专利名称：一种测定水中叶绿素a的方法
技术领域：
本发明涉及一种测定水中叶绿素a的方法。
背景技术：
目前水体中叶绿素的测定方法主要有国家环境保护局公布的《水和废水监测分析方法》(第四版)中推荐的丙酮研磨法测定叶绿素a，该方法是用醋酸纤维滤膜过滤水样，截留藻类的滤膜低温干燥6 8h后，加90%丙酮反复研磨提取，离心，用分光光计测定并计算chla含量。该方法缺点是①反复研磨提取中，叶绿素暴露在环境中，易发生光解；②丙酮易溶解乙酸显微滤膜，使滤膜上的叶绿素a粘滞于研磨器具；③丙酮对人体有毒，且挥发性强，对工作人员身体健康不利；④在反复添加溶剂和反复转移中，溶剂易粘与研磨器壁上， 造成叶绿素的流失。中国专利文献CN1631117公开了一种叶绿素a的测定方法，即乙醇研磨法。该方法是用O. Sum的醋酸纤维滤膜过滤水样，用90%乙醇浸泡研磨，离心萃取，用分光光度法测定chla，该方法使用90%乙醇代替丙酮，增加了方法的安全性，但也有不足之处①仍然需要研磨，过程繁琐，叶绿素易流失；②使用O. Sum的滤膜，孔径过大，会使部分藻类无所截留而流失。文献《乙醇法测定浮游植物叶绿素a含量的讨论》中使用了乙醇冷冻法，该方法是用O. 45 μ m醋酸纤维滤膜过滤水样，用90%乙醇冷冻浸泡截留有藻细胞的滤膜12h，之后离心萃取，用分光光度法分酸化前和酸化后两步测定水样在665nm和750nm处得吸光度值，根据公式计算。该方法优点是使用乙醇做萃取剂安全性高，并且不需要研磨；缺点是需要盐酸酸化，盐酸使用量不好控制，重现性差。
发明内容
本发明是要解决现有的乙醇冷冻法测定叶绿素a的方法需要盐酸酸化，盐酸使用量不好控制，导致测定稳定性差、重现性差的问题，提供一种测定水中叶绿素a的方法。本发明测定水中叶绿素a的方法，按以下步骤进行一、取50 200ml水样，采用O. 45 μ m醋酸纤维滤膜进行过滤，真空泵压力控制在 O. 05MPa，获得截留有藻细胞的滤膜；二、将截留有藻细胞的滤膜剪碎放入装有6ml体积浓度为90%的乙醇溶液的离心管中，置于4°C冷藏12 24h ;三、然后将离心管于8000r/min 离心15min，收集上清液，再向离心管中补加4ml体积浓度为90%的乙醇溶液，再于8000r/ min离心5min，收集上清液，合并两次离心获得的上清液，并加入质量浓度为90%的乙醇溶液定容至10ml，得萃取液；四、将萃取液于8000r/min离心5min，得萃取液上清液，以质量浓度为90%的乙醇溶液做参比，用分光光度计测定萃取液上清液在630nm、647nm、664nm和 750nm波长下的吸光度值，按以下公式计算水体中叶绿素a的含量Chla = [12. 12(D664_D 750)-1. 58 (D647-D750)-O. 08 (D630-D750) ] Ve/V ;其中 Chla 为水样中叶绿素 a 的含量，μ g/ L ;D630、D647、D664和D750分别为萃取液上清液在630nm、647nm、664nm和750nm波长下的吸光度值；Ve为萃取液的总体积，ml ；V为抽滤的水样体积，L0本发明无需研磨，可大大节省人力，并避免因转移萃取液而造成的叶绿素损失；本发明使用乙醇作为萃取液，对人体安全无毒害；测定步骤不需要盐酸酸化，因此不受盐酸酸化程度的影响；提取更完全，结果重现性好。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式测定水中叶绿素a的方法，按以下步骤进行—、取50 200ml水样,采用O. 45 μ m醋酸纤维滤膜进行过滤,真空泵压力控制在 O. 05MPa，获得截留有藻细胞的滤膜；二、将截留有藻细胞的滤膜剪碎放入装有6ml体积浓度为90%的乙醇溶液的离心管中，置于4°C冷藏12 24h ;三、然后将离心管于8000r/min 离心15min，收集上清液，再向离心管中补加4ml体积浓度为90%的乙醇溶液，再于8000r/ min离心5min，收集上清液，合并两次离心获得的上清液，并加入质量浓度为90%的乙醇溶液定容至10ml，得萃取液；四、将萃取液于8000r/min离心5min，得萃取液上清液，以质量浓度为90%的乙醇溶液做参比，用分光光度计测定萃取液上清液在630nm、647nm、664nm和 750nm波长下的吸光度值，按以下公式计算水体中叶绿素a的含量Chla = [12. 12(D664_D 750)-1. 58 (D647-D750)-O. 08 (D630-D750) ] Ve/V ;其中 Chla 为水样中叶绿素 a 的含量，μ g/ L ;D630、D647、D664和D750分别为萃取液上清液在630nm、647nm、664nm和750nm波长下的吸光度值；Ve为萃取液的总体积，ml ；V为抽滤的水样体积，L0本实施方式无需研磨，可大大节省人力，并避免因转移萃取液而造成的叶绿素损失；本实施方式使用乙醇作为萃取液，对人体安全无毒害；测定步骤不需要盐酸酸化，因此不受盐酸酸化程度的影响；提取更完全，结果重现性好。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中取50ml水样。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中取200ml水样。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中取IOOml水样。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中取150ml水样。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤二中置于4°C冷藏12h。其它与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一不至五之一同的是步骤二中置于4°C冷藏24h。其它与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤二中置于4°C冷藏16 20h。其它与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
九本实施方式测定水中叶绿素a的方法，按以下步骤进行一、取IOOml水样，采用O. 45 μ m醋酸纤维滤膜进行过滤，真空泵压力控制在O. 05MPa，获得截留有藻细胞的滤膜；二、将截留有藻细胞的滤膜剪碎放入装有6ml体积浓度为90%的乙醇溶液的离心管中，置于4°C冷藏24h ;三、然后将离心管于8000r/min离心 15min,收集上清液，再向离心管中补加4ml体积浓度为90%的乙醇溶液，再于8000r/min离心5min，收集上清液，合并两次离心获得的上清液，并加入质量浓度为90%的乙醇溶液定容至10ml，得萃取液；四、将萃取液于8000r/min离心5min，得萃取液上清液，以质量浓度为 90%的乙醇溶液做参比，用分光光度计测定萃取液上清液在630nm、647nm、664nm和750nm 波长下的吸光度值，按以下公式计算水体中叶绿素a的含量Chla = [12. 12 (D664-D750) -I. 58 (D647-D750)-O. 08 (D630-D750) ] Ve/V ;其中 Chla 为水样中叶绿素 a 的含量，μ g/L ； D630、D647、D664和D750分别为萃取液上清液在630nm、647nm、664nm和750nm波长下的吸光度值；Ve为萃取液的总体积，ml ；V为抽滤的水样体积，L0实验I :为了验证本方法对不同叶绿素浓度水样的相关性，取实验室培养的铜绿微囊藻藻液，从同一瓶藻液中分别取4ml、8ml、14ml、20ml和26ml于IOOOml容量瓶中，并分别用超纯水稀释至1000ml，作为水样，按照本实施方式的方法进行测定。测定时，相同的水样重复三次，取平均值。为验证本实施方式方法的优越性，分别用丙酮法、乙醇研磨法和乙醇冷冻法取同样的水样，设三个平行样，测定叶绿素a，即分别依照国家环境保护总局编写的《水和废水监测分析方法》(第四版)的叶绿素测定方法、中国专利文献CN1631117所述方法、文献《乙醇法测定浮游植物叶绿素a含量的讨论》中使用的乙醇冷冻法测定叶绿素a。不同方法的相关性比较结果如表I所示。表I不同方法的相关性比较
权利要求
1.一种测定水中叶绿素a的方法，其特征在于测定水中叶绿素a的方法，按以下步骤进行一、取50 200ml水样，采用O. 45 μ m醋酸纤维滤膜进行过滤，真空泵压力控制在O.05MPa，获得截留有藻细胞的滤膜；二、将截留有藻细胞的滤膜剪碎放入装有6ml体积浓度为90%的乙醇溶液的离心管中，置于4°C冷藏12 24h ;三、然后将离心管于8000r/min 离心15min，收集上清液，再向离心管中补加4ml体积浓度为90%的乙醇溶液，再于8000r/ min离心5min，收集上清液，合并两次离心获得的上清液，并加入质量浓度为90%的乙醇溶液定容至10ml，得萃取液；四、将萃取液于8000r/min离心5min，得萃取液上清液，以质量浓度为90%的乙醇溶液做参比，用分光光度计测定萃取液上清液在630nm、647nm、664nm和 750nm波长下的吸光度值，按以下公式计算水体中叶绿素a的含量Chla = [12. 12(D664_D 750)-1. 58 (D647-D750)-O. 08 (D630-D750) ] Ve/V ;其中 Chla 为水样中叶绿素 a 的含量，μ g/ L ;D630、D647、D664和D750分别为萃取液上清液在630nm、647nm、664nm和750nm波长下的吸光度值；Ve为萃取液的总体积，ml ；V为抽滤的水样体积，L0
2.根据权利要求I所述的一种测定水中叶绿素a的方法，其特征在于步骤一中取50ml 水样。
3.根据权利要求I所述的一种测定水中叶绿素a的方法，其特征在于步骤一中取 200ml水样。
4.根据权利要求I所述的一种测定水中叶绿素a的方法，其特征在于步骤一中取 IOOml水样。
5.根据权利要求I所述的一种测定水中叶绿素a的方法，其特征在于步骤一中取 150ml水样。
6.根据权利要求I或2所述的一种测定水中叶绿素a的方法，其特征在于步骤二中置于4°C冷藏12h。
7.根据权利要求I或2所述的一种测定水中叶绿素a的方法，其特征在于步骤二中置于4°C冷藏24h。
8.根据权利要求I或2所述的一种测定水中叶绿素a的方法，其特征在于步骤二中置于4°C冷藏16 20h。
全文摘要
一种测定水中叶绿素a的方法，涉及一种测定水中叶绿素a的方法。是要解决现有的乙醇冷冻法测定叶绿素a的方法需要盐酸酸化，盐酸使用量不好控制，导致测定稳定性差、重现性差的问题。方法取水样进行过滤，将截留有藻细胞的滤膜剪碎放入乙醇溶液中，冷藏后离心，收集上清液，再补加乙醇溶液，离心，收集上清液，合并上清液，加入乙醇溶液定容至10ml，得萃取液；将萃取液离心，得萃取液上清液，测定萃取液上清液在630nm、647nm、664nm和750nm波长下的吸光度值，计算水体中叶绿素a的含量。本发明无需研磨，可大大节省人力，并避免因转移萃取液而造成的叶绿素损失；不受盐酸酸化程度的影响；提取更完全，结果重现性好。
文档编号G01N1/42GK102590118SQ20121004634
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月27日 优先权日2012年2月27日
发明者安众一, 张素春, 杜茂安, 杨雪, 舒坦 申请人:哈尔滨工业大学