专利名称：测定液体中的荧光的方法和装置的制作方法
测定液体中的荧光的方法和装置本发明涉及荧光的测定，特别是对液体中存在的荧光化合物的识别。使用荧光染料作为液体和固体本体材料的标记或标签是公知的技术。典型的应用是标记液体如碳氢燃料以在供应链中的后续点鉴定液体。做这些工作通常出于操作原因， 例如帮助区分燃料间的等级，或由于其它原因，特别是保证燃料的品质，阻止和检测掺假并提供检查是否正确纳税的方式。除了燃料，还可以标记其它产品，如植物油以确认产品由某特定来源生产，或证明达到特定的标准。对于检测用作标记物的荧光化合物的方法，当被标记的材料通过吸收激发光或发射光、通过显示其自身的背景荧光或者通过改变标记物的荧光特征而与标记物的荧光发生相互作用时，则会出现问题。在用荧光染料标记有色液体，如石油衍生产品时，这尤其成为问题。烃基液体，例如燃料，显示宽的荧光发射。荧光背景倾向于增强染料的任何荧光信号，但液体固有的吸收会减少染料的荧光。标记这些燃料，特别是汽油和柴油，是标记化合物的重要应用，且对于在这些有价值和广泛的产品中使用这些标记物，高精度地检测单一或多种标记化合物的能力是至关重要的。该问题已通过多种方式解决，多数涉及通过萃取到极性液体中或固体吸附剂上的方式从液体中分离标记化合物。例如，US5，358，873说明并要求保护检测汽油掺假的方法，该方法通过用若丹明染料标记，然后在含有少量无粘结快速色谱级二氧化硅的小瓶中摇动少量可疑燃料。可疑样品中存在的若丹明标记染料使二氧化硅变红。US 4，659，676描述了通过溶解到卟啉中制备的荧光标记的络合疏水性液体。 通过观测照射时的特征荧光来鉴定荧光标记的络合疏水性液体。为达到鉴定目的，首先将卟啉萃取到酸性水溶液中以检测荧光。US 2，392，620描述了使用伞形酮或衍生物作为石油的荧光标记物，并通过测定萃取到碱性水溶液后的特征荧光来进行检测。US4，735，631中， 用某些取代的蒽醌标记燃料，随后通过萃取到不混溶的碱性试剂中来检测标记的燃料样品中的蒽醌。本发明的目的是提供检测存在的荧光材料的方法，该方法克服了这些现有方法的至少一些缺陷。根据本发明，我们提供测定溶解或分散在本体材料中的荧光标记化合物的荧光的方法，包括步骤(a)测定所述本体材料和所述荧光标记化合物的混合物的荧光特征；(b)猝灭荧光标记化合物的荧光以得到猝灭混合物；(c)测定所述猝灭混合物的荧光特征；(d)比较所述混合物的荧光特征和所述猝灭混合物的荧光特征；和(e)针对本体材料的吸收的影响来校正测定的荧光发射特征。根据本发明的第二方面，我们提供适于在实施任一前面要求的方法中使用的装置，所述装置包括(a)至少一个激发光源，其能够发射选定波长的光，该选定波长的光激发至少一种荧光标记化合物的可检测荧光；(b)至少一个检测所述至少一种荧光标记化合物发射的荧光的光检测设备；
(c)至少一个吸收光源，其能够发射选定波长的光，该选定波长的光不激发任何荧光标记化合物的可检测荧光，但能被本体材料吸收；(d)至少一个用于检测所述吸收光源发射的穿过样品的光的光检测设备；(e)计算用户需要的关于校正的样品荧光信息的数据处理设备；和(f)控制所述装置的至少部分操作的控制设备。通过比较所述混合物所测定的荧光和所述猝灭混合物所测定的荧光，将它们的差别归因于标记化合物的荧光，从而能够在本体材料存在下估计混合物中标记化合物的性质或浓度的指示，而无需依赖分离步骤。虽然在测定其荧光前分离荧光化合物对于通过其特征荧光确定化合物的存在和身份是有用的，但分离步骤可能对确定本体材料中原本存在的化合物的量的任何尝试引入不确定性。相应地，鉴别本体材料的方法包括将含有至少一种荧光化合物的标记物加入所述本体材料以形成所述本体材料和所述荧光标记化合物的混合物的步骤，然后，使用本发明的荧光测定方法测定所述至少一种荧光化合物的荧光。本体材料可以是固体或液体，但优选为液体。液体可以为有机物或水溶液，且可以含有一种或多种溶解的成分或分散的成分。该材料通常为商业化产品，向其中加入标记化合物以在供应链或工业过程中的后续点确认该商业化产品。这些产品包括燃料，如石油和石油衍生产品，尤其是汽油、柴油、煤油、润滑油乙醇、酒精汽油、油脂和溶剂，还包括生物衍生燃料，如衍生自棕榈油、麻风树、黄豆等的油。该方法也可用于确认产品，如香水、墨水、清漆和涂料产品中的标记化合物。荧光化合物选自可获得的具有已知荧光特征(即在用不同的、更短的激发波长的光照射时发射发射波长的荧光)的化合物。为获得由荧光化合物引起的荧光和本体材料引起的荧光之间最清晰的解析，化合物的激发波长和发射波长的差别应当与本体材料中的任何物质尽量不同。现实中，获得这一区别的最好的方式是使用在用于激发它的辐射的波长和任何发射的辐射的波长之间显示最大可能区别的化合物。优选，但不是必须的，是使用产生最大的荧光发射的激发波长，并检测相应于最强发射的波长。激发波长和发射波长之间的差距与化合物的最大吸收波长和最大荧光发射波长之间的差距相类似，但不必相同，这进而通常称为斯托克斯位移(Stokes shift)。在后面的解释中，参考了任何跃迁并非严格与斯托克斯位移相对应的化合物的斯托克斯位移，如涉及其它振动能级的跃迁，也隐含了荧光谱中的子带，或者造成荧光发射的任何跃迁。典型地，有用的标记化合物的斯托克斯位移为至少lOnm，更普遍为至少20nm，通常至少50nm。当本体材料为固有荧光特性(例如汽油和柴油)或含有一种或多种处于未标记状态的荧光化合物时，本发明的一个实施例中优选使用具有比本体材料自身的斯托克斯位移更大的斯托克斯位移的荧光标记化合物。荧光标记化合物的激发波长通常处于从紫外到红外的范围内，即约200-1200nm。优选的荧光化合物包括激发和发射波长为约 350-850nm的荧光染料。这些染料可以吸收可见光区的光，即其可以具有可见的颜色，但用于有色本体材料中或者浓度非常低时，当与本体材料混合时它们是不可见的。合适的荧光材料包括任何现有技术说明的作为荧光标记物使用的材料和发现的适于这种用途的其它化合物。特别地我们要提到酞菁、萘酞菁、镍连二硫烯、胺鐺化合物、次甲基染料、奧四元酸染料、荧光素及其衍生物、取代蒽醌、偶氮染料、吓啉、香豆素、取代香豆素(包括伞形酮)、苯并吡喃及其衍生物，咕吨染料(包括若丹明)、噁嗪、克酮酸染料、萘二甲酰亚胺、萘并荧光酮(naphthofluorones)、半萘并荧光酮、三碳菁、双吲哚基马来酰亚胺、 1，3_ 二芳基-和1，3，5_三芳基-2-吡唑啉、吖啶、菲啶、二吡咯甲烷。
图1显示了一类基于取代的苯并吡喃的合适染料，其中R1为烷基取代基，其能够稠合到与氨基取代基毗邻的芳环上出2可以为亚氨基或羰基；这类优选的实例中，R1为丁基取代基，R2为亚氨基。以上所列出的，仅描述了可以用于本发明方法的宽泛种类的荧光化合物，只要存在能够猝灭出现于本体材料的化合物的荧光即可，而不意味对本发明的限制。还应选择与本体材料相容的荧光化合物，从而能够以标记所述材料所需的浓度溶解或分散在本体材料中。所以这些化合物可以离子形式使用，在能够获得时，用于极性液体或进行衍生以提高在各类有机液体中的相容性和溶解性。可以选择使这些化合物在本体材料中可见，例如显示出材料被标记，或者可选地，选择在本体材料中肉眼不可见，即为“沉默”标记物。选择合适的荧光化合物的其它标准包括它的毒性、价格、可获得性和在本体材料中的稳定性。一种或多种作为荧光标记化合物使用的荧光染料存在于本体材料中的浓度以所述染料不影响所检测的与本体材料相关的吸收是有益的。优选的是，不管媒介的颜色如何，低浓度的染料的荧光反应与浓度成比例。通过对混合物的物理处理，例如加热，或者通过对混合物的化学处理，例如改变混合物的PH、改变溶剂的极性、加入“漂白剂”例如氧化剂或还原剂或者化学猝灭化合物，可完成荧光的猝灭。猝灭荧光化合物的荧光改变了它的荧光特征。我们使用的“改变”包括激发或发射波长的改变，和/或发射的荧光量的改变。通常，猝灭减少了由荧光谱中的发射峰高测定的荧光量，经常该峰减少到低于未猝灭混合物中其峰高的20%。当使用其激发波长 +/-5nm波长的光激发时，其荧光发射峰高与测定没有荧光化合物的本体材料时仪器响应典型的变化无法区分时，可认为荧光化合物被完全猝灭。来自荧光化合物的荧光被完全猝灭不是必须的，但优选基本上完全的猝灭。应当根据使用的荧光标记物来选择猝灭方式。猝灭化合物与荧光化合物反应以改变其荧光特征。反应可通过离子对缔合、络合、分子构型的改变例如可通过改变溶剂引起， 发色团的氧化、不溶性的产生、非荧光物的使用或通过其它方式实现。合适的猝灭化合物取决于荧光化合物的性质。一些公知的荧光染料，例如咕吨、噻吨、二萘嵌苯和苯并吡喃衍生物的已知猝灭剂包括但不限于多金属氧酸盐(例如磷钼酸、磷钨酸、钨硅酸、钨钼酸)；硫氰酸钾(可选地与离子转移试剂配合使用)，N-氯代琥珀酰亚胺，胺例如反-2-氨基乙胺和二氮杂二环辛烷，氢氧化四丁基铵溶液，三氯氰尿酸，过乙酸，过氧化物例如过氧化氢和过氧化苯甲酰，苯胺例如N-甲基苯胺和N，N-二甲基苯胺，硝基苯如1，3_ 二硝基苯，可溶的过渡金属络合物、氯和次氯酸盐物质。优选的用于非极性介质例如烃燃料的猝灭剂，为多金属氧酸盐的极性溶液，特别是基于醇的溶液。当以高PPm的量加入时，这些猝灭剂立即充分猝灭染料的荧光，而不改变本体液体的荧光响应。WO 2005/052560描述了通过将染料吸附到吸附性材料上来从液体混合物中去除荧光染料，从而可以检测液体样品的光密度，以根据没有染料存在时的液体介质的光密度修正检测到的含有染料的液体样品的发射荧光。利用吸附剂从本体材料中去除染料比原位猝灭染料劳动密集程度更高，因为它依赖于洗脱、然后进入分离室，随后将其精确稀释到已知的体积。因此，WO 2005/052560的方法不包括于本发明中。
通过比校未猝灭的混合物的荧光发射和猝灭混合物的荧光发射来校正未猝灭的混合物的荧光发射。这决定了荧光量仅由溶液中一种或多种荧光标记物产生。在优选的实例中，从未猝灭混合物的发射光谱中扣除猝灭混合物的发射光谱。更优选的是校正由本体材料的光吸收造成的影响。校正后的发射光谱用于确定检测样品的荧光特征。然后可以将一种或多种这类特征(例如荧光发射的波长和/或强度)与在已知颜色和背景荧光的介质中含有已知量的荧光标记物的标准混合物样品的类似特征相比较。从检测的样品得到的发射和标准样品得到的发射之间的差异说明从中采集样品的本体材料已经改变，例如稀释或其它方式的改变。可以记录标准样品的特征，并用作与检测样品的简单的数值比较。我们已经发现，一旦考虑到介质的荧光背景的作用，染料的荧光响应的变化通常与染料溶解至其中的介质的颜色呈近似的线性关系。这是因为介质对激发光和/或发射荧光的吸收。当标记的材料为在同样的产品中可显示明显的颜色变化且随着时间的推移颜色也自然地发生变化的有色液体例如烃燃料时，这尤为相关。在优选的形式中，本发明的方法能够对校正了介质(即本体材料)的背景荧光并考虑其颜色后的荧光响应(荧光量、激发或发射波长)进行合适的校正。然后采用校准将已校正的荧光响应转换成染料的难度。我们还证实了遵循Lippert-Mataga方程的观测结果，即荧光程度取决于溶解到其中的介质的极性。这说明使用吸收来校正荧光只有应用于具有相似极性的液体才是理想的。如果使用的荧光标记物受溶剂的极性影响较小，则基于汽油和柴油的燃料的数据能够在同一图中进行比较。因此优选使用对其分散在其中的介质的极性变化不敏感的荧光标记物。如果使用的荧光标记物受溶剂的极性影响较强，则优选将基于汽油的燃料的结果与其它基于汽油的燃料进行比较，即与基于柴油的燃料分开来。如果使用的荧光标记物具有强烈依赖于溶剂的荧光，则在任何分析前应当通过加入另一种溶剂使得介质的极性被标准化。通过使用能够激发荧光标记化合物的荧光发射的波长的光照射混合物样品，来检测猝灭和未猝灭混合物的荧光。这通过使用标准荧光计来完成，其中用已知波长的光(激发射线)照射通常包含在透明池或比色皿中的样品。透明的，我们指样品池或至少样品池的一部分对激发射线和发射荧光是基本透明的。然后使用光检测设备收集样品发射的光， 并测定发射光的波长和强度。激发射线通常具有预先确定的波长，其被选择为能够被样品中的荧光材料之一吸收并产生荧光发射的波长。选择的激发射线的波长取决于使用的具体荧光标记化合物的吸收峰的形状。激发波长一定的波长范围，在该范围内染料能够被激发出荧光。激发波长优选小于或约等于最大吸收波长，以避免检测到激发射线及激发射线和荧光发射光谱之间相互作用。选择的激发射线的波长可取决于使用的具体荧光化合物的吸收峰的形状。激发射线可通过任何已知的源产生，例如具有合适的带通滤波器或衍射光栅的全谱光源，或者单一或窄带光源如激光。可获得具有很多不同波长的激光光源，并且可以选择或调谐以提供正确波长的光来激发至少一种荧光材料的荧光。特别合适的光源包括选择来发射期望强度和光谱的光的LED。优选对样品中存在的每一种荧光标记材料提供独立的光源，对每个光源进行选择和调谐或滤光以发射在各自的荧光标记物的最大吸收频率处或附近的射线。当存在多个光源时，提供用于指示数据处理器使用了哪一个射线源的部件。理想的情况是光源发射的射线具有的中心峰波长在检测样品的时间内的变化不超过士2nm，以保证吸收光谱不发生变化。当使用的产生输出射线的光源的波长例如随温度变化时，则应选择稳定的光源，并且应提供温度稳定部件，如帕尔贴模块或可选的散热器。如果需要的话，温度稳定部件也能用于加热光源以使光源达到其最佳工作温度。将激发射线的一部分直接转移到射线检测设备中以检测发射光的特定波长的中心峰波长和/或强度以及其变化是可能的。当样品间的激发射线的特定波长的中心峰波长或强度变化时，也可能计算样品荧光光谱的增强或缩减因子，以补偿引起样品吸收更多或更少能量的激发射线的变化。为区分透过样品的光和样品发射的荧光，通常在透射光的路径外设置光检测器。 光检测器可为光电管或光电二极管，包括电荷耦合设备。使用一个或多个棱镜或镜子或其组合能够将来自样品的发射射线定向到射线检测器的路径上，这是本领域技术人员所公知的。优选的是在整个样品路径长度上收集发射的射线，以获得样品间发射变化的最大灵敏度。射线可通过狭缝或小孔以减少到达控测器的光的发散，从而增加光谱的解析度。小孔相对于路径长度优选具有相似的尺寸。检测器可以是标准光谱装置中使用的任何检测器， 包括例如光电管、电荷耦合装置等。通常样品发射的射线被分成不同的波长，例如通过衍射光栅、棱镜或凹面全息镜，然后使用检测器测定每一种波长下的光的强度。包含镜子、棱镜、 衍射光栅和检测器的光学系统优选设计为紧密耦合光学系统。根据本发明的装置除了具有测定上述样品的荧光的光学器件外，还具有测定介质吸收的部件。对介质吸收的测定需要使用光源，以下将其称为“吸收光源”，它不会引起染料发出荧光。现实中，这种光源应当很弱以不能引起存在的任何染料发出能被光检测器检测的荧光，或者该光源产生的光的波长不会引起任何存在的染料发出可检测的荧光。吸收光源包括一种或多种滤波器以产生期望的用于测定介质吸收的特征。优选的是，通过参考透过样品的光的量与透过无色的标准参照物的光的量来计算样品的吸收，这种吸收在仪器的校准过程中测定，被称为“零吸收”。样品对吸收光源的发射光的吸收通过与用于测定样品发射的荧光的相同的光检测器测定。或者，可使用单独的检测器来测量吸收。优选的装置包括用于测定荧光和吸收的具有两种或更多种光源和一种或多种检测器的仪器。所有光源中除一个光源外为“激发”光源，适于发射其波长能够激发一种或多种荧光化合物发出荧光的光。在优选的实例中，每一这类光源包括布置为与合适的带通滤波器结合使用的LED。用一种或多种置于透过光路径外，优选与透过光路径成约90°的检测器来检测样品发出的荧光(如果有的话)。另外，选择“吸收光源”，其不会引起荧光但设置以朝向用于检测透过样品的光的光检测器直接发射光，该检测器可以为任何一个用于测定荧光发射的光检测器。吸收光源发出的光应该不能引起染料的激发，但能够被介质吸收。 在装置的优选实施例中，吸收光源为LED，选择其发射白光，但与用于激发荧光的光源相比强度相对较低。该吸收光源及其检测器共同使用以测定介质的吸收。通过适当的设置与仪器相关的电子件，能够操作共用检测器，即用于检测吸收或发射以及荧光的检测器，以确定检测器是在检测来自吸收光源的透过光还是荧光发射的光。这样的设置包括使检测器和激活“荧光激发”光源和“吸收”光源的时间同步。可选的设置可能依赖于通过透射光的波长和荧光波长之间的差距来区分用于吸收检测的透射光和用于荧光检测的荧光。因此，该共用检测器能够用于收集适于吸收和荧光测定的数据。使用数据处理器对来自检测器的数据进行收集并分析以产生用户需要的与样品的校正后的荧光相关的信息。优选对数据处理器程序化以比较猝灭混合物的荧光和未猝灭混合物的荧光，并优选补偿介质的吸收，还能够进行适当的计算以产生差谱、微分谱或综合谱。可以仅对一个或少数数据点进行计算，例如在特定波长处的峰高而不是整个谱图。当用户需要有关每个波长处的发射光的信息时，数据处理设备则以图表或图形等的形式产生这一信息。也可将数据处理器连接数据存储设备，以便重新检索以前的图表信息并进行比较。控制器，至少部分地控制装置的操作。控制器确保在适当的时间并根据使用的检测方法在适当的时间段内启动合适的光源。通过响应用户界面，控制器还提供对装置的自动或半自动操作。例如，半自动操作包括产生信息和指令消息以提示用户操作或操纵部分装置，或者更换或注射样品。控制器和数据处理器可通过合适的程序化的电子微处理器方便地提供。检测装置优选为便携式，其具有的所有部件处于单一的壳体中。优选提供合适的设备以辅助其便携性，如需要的一个或多个把手、背带或其它携带设备。提供控制器以打开或关闭样品箱，并操作仪器以允许来自选定的射线源的光进入样品。壳体优选还包括电源如电池组或电源适配器。然而电源可通过在独立的壳中提供，从而电源产生的热量可被耗散而不会影响装置的温度。壳体可装配显示器以显示样品的结果、设备的状态或有关使用方法的说明和信息。显示方式包括屏幕显示、信息显示或其它指示器如光。使用本发明的装置的方法包括校准步骤。在校准步骤中，含有无色液体例如水或无色有机溶剂的比色皿或样品池置于样品架中，测定来自“吸收光源”的光的透射以确定该液体的吸收。然后记录得到的数值作为“零吸收”用于校准。作为进一步的校准，将类似于待测样品浅色和深色液体的样品，各自不合有标记物(或猝灭标记物)或不含有标准量的未猝灭标记物，依次引入样品架，并测定荧光。然后将测定的荧光用于校准仪器，从而关于浅色液体和深色液体，对于特定装置而言，标记的样品与未标记(或猝灭的)样品之间的荧光测定的差异是已知的。我们已发现，零吸收校准(使用无色液体)优选每天或每周重复进行，这取决于装置的使用，或者在进行每一未知的样品检测或进行批次的这种检测前校准。当待测样品的性质发生明显变化时，例如当汽油和柴油样品间发生更换，或者样品的颜色或极性与校准液体明显不同时，每次都要使用浅色和深色液体进行校准。校准使得数据处理器计算校准样品的吸收和校准样品中标准的已知标记物的荧光之间的关系。然后利用该校准调整后续样品所测定的荧光以校正样品颜色对所测标记物的荧光的影响。计算校正的方法示于实施例中。该方法中，校准表示通过外推法计算零吸收样品中的校准样品的荧光。使用校准，能将每种样品测定的荧光调整至在零吸收的计算值，从而在由有色样品发射的荧光计算标记物的存在量时能够忽略颜色的影响。校准后，使用装置的方法优选包括以下步骤。将含有未知量标记物的液体样品 (“未知”样品)置于样品架上。通过使一种或多种荧光激发光源照射样品，然后用一个或多个光检测器检测由样品发射的荧光，所述仪器测定样品的荧光。记录该荧光光谱(或光谱的一部分)，例如作为“谱图A”。该仪器也能测定样品的吸收，其通过用“吸收光源”的光照射样品，并用设置用于测定透射光的检测器来测定透射过样品的光的量来完成。该装置然后测定已被处理来猝灭标记物荧光的未知液体样品的荧光。这种样品可以是与在进行了后续处理以猝灭荧光的前述检测相同的样品，或者另一种已进行处理来猝灭标记物的荧光的相同未知液体的样品。记录该荧光光谱(或光谱的一部分)，例如作为“谱图B”。然后装置计算荧光，即在标记物的一种或多种荧光波长下发射光的量，其仅归因于标记物，这通过从所记录的谱图A (或部分光谱)中扣除所记录的光谱B (或部分光谱)，或者通过任何其它合适的能够确定荧光差异的方式来实现。我们提及“光谱的一部分”时，我们指不需要测定或记录全谱，因为在很多情况下只需要测定和/或记录落入预先确定波长的光谱的一部分，因为标记物的荧光特征将被获知。部分光谱可包括其间出现荧光特征峰的波长或其可以远比整个峰的光谱更窄。可能要求用户在每次检测前将每种样品置于样品架上。可选的是，用户可将未猝灭样品和猝灭样品置于能够夹持一种样品以上的样品架上。这种样品架也能够夹持进行 “零吸收”校正的标准无色液体样品。根据要求将适当的样品移到或移出来自每种光源的光的路径上。作为进一步的选择，通过操作镜子或其它方式能够将荧光激发光源和/或吸收光源的光转向通过每种样品。该装置可选择地包括合适数量的光源或设备以将来自光源的光分成适当数量的能够同时照射一种以上样品的光束。该装置能够全手动、自动或半自动操作。在半自动操作中，操作者进行需要的人工操作，例如更换照射的样品，响应由装置的操作系统给出的提示。标记物组合物可包括一种或多于一种的荧光材料。优选存在多于一种以上的荧光材料，例如1-4种荧光材料，每一种均以与组合物中的各种其它材料量不同的已知量存在于标记组合物中。还可以存在其它材料，如溶剂、其它种类的标记化合物、非荧光染料等。以预先确定的量将标记组合物加入液体中，所述预先确定的量包括组合物中含有的每一种荧光材料的已知数量。可将标记组合物应用于含有测定量的组合物的容器中，并进行计算以在使溶解在测定量的液体中时每种荧光材料具有选定的浓度。在以下的实施例中将对本发明进行进一步的说明，其中使用Jobin Yvon Fluoromax-3荧光分光光度计记录发射光谱，其中激发波长为510nm，所采用的带宽为 2. Onm，记录610nm处的发射。用具有325nm的灯和2. Onm带宽的Thermo Spectronic UVl UV-可见光分光光度计记录紫外和可见光谱。所有测定均使用IOmm比色皿。以下实施例中使用的染料1为图1所示的化合物，其中队为丁基取代基，R2为亚氨基。附图中图1显示了合适种类的荧光化合物的化学结构。图2和图3分别显示了实施例1和2所述的未标记的、标记的和猝灭的煤油和汽油的荧光发射光谱。图4是荧光与四种燃料A-D中的染料1的浓度的关系图。图5是以ΙΟΟμ g/Ι溶解在8种不同燃料中的染料1的荧光发射与610nm处的燃料吸收之间的关系图。图6是以25、50、75μ g/Ι溶解在燃料A-D中的染料1的荧光发射与610nm处的燃料吸收之间的关系图。图7是实施例5、6和7的染料1的发射荧光与610nm处的吸收之间的关系图。实施例1记录500-700nm范围的未标记煤油样品的荧光发射光谱。用异-辛烷作为参比溶剂记录煤油在400-900nm的UV-Vis光谱。在IOml煤油中制备100微克/升(μ g/Ι)的染料1的溶液，以形成标记的煤油。记录500-700nm的荧光光谱。将250微升12-磷钼酸 (5g/l，在乙基己醇中)加至IOml标记的煤油样品以猝灭染料1的荧光。颠倒小瓶以确保完全混合后，再次记录500-700nm的荧光光谱。图2显示了未标记的、标记的和猝灭的煤油的荧光发射光谱。非常有效地猝灭了由染料引起的荧光信号，得到的谱图非常类似于未标记的燃料的谱图，特别是在用于测定染料的荧光发射的波长附近。可将煤油中的染料1的“校正的”焚光发射视为染料的荧光发射加上燃料的背景荧光，再减去燃料中猝灭的染料的荧光发射。此后，使用“校正的荧光”指未猝灭的含有染料1的样品在eiOnm的荧光强度与猝灭的样品(即加入磷钼酸猝灭剂后) 在eiOnm处的荧光强度的差。实施例2使用汽油重复实施例1中所述的实验。未标记的、标记的和猝灭的汽油的荧光发射光谱显示于图3中。通过比校图2中不合标记物或猝灭的标记物的燃料与图3中的相应曲线，可以清楚地看出，与煤油相关的背景荧光远低于与汽油相关的背景荧光。实施例3 荧光与浓度的相关性在附图4中标示为A、B、C和D的四种不同的有色燃料中，测定染料1的荧光发射。 图4显示了这些燃料响应于浓度的荧光变化。在所有的燃料中，在考虑的染料的浓度范围内，染料的荧光响应与染料的浓度呈线性比例。图4中可以看出该结果，即不论介质的颜色如何，在低浓度下染料的荧光响应与浓度成比例，这普遍适用。实施例4 荧光与吸收的相关性使用实施例1中所述的方法在8种不同的有色燃料中对染料1校正的荧光发射进行了测定。通过测定其在eiOnm的吸收测定了每一种燃料的颜色。图5是显示了 8种不同燃料中的染料1的校正荧光与吸收之间的变化的图。在现实中，一些颜色最浅的燃料相对于异-辛烷显示出负吸收，可能是由于燃料和异-辛烷之间折射率的不匹配。为了简化图 5，最浅颜色的燃料已经被设定为零吸收，其它燃料的吸收值相应增大。可以看出，假定不同介质的极性基本上相同时，荧光随着介质的吸收呈线性变化。知道荧光变化与吸收的关系提供了计算任意颜色和任意背景荧光的介质中染料量的方法。最佳拟合图5中八个数据点的直线方程为方程1)吸收=-2. OOX 10" X 荧光 +0. 0554该方程仅适用于含有ΙΟΟμ g/Ι染料的燃料。然而，从图4我们知道在低于ΙΟΟμ g/ 1处染料的荧光响应与其浓度成正比，而不管介质的颜色如何。图6显示了染料1在实施例 3中使用的四种不同燃料中在25、50和75ppb下的数据，可以看出，所有荧光响应与吸收的关系线均通过y轴上相应于方程1的截距的相同点。为计算未知样品中染料的浓度，我们仅能测定其荧光和吸收。需要的其它信息是方程1的y轴上的截距。这能够生成新的直线，其在y轴上的截距由方程1给出，且对于未知样品其通过该数据点。新的直线在χ轴上的截距对应于无色介质，即吸收为零的情况的未知样品的荧光响应。方程1在χ轴上的截距对应于无色介质中100yg/l的染料的荧光。 因此，通过比校由未知样品计算得到的新的直线的χ轴截距和方程1的χ轴截距，其通过含有100μ g/Ι的样品给出，我们能够计算未知样品中染料的浓度。实施例5未知燃料的吸收和荧光数据分别为0.001和沈3，000。已知吸收和荧光的关系的截距为恒量，其由方程1给出，则使用这一数据的曲线的斜率将为-2. 00X 10_7，这显示于图7中。这就意味着无色介质中的荧光响应为沈8，000。由方程1的χ轴截距，我们能够计算出染料的浓度为0.097mg/l。染料的实际浓度为100 μ g/Ι，因此计算值的误差仅为3%。实施例6第二未知燃料的吸收和荧光数据分别为0. 03和136，000。使用方程1的y轴截距，我们能够计算使用该数据的曲线的斜率为-1.87X10_7，如图7所示。这就意味着无色介质的荧光响应为四6，500，或者参考方程1的χ轴截距，染料的浓度为0. 107mg/l。染料的实际浓度为100yg/l，且燃料为汽油。其误差为7%。简单地比较汽油中的染料的荧光和零吸收介质中染料的荧光将会预测实施例2的浓度仅为0. 050mg/l，误差达50%。实施例7第三种已知含有染料1的未知燃料的吸收和荧光数据分别为0. 019和68，500。已知吸收和荧光的所有关系的截距为恒量，其由方程1给出，则使用这一数据的曲线的斜率将为-5. 39X10_7，如图7所示。这就意味着无色介质中的荧光响应为102，500，或者参考方程1的χ轴截距，染料的浓度为0.037mg/l。染料的实际浓度为37. 5 μ g/1，且燃料是汽油和UK95辛烷汽油的混合物。简单地比较染料的荧光和零吸收介质中染料的荧光将会预测的浓度为0. 025mg/l。因此，通过在选择性地猝灭后用其中溶有标记物的介质的吸收校正标记物的荧光响应，我们能够显著改进定量荧光标记物的方法，尤其是在其中溶有标记物的介质具有未知荧光和吸收的情况下。
权利要求
1.测定溶解或分散在本体材料中的荧光标记化合物的荧光的方法，包括步骤(a)测定所述本体材料和所述荧光标记化合物的混合物的荧光特征；(b)猝灭荧光标记化合物的荧光得到猝灭混合物；(c)测定猝灭混合物的荧光特征；(d)比较所述混合物的荧光特征和所述猝灭混合物的荧光特征；和(e)针对本体材料的吸收的影响来校正测定的荧光发射特征。
2.根据权利要求1所述的方法，其中本体材料是液体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述荧光标记化合物属于选自由以下物质组成的组的化学类物质酞菁、萘酞菁、镍连二硫烯、胺鐺化合物、次甲基染料、奧四元酸染料、 荧光素及其衍生物、取代蒽醌、偶氮染料、吓啉、香豆素、取代香豆素(包括伞形酮)、苯并吡喃及其衍生物，咕吨染料(包括若丹明)、噁嗪、克酮酸染料、萘二甲酰亚胺、萘并荧光酮、半萘并荧光酮、三碳菁、双吲哚基马来酰亚胺、1，3- 二芳基-和1，3，5-三芳基-2-吡唑啉、吖啶、菲啶、二吡咯甲烷。
4.根据前面任一项权利要求所述的方法，其中通过加热、改变混合物的pH、改变混合物的极性、加入氧化剂或还原剂或加入化学猝灭化合物来实施所述猝灭。
5.根据权利要求4所述的方法，其中通过加入化学猝灭化合物来对荧光化合物进行猝灭。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述猝灭化合物选自由多金属氧酸盐、硫氰酸钾、 N-氯代琥珀酰亚胺、胺、氢氧化季铵、二氮杂二环辛烷、三氯氰尿酸，过乙酸，过氧化物，取代苯胺、取代硝基苯、可溶的过渡金属络合物、氯和次氯酸盐组成的组。
7.根据前面任一项权利要求所述的方法，其中从未猝灭混合物的荧光发射中减去至少一个波长处的猝灭混合物的荧光发射，以校正来自本体材料的荧光发射。
8.根据前面任一项权利要求所述的方法，其中通过测定不同地着色的材料中相同浓度下的相同荧光化合物的荧光发射特征作所获得的校准，来针对本体材料的吸收的影响对测定的荧光发射特征进行校正。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中将校正过的发射与类似标记混合物的标准样品的发射相比较。
10.鉴别本体材料的方法，包括步骤将含有至少一种荧光化合物的标记物加入所述本体材料以形成所述本体材料和所述荧光标记化合物的混合物，然后，使用前面任一项权利要求所述的测定荧光的方法测定所述本体材料样品中的所述至少一种荧光化合物的荧光。
11.适用于实施前面任一项权利要求所述的方法的装置，所述装置包括(a)至少一个激发光源，其能够发射选定波长的光，该选定波长激发至少一种荧光标记化合物的可检测荧光；(b)至少一个检测由所述至少一种荧光标记化合物发射的荧光的光检测设备；(c)至少一个吸收光源，该光源能够发射选定波长的光，该选定波长不激发任何荧光标记化合物的可检测荧光，但该光源能被本体材料吸收；(d)至少一个用于检测所述吸收光源发射的穿过样品的光的光检测设备；(e)计算用户需要的关于校正的样品荧光信息的数据处理设备；和(f)控制所述装置的至少部分操作的控制设备。
12.根据权利要求11所述的装置，其中至少一个光检测设备是共用检测器，其适于检测由至少一种荧光标记化合物发射的荧光，且适于检测由所述吸收光源发射的穿透过样品的光。
13.根据权利要求12所述的装置，其中操作共用检测器以确定它所检测的是透射光还是荧光。
14.根据权利要求11-13任一项所述的装置，其中数据处理器用于计算校准样品的吸收和校准样品中的标准已知标记物的荧光之间的关系，从而可以利用所述计算的关系调整测得的样品的荧光以校正样品颜色对测定的标记物荧光的影响。
15.根据权利要求11-14任一项所述的装置，其适于便携，且包括含有所述装置的全部部件的单一壳体。
全文摘要
本发明涉及用荧光标记化合物标记本体材料并随后通过测定其荧光发射来鉴别荧光化合物的方法，其中在猝灭荧光化合物前后测定标记样品的荧光以修正由于本体材料自身固有的荧光性质对所测定荧光的影响。该测定可进一步修正以解决已知的材料吸收对所测定荧光的影响。还描述了实施以上方法的装置。
文档编号G01N33/28GK102308210SQ201080006575
公开日2012年1月4日 申请日期2010年2月2日 优先权日2009年2月3日
发明者B·V·克罗德, D·W·J·麦卡里恩, I·S·艾德沃赛 申请人:约翰森·马瑟公开有限公司