000mL/min,进样体积为IOuL ；柱温为30°C，柱压为14Mpa，紫外检测波长为 220nm。③标准曲线的绘制用流动相将双氰胺标准储备液逐级稀释得到浓度为1、10、 25、50、75、100ug/mL的标准工业液，浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。双氰胺浓度在1 lOOug/mL范围内，浓度与其对应的峰面积值呈良好线性关系，相关系数为0. 999。所得线性方程为:y = 134445x-102557(x为浓度，ug/mL ；y为峰面积，
UV * S)4、结果计算按如下公式计算妒=CxVxtS
m式中W-试样中双氰胺的质量分数，mg/kg ；C-由标准曲线上查出的样液中双氰胺的浓度，ug/mL ；V-样液最终定容体积，mL ；ts-分取倍数；m-试样质量(烘干样质量)，g。以3倍信噪比(S/N)计算出的固体样品检出限为0. lmg/kg，以10倍信噪比(S/N) 计算出的固体样品定量限为0. 33mg/kg。5、回收率设定3个添加量，将双氰胺与肥料样品充分混勻，对每个添加量重复测定6次。表1肥料添加双氰胺的回收率
权利要求
1.一种用于肥料和肥料添加剂中双氰胺的测定方法，其特征在于包括如下步骤①备好双氰胺标准溶液，及样品前处理其中样品前处理是指称取定量的样品，加入2倍体积的超纯水，超声提取离心后，上清液经过滤器过滤后得到样品滤液，加水定容；②样品测定 将样品滤液和备好的双氰胺标准溶液注入高效液相色谱中，按照色谱条件测定标准溶液和样品中双氰胺吸收峰面积；③结果计算通过双氰胺标准溶液的浓度与对应吸收峰面积的 线性关系曲线，查得样品滤液中双氰胺的浓度，按照# =-公式计算样品中双氰胺的m含量； 式中W"试样中双氰胺的质量分数，mg/kg ；C-由标准曲线上查出的样液中双氰胺的浓度，ug/mL ；V-样液最终定容体积，mL ；ts-分取倍数；m-试样质量(烘干样)，g。
2.根据权利要求1所述的用于肥料和肥料添加剂中双氰胺的测定方法，其特征在于 上述样品处理为准确称取10. 000-20. OOOg的新型肥料或肥料添加剂，加入40mL的超纯水，超声提取30min，提取液4000r/min离心lOmin，上清液用0. 45um的针头式过滤器过滤， 过滤后定容至50mL。
3.根据权利要求1所述的用于肥料和肥料添加剂中双氰胺的测定方法，其特征在于 上述双氰胺标准溶液制备为准确称取0. OOlg双氰胺分析纯试剂，用超纯水定容至100ml， 得Cfe= lOOug/mL，于4°C冰箱中保存。
4.根据权利要求1所述的用于肥料和肥料添加剂中双氰胺的测定方法，其特征在于上述使用仪器为Waters Alliance沈95 二极管阵列检测器，色谱条件为色谱柱采用 WatersXTerra RP-18 (4. 6mmX 150mm, 5um)；流动相A为乙腈，流动相B为四丁基硫酸氢铵 ((C4H9)4NHSO4)和磷酸二氢钠(NaH2PO4)混合液，动流相A与流动相B的体积比(流动相A 流动相B)为5 95，流速为0. 7000mL/min，进样体积为IOuL ；柱温为30°C，柱压为14Mpa， 紫外检测波长为220nm。
5.根据权利要求1所述的用于肥料和肥料添加剂中双氰胺的测定方法，其特征在于 上述高效液相色谱法在2. 60-3. 30min有一专一的色谱峰，该峰与标准溶液中的色谱峰一致，为双氰胺的特征吸收峰。
全文摘要
一种用于肥料和肥料添加剂中双氰胺的测定方法，其特征在于包括如下步骤备好双氰胺标准溶液，及样品前处理其中样品前处理是指称取定量的样品，加入2倍体积的超纯水，超声提取离心后，上清液经过滤器过滤后得到样品滤液，加水定容；样品测定将样品滤液和备好的双氰胺标准溶液注入高效液相色谱中，按照色谱条件测定标准溶液和样品中双氰胺吸收峰面积；结果计算通过双氰胺标准溶液的浓度与对应吸收峰面积的线性关系曲线，查得样品滤液中双氰胺的浓度，按照公式计算样品中双氰胺的含量。本发明的优点是方法快速、易行；检测限低(0.1mg/kg)；回收率高(91.27％～98.48％)。
文档编号G01N30/02GK102384948SQ20111022010
公开日2012年3月21日 申请日期2011年7月28日 优先权日2011年7月28日
发明者倪沁颜, 廖要要, 张潘丹, 张青, 江枝和, 王煌平, 程广强, 罗涛, 翁伯琦 申请人:福建省农业科学院土壤肥料研究所