专利名称：使用液相色谱荧光法测定水产品中己烯雌酚残留量的方法
技术领域：
—种使用液相色谱荧光法测定水产品中己烯雌酚残留量的方法。
背景技术：
己烯雌酚属激素类药物，添加在饲料中，有促进鱼类等养殖活体生长的作用，目前 在水产养殖上有广泛的使用。
己烯雌酚作为一种人工合成的化学物质，具有较强的类雌激素作用。经科学试验
确证，己烯雌酚是一种致癌物质，长期食用，会对人和动物的健康造成危害，甚至致癌，乃至
威胁生命。世界多数国家已经禁止在饲料中使用己烯雌酚。我国农业部第193号公告规定，
截止2002年5月15日，己烯雌酚及其盐、酯制剂停止在所有食品动物中使用。 为了满足检测所有食品动物中是否含有己烯雌酚成分，需要有切实可行的检测方法。 以前，己烯雌酚残留的检测方法有ELLISA法、HPLC紫外法、GC-MS法、LC-MS/MS法。 HPLC紫外法的测限为0. 25mg/kg。 ELLISA法虽然测限比较低，但因其操作方法复杂和过为 专业，只适合作为一种筛选方法使用。GC-MS法和LC-MS/MS法成本昂贵，无法在生产中普及 使用。 目前，尚没有成本低廉、测限又可以满足使用需求的DES(己烯雌酚)残留检测方 法，不能满足社会进步和市场日益繁荣的需求。
发明内容
本发明设计一种使用液相色谱荧光法测定水产品中己烯雌酚残留量的方法，通过 对己烯雌酚进行磺化水解处理，使其生成发有荧光的反应物，然后用高效液相色谱荧光检 测器对其进行分析，从而得到能够与LC-MS/MS法相媲美的灵敏度和回收率，适合水产品中 己烯雌酚残留量的测定。 本发明成本低廉、方法简洁、测限可以满足使用需求，适合在生产实践中推广使 用。 本发明使用的仪器如下Waters 2695高效液相色谱仪，配2475荧光检测器、高速离心机(LG-10A)、超声波 清洗器、氮吹仪、旋转蒸发仪、真空装置和机械泵或ASPEC XL4自动固相萃取系统、SLH柱、 SPE装置、正相固相萃取小柱(SLH)。
本发明使用的试剂如下 己烯雌酚标准品(99. 5 % ，美国SIGMA-ALDRICH公司)、硫酸(分析纯)、溴化十六 烷基三甲铵(分析纯)、甲酸(色谱纯)、乙酸乙酯(色谱纯)、甲醇(色谱纯)。
本发明的色谱条件如下 色谱柱Sunfire C184. 6mmX 150mm， 5 ii m ;流动相A为甲醇，B为2mmol/L溴化 十六烷基三甲铵；A : B = 40 : 60 ;流速0. 8mL/min ;柱温35。C;激发波长发射波长进样量:20il L。 本发明的方法如下 (1)称取10g绞碎的水产品样品于50mL塑料离心管中，加入乙酸乙酯15_25mL， 均质25-30s，7000r/min离心5-15min，移取乙酸乙酯层于100mL梨形瓶中，残渣再加入 10mL乙酸乙酯，重复提取一次，离心后合并乙酸乙酯层，于40-5(TC旋转蒸发至含水量低于 1-3%，用l-3mL正己烷-乙酸乙酯(85+15)混合溶剂溶解残留物，搅拌5_8分钟；
(2)用4-6ml正己烷、4-6mL乙酸乙酯活化SLH柱，将提取液加到SLH柱上，并控制 流速不超过1. 5-2. 5mL/min ;用l-3mL正己烷，l_3ml正己烷-乙酸乙酯(85+15)混合溶液淋 洗SLH柱，用8-12mL正己烷-乙酸乙酯(80+20)混合溶液洗脱，流速控制不超过1. 5_2. 5mL/ min，收集洗脱液，40-6(TC水浴氮气吹干至初始状态； (3)在氮气吹干的离心管中加入0. 5-1. 5mL硫酸，漩涡混合0. 3-0. 7min，放置 80-100min，在离心管中加入7-9mL水，漩涡混合0. 3-0. 7min，放置25-35min，加入4-6mL乙 酸乙酯提取液，提取液40-6(TC水浴氮气吹干至2-4%含水量，用lmL流动相定容，供高效液 相色谱测定即可。 使用本发明时，配制浓度为1. 0， 2. 0， 5. 0， 10. 0， 50. 0， 100. 0 ii g/L的己烯雌酚标 准溶液，按本发明工艺步骤和仪器条件，可得到己烯雌酚浓度(Y)与峰面积(x)之间的线性 关系，相关系数r大于0. 99。按信噪比大于3计算，水产品中的己烯雌酚的检出限可达到 0. 1 ii g/Kg。 本发明成本低廉、方法简洁、测限低，适合在生产实践中推广使用，是市场中需要 的技术手段，有积极的社会意义和社会需求。
具体实施例方式
现举一实例对本发明做进一步说明。
实施例 以测定海参中己烯雌酚残留量为例 (1)称取10g绞碎的水产品样品于50mL塑料离心管中，加入乙酸乙酯20mL，均质 30s，7000r/min离心10min，移取乙酸乙酯层于100mL梨形瓶中，残渣再加入10mL乙酸乙 酯，重复提取一次，离心后合并乙酸乙酯层，于45t:旋转蒸发至干，用2mL正己烷-乙酸乙酯 (85+15)混合溶剂溶解残留物，搅拌6分钟； (2)用5ml正己烷、5mL乙酸乙酯活化SLH柱，将提取液加到SLH柱上，并控制流 速不超过2mL/min ;用2mL正己烷，2ml正己烷-乙酸乙酯(85+15)混合溶液淋洗SLH柱， 用lOmL正己烷-乙酸乙酯(80+20)混合溶液洗脱，流速控制不超过2mL/min，收集洗脱液， 5(TC水浴氮气吹干至初始状态； (3)在氮气吹干的离心管中加入lmL硫酸，漩涡混合O. 5min，放置90min，在离心管 中加入8mL水，漩涡混合0. 5min，放置30min，加入5mL乙酸乙酯提取液，提取液5(TC水浴氮 气吹干，用lmL流动相定容，供高效液相色谱测定即可。 实例证明，在海参样品中添加标准溶液，按照本发明的方法进行回收，重复5次， 计算回收率和精密度，结果表明添加量为0. 1 0. 5ii g/kg水平时，平均回收率均大于 70% ;相对标准偏差都小于10%。
权利要求
一种使用液相色谱荧光法测定水产品中己烯雌酚残留量的方法，其特征在于(1)称取10g绞碎的水产品样品于50mL塑料离心管中，加入乙酸乙酯15-25mL，均质25-30s，7000r/min离心5-15min，移取乙酸乙酯层于100mL梨形瓶中，残渣再加入10mL乙酸乙酯，重复提取一次，离心后合并乙酸乙酯层，于40-50℃旋转蒸发至含水量低于1-3％，用1-3mL正己烷-乙酸乙酯(85+15)混合溶剂溶解残留物，搅拌5-8分钟；(2)用4-6ml正己烷、4-6mL乙酸乙酯活化SLH柱，将提取液加到SLH柱上，并控制流速不超过1.5-2.5mL/min；用1-3mL正己烷，1-3ml正己烷-乙酸乙酯(85+15)混合溶液淋洗SLH柱，用8-12mL正己烷-乙酸乙酯(80+20)混合溶液洗脱，流速控制不超过1.5-2.5mL/min，收集洗脱液，40-60℃水浴氮气吹干至初始状态；(3)在氮气吹干的离心管中加入0.5-1.5mL硫酸，漩涡混合0.3-0.7min，放置80-100min，在离心管中加入7-9mL水，漩涡混合0.3-0.7min，放置25-35min，加入4-6mL乙酸乙酯提取液，提取液40-60℃水浴氮气吹干至2-4％含水量，用1mL流动相定容，供高效液相色谱测定即可。
全文摘要
一种使用液相色谱荧光法测定水产品中己烯雌酚残留量的方法，(1)称取10g绞碎的水产品样品于50mL塑料离心管中，加入乙酸乙酯15-25mL，均质25-30s，7000r/min离心5-15min，移取乙酸乙酯层于100mL梨形瓶中，用1-3mL正己烷-乙酸乙酯(85+15)混合溶剂溶解残留物，搅拌5-8分钟；(2)用4-6ml正己烷、4-6mL乙酸乙酯活化SLH柱，将提取液加到SLH柱上，用8-12mL正己烷-乙酸乙酯(80+20)混合溶液洗脱，流速控制不超过1.5-2.5mL/min，收集洗脱液，40-60℃水浴氮气吹干至初始状态；(3)在氮气吹干的离心管中加入0.5-1.5mL硫酸，在离心管中加入7-9mL水，用1mL流动相定容，供高效液相色谱测定即可。
文档编号G01N30/74GK101718755SQ200910223269
公开日2010年6月2日 申请日期2009年11月23日 优先权日2009年11月23日
发明者刘慧慧, 宫向红, 张世娟, 张秀珍, 徐英江, 田秀慧 申请人:山东省海洋水产研究所