专利名称：：一种用高效液相色谱-荧光法同时测定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的方法
技术领域：
：本发明属于分析化学领域。涉及一种色谱检测的方法，具体涉及高效液相色谱荧光法同时测定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的方法，即利用在线衍生、可调波长的高效液相色谱荧光法同时测定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的方法。
背景技术：
：色氨酸(tryptophan,Trp)是人体必需的氨基酸之一。摄入体内的Trp主要经犬尿氨酸(ky皿renine，Kyn)途径代谢即Trp在色氨酸2，3双加氧酶(L-tryptophan2，3-dioxygenase，TD0)或喷哚胺2，3双加氧酶(indoleamine2，3-dioxygenase，ID0)的作用下生成甲酰犬尿氨酸，后者迅速在犬尿氨酸甲酰胺酶的作用下生成Kyn，Kyn在犬尿氨酸氨基转移酶的作用下进一步生成犬尿喹啉酸(ky皿renicacid，Kyna)。高效液相色谱法(HPLC)技术作为一种集分离和测定于一体的分析技术，具有良好的敏感性和特异性，是测定色氨酸(Trp)、犬尿氨酸(Kyn)和犬尿喹啉酸(Kyna)最常用的方法，根据联用的检测器不同又分为高效液相色谱荧光法(HPLC-FD)、高效液相色谱_电化学法(HPLC-EC)和高效液相色谱紫外法(HPLC-UV)。色氨酸具有吲哚结构，自身能产生荧光，故可采用荧光法检测；犬尿氨酸自身不能产生荧光，但可吸收一定波长的紫外线，故多采用高效液相色谱紫外法的方法，同时国外有学者采用柱前荧光衍生或柱后光化学衍生处理的高效液相色谱荧光法检测；而Kyna虽具有天然荧光的特性，但在人体液中的含量极低，在国外建立的高效液相色谱荧光法中采用柱前或柱后荧光衍生的方法。国外报道同时检测色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的方法需联合应用紫外和荧光检测器进行检测，实验操作繁琐，耗时较长。而目前国内外还未见采用高效液相色谱荧光法同时测定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的报道。
发明内容本发明的目的是提供一种用高效液相色谱荧光法同时测定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的方法，醋酸锌在线衍生增强所测物质荧光，可调波长使所测物质均在其最佳波长下检测，从而使测定真实准确，方法操作简单，分离快速，无需柱前柱后衍生，灵敏度高。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为—种用高效液相色谱荧光法同时测定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的方法，包括以下步骤a、采用HypersilC18250mmX4.6mmi.d，7iim色i普柱；b、流动相的组成每升流动相中含醋酸锌0.2mol、醋酸8.3mmo1和2.5v/v^的乙腈；(利用醋酸锌增强三种物质的荧光，用醋酸调整衍生反应的最佳pH值，使三种物质在线衍生的荧光测定真实准确)；c、流速为1.5ml/min，进样量:20iU，柱温25。C;d、利用荧光检测器扫描确定三种物质的最佳吸收波长，进而采用可调波长使得三种物质均在其最佳波长下得到检测；可调波长设定为0-llmin激发光波长365nm，发射光波长为480nm;11-15.5min激发光波长344nm，发射光波长为404nm;15.5_20min激发光波长254nm，发射光波长为404nm;e、分别配制色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的标准溶液和混合标准液；f、混合标准品和血清样品的检测；色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸标准溶液的配制采用0.312mol/L高氯酸溶液溶解和稀释，并用超纯水配制成混合标准液。血清样品的处理过程为取200iU血清样品于印pendorf管内，加入等量0.624mol/L高氯酸溶液，加盖后于旋涡混匀器上混匀，室温下放置10min，以充分沉淀血清中的蛋白质，4。C，10000r/min离心10min后取上清液20yl进样分析。g、制作标准曲线、定性定量方法、精密度的评价、回收率的考察和干扰试验。与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下1、本发明首次应用在线衍生、可调波长的高效液相色谱荧光法，同时测定待测样品中的色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸。2、本发明测定真实准确，方法操作简单，分离快速，无需柱前柱后衍生，灵敏度高。3、本发明经过大量的试验，摸索出一套最佳的能同时测定待测样品中色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的条件，包括流动相成分，pH值、流速、进样量、柱温、检测波长等等。4、线性试验及检测限试验结果表明，在一定范围内，三种物质的标准曲线的线性关系良好(r2>0.990)，线性范围宽；在该方法下三种物质的检测限(L0D，S/N=3)低，灵敏度高。5、本发明测定血清样本中三种物质的加标回收率的平均值为犬尿氨酸为97.45%，犬尿喹啉酸为100.6%，色氨酸为103.71%，日内和日间的精密度均小于5%，苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、5-羟色胺(5-HT)和肌酐(Cr)对测定无干扰。图1为混合标准品的色谱图；峰序号Kyn-犬尿氨酸，Kyna-犬尿喹啉酸，Trp-色氨酸；图2为本发明测定的血清样本的色谱图；峰序号Kyn-犬尿氨酸，Kyna-犬尿喹啉酸，Trp-色氨酸；图3为Kyn的标准曲线；图4为Kyna的标准曲线；图5为Trp的标准曲线。具体实施例方式以下实施方式和实施例旨在进一步说明本发明，而不会限制本发明权利要求保护的范围。主要实验仪器及色谱条件Waters510色谱泵，Waters2475型荧光检测器，Rheodyne7725手动进样器，色谱分离系统的控制和记录由HS2000色谱数据工作站完成。色谱柱选用的是HypersilC18250mmX4.6mmi.d.，7ym色谱柱，流动相每升流动相中含醋酸锌0.2mol、醋酸8.3,1和2.5v/v^的乙腈，流速1.5ml/min;进样量:20iU，柱温25。C，可调波长设定为0-llmin激发光波长365nm，发射光波长为480nm;11-15.5min激发光波长344nm，发射光波长为404nm;15.5-20min激发光波长254nm，发射光波长为404nm。主要试剂Kyn、Trp、5-羟色胺(5-HT)、犬尿喹啉酸(Kyna)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和肌酐(Cr)均购自Sigma公司；乙腈、甲醇均为色谱纯，购自美国Tedia公司；醋酸锌、冰醋酸等均为国产分析纯，高氯酸为国产优级纯。实施例1—、色谱条件的建立及标准液的配制标准溶液的配制准确称取TrplOO.Omg、Kynl08.Omg和Kyna99.Omg，用0.312mol/L的高氯酸溶液溶解并稀释至100ml，混匀，分别制成4900iimol/LTrp、1960iimol/LKyn禾口104.67iimo1/LKyna的标准储备液，分装后置于-2(TC冰箱中备用。使用前取标准储备液加超纯水配成混合标准液(含Kyn0.98iimol/L，Kyna26.17nmol/L和Trp24.5iimol/L)。二、高效液相色谱条件的选择1、检测波长的选择采用手动停流技术，通过对Kyn、Kyna和Trp的激发光波谱(范围200-450nm)和发射光波谱(范围300-550nm)扫描分别得到最大激发光波长AeXftp=269nm，AexKyn=365nm，入exKyna=344nm;最大发身寸光波长入emTrp=341nm，入emKyn=480nm，入emKyna=404nm。Kyn的最大激发光波长和最大发射光波长分别为Aex=365nm、Aem=480nm。Kyna的最大激发光波长和最大发射光波长分别为Aex=344nm、Aem=404nm。但当Trp选用激发光波长为269nm，发射光波长为341nm时，Trp的最高检测限约为48iimol/L，不适合常规检测。而采用激发光波长为254nm，发射光波长为404nm时，检测限上限较高，线性范围较宽，干扰少，满足常规分析。2、流动相中有机物的比例对保留时间的影响配制不同乙腈含量(1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%)的流动相，以标准液作为样品进行分析。随着乙腈含量的增加，Kyn、Kyna、Trp的峰保留时间相应縮短，且kyn、Kyna、Trp峰面积响应值也相应的增大；但当乙腈含量达到3%时，Kyn和Kyna峰的半峰宽增大；Trp峰与后面的杂峰相融合，影响定量的准确性。而且随着乙腈含量的增加，Kyn和Kyna的越来越近，互相干扰，综合考虑以上因素，本实验采用乙睛含量为2.5%的流动相。3、流速对分离效果的影响分另U选用流速0.9ml/min，lml/min，1.3ml/min，1.5ml/min，1.7ml/min，1.9ml/min，2.lml/min进行实验。实验表明随流速加快Kyn、Kyna、Trp的保留时间明显縮短，峰面积响应值相应的减小，色谱系统的后压加大。综合考虑分析时间和响应值，本实验采用流速为1.5ml/min。4、醋酸锌浓度的影响5醋酸锌不但可以增加离子强度，还可以增强三种物质的荧光强度。配制含有不同浓度醋酸锌(0mol/ml、0.lmol/ml、0.15mol/L、0.2mol/ml、0.25mol/L、0.30mol/L)的流动相，取含Kyn(0.98iimol/L)、Kyna(26.17nmol/L)、Trp(24.5iimol/L)的混合标准液进样测定。结果发现，流动相中不含有醋酸锌时，Kyna的荧光非常弱，几乎检测不到。随醋酸锌浓度的增加，Kyn、Kyna的峰面积随之增大。而Trp在醋酸锌浓度达到0.2mol/L后峰面积基本不变。考虑到醋酸锌溶解度较小，当醋酸锌浓度达到0.3mol/L时，容易形成微小的结晶，对实验不利；而当其浓度为0.25mol/L时，会有其它物质干扰Trp峰，因此综合考虑选用含0.2mol/L醋酸锌的流动相。5、柱温对分离效果的影响将柱温恒定于25、30、35、40、45°C进行分析。实验结果表明三种物质的保留时间的变化并不明显，而当温度升高时，分子间的碰撞频率增加，非辐射能量转移过程增加，三种物质所发出的荧光强度降低，故柱温25t:时三种物质的峰面积最大，因此选择25t:较为理术巨6、pH值对分离效果影响流动相的pH值能影响物质的荧光效应和被分析物质的分离效果。因此，本实验用冰醋酸对流动相pH值进行调节，在pH值为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5时对三种物质的标准液及混合标准液进行分析，以确定最佳的pH值。结果发现，随着ra值的升高，三种物质的峰面积也相应的增大；pH4.5、5.0、5.5、6.0时混合标准液中三者的色谱峰不能完全分离开，p朋.5时，三者分离良好。实施例2样品的检测1、混合标准液的检测取上述配制的标准储备液加超纯水配成混合标准液(含Kyn0.98iimol/L，Kyna26.17nmol/L和Trp24.5ymol/L)进行分析。高效液相色谱条件色谱柱选用的是HypersilC18250mmX4.6mmi.d.，7ym色谱柱，流动相每升流动相中含醋酸锌O.2mol、醋酸8.3,1和2.5v/v^的乙腈，流速1.5ml/min;进样量20iU，柱温25。C，可调波长设定为0-llmin激发光波长365nm，发射光波长为480nm;11-15.5min激发光波长344nm，发射光波长为404nm;15.5-20min激发光波长254nm，发射光波长为404nm(图1)。2、血清样品的检测取200iU血清样品于印pendorf管内，加入等量5%高氯酸溶液，加盖后于旋涡混匀器上混匀，室温下放置10min以充分沉淀血清中的蛋白质，离心10min(10000r/min，4°C)后将上清液转入另一Eppendorf管内，相同条件下再离心5min，取上清液20iil进样分析(图2)。高效液相色谱条件色谱柱选用的是HypersilC18250mmX4.6mmi.d.，7iim色谱柱，流动相每升流动相中含醋酸锌O.2mol、醋酸8.3mmo1和2.5v/v^的乙腈，流速1.5ml/min;进样量20iU，柱温25°C，可调波长设定为0-llmin激发光波长365nm，发射光波长为480nm;11-15.5min激发光波长344nm，发射光波长为404nm;15.5-20min激发光波长254nm，发射光波长为404nm。3、定性定量分析Kyn、Kyna和Trp均采用峰保留值比较法和叠加法进行定性分析，即比对混合标准液和血清样品在相同条件下的色谱峰和相对保留时间；在血清样品中分别加入适量的各种标准物质，比较相同色谱条件下不加标准品及加标准品的色谱图。试验结果表明，在血清样品中加入标准品前后，三种物质的出峰位置是一致的。用外标法测定峰面积进行定量分析。即在相同色谱条件下测定混合标准品和血清样品，把混合标准品中三种物质的色谱峰面积和血清样品中三种物质的色谱峰面积进行比较求得血清样品中三种物质的含量。用公式表示为血清Kyn(Kyna或Trp)浓度=;《^2注Au=血清中Kyn(Kyna或Trp)峰面积As=混合标准液中Kyn(Kyna或Trp)峰面积Cs=混合标准液中Kyn(Kyna或Trp)浓度计算得上述血清样品Kyn浓度为1.76ymol/L，Kyna的浓度为30.22nmol/L，Trp的浓度为45.26iimol/L。4、标准曲线的制作配制一系列浓度的Kyn、Kyna和Trp的混合液标准液，每个样品进样3次，取其平均值用最小二乘法进行相关与回归分析。得出Kyn的线性范围是0.049-98yrno1/L，回归方程为Y=2638+173834X，相关系数r2=0.999(图3);Kyna的线性范围是1.050-1047nmol/L，回归方程为:Y=1864+65087X，相关系数r2=0.997(图4);Trp的线性范围是O.610-196iimol/L，回归方程为:Y=1890+124215X，相关系数r2=0.999(图5)。当信噪比S/N=3时，测得Kyn，Kyna和Trp的最低检测限分别为0.025iimol/L，0.050翻1/L禾口0.005iimol/L。5、精密度的评价取血清样本进行日内和日间精密度实验。日内精密度同一个样本一天内连续测定20次；日间精密度同一个样本一天测定一次，连续测定20天。三者的日内和日间精密度均小于5%，如表l所示。表1Kyn、Kyna和Trp的日间和日内精密度<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>6、加标回收率试验血清样品1.6ml分为4组，第1组加入0.lml超纯水作为基础样品，第2、3、4组分别加入高、中、低三种浓度的混合标准液0.lml，每组平行测定三次，取其平均值计算回收率。结果见表2。表2Kyn、Kyna和Trp的加标回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>7、干扰试验用超纯水配制610.0iimol/L苯丙氨酸(Phe)、550.0iimol/L酪氨酸(Tyr)、98.5iimol/L5-羟色胺(5-HT)和375.5ymol/L肌酐(Cr)的标准液，先分别进样分析，再配制成混合样本进样分析。在本发明的色谱条件下，上述浓度的Phe、Tyr和5_HT对测定无干扰。结果见表3。表3干扰试验检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注-代表未检测出。权利要求一种用高效液相色谱荧光法同时测定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤a、采用HypersilC18250mm×4.6mmi.d，7μm色谱柱；b、流动相的配制每升流动相中含醋酸锌0.2mol、醋酸8.3mmol和2.5v/v％的乙腈；c、流速为1.5ml/min，进样量20μl，柱温25℃；d、可调波长的设定为0-11min激发光波长365nm，发射光波长为480nm；11-15.5min激发光波长344nm，发射光波长为404nm；15.5-20min激发光波长254nm，发射光波长为404nm2.根据权利要求1所述的一种用高效液相色谱荧光法同时测定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的方法，其特征在于，血清样品的处理过程为取200iil血清样品于印pendorf管内，加入等量0.624mol/L高氯酸溶液，加盖后于旋涡混匀器上混匀，室温下放置10min，以充分沉淀血清中的蛋白质，4t:，10000r/min离心10min后取上清液20yl进样分析。3.根据权利要求1所述的一种用高效液相色谱荧光法同时测定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的方法，其特征在于，色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸标准溶液的配制采用0.312mol/L高氯酸溶液溶解和稀释，并用超纯水配制成混合标准液。全文摘要本发明涉及一种用高效液相色谱-荧光法同时测定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的方法。步骤包括a、采用HypersilC18250mm×4.6mmi.d，7μm色谱柱；b、每升流动相中含醋酸锌0.2mol、醋酸8.3mmol和2.5v/v％的乙腈；c、流速为1.5ml/min，进样量20μl，柱温25℃；d、可调波长的设定为0-11min激发光波长365nm，发射光波长为480nm；11-15.5min激发光波长344nm，发射光波长为404nm；15.5-20min激发光波长254nm，发射光波长为404nm条件下检测。方法操作简单，分离快速，无需柱前柱后衍生，灵敏度高，结果真实准确，能同时测定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸。文档编号G01N30/06GK101776662SQ20101030036公开日2010年7月14日申请日期2010年1月15日优先权日2010年1月15日发明者任亚萍,周前选,唐爱国,皮兰敢,罗昔波,肖乐东,项忠元申请人:中南大学湘雅二医院