专利名称：与溶基质蛋白酶1特异地发生反应的单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及与溶基质蛋白酶(stromelysin) 1特异地发生反应的单克隆抗体以及使用了该抗体的免疫染色法及免疫学测定法。
背景技术：
在血管、淋巴管以及关节软骨的基底膜或者结缔组织的构成蛋白质即所谓的细胞外基质的分解中，统称为基质金属蛋白酶(MMPs)的一类酶参与其中。MMPs中有亚类，溶基质蛋白酶1、2及3属于溶基质蛋白酶类的亚类。溶基质蛋白酶1也被称作蛋白多糖酶 (proteoglycanase)或MMP-3，是在受到各种细胞因子或各种增殖因子等刺激的成纤维细胞或肿瘤细胞中产生的物质。在生物体内，除了在类风湿性关节炎疾病患者的关节局部产生之外，还存在于血液中或关节液中(专利文献1)。因而，患者中的溶基质蛋白酶1的定量被用于类风湿性关节炎的诊断中。另外，溶基质蛋白酶2 (MMP-10)是由Muller等人将基因克隆，从而具有与溶基质蛋白酶1相同的底物特异性(非专利文献1)。溶基质蛋白酶3 (MMP-Il)是由Basset等人将基因克隆，被认为其与癌的发展程度有关(非专利文献2)。现有技术文献专利文献专利文献1 日本特公平8-5920号公报非专利文献非专利文献1 =Muller 等，Biochem. J.，253，187-192，1988非专利文献2 =Basset 等，Nature, 348,699-704,1990
发明内容
发明所要解决的课题溶基质蛋白酶1、2及3具有非常近似的氨基酸序列和底物特异性，在制作针对溶基质蛋白酶1的抗体时，与溶基质蛋白酶2或3发生交叉反应的可能性很高。上述专利文献1中，虽然得到了很多针对溶基质蛋白酶1的单克隆抗体，但这些抗体具有与溶基质蛋白酶2或3的交叉反应性。为了更加精确地诊断类风湿性关节炎，有必要进一步精度良好地对溶基质蛋白酶1进行定量。因而，本发明的课题在于以更高的灵敏度更正确地对溶基质蛋白酶1进行定量。用于解决课题的手段本发明提供不与溶基质蛋白酶2及溶基质蛋白酶3发生交叉反应、而是与溶基质蛋白酶1特异地发生反应的单克隆抗体。本发明的单克隆抗体由于不与溶基质蛋白酶2及溶基质蛋白酶3发生交叉反应，因而即便在试样中含有溶基质蛋白酶2或溶基质蛋白酶3， 也可仅与溶基质蛋白酶1特异地发生反应。上述单克隆抗体的对溶基质蛋白酶2及溶基质蛋白酶3的交叉反应性优选为对溶基质蛋白酶1的反应性的5%以下。这种单克隆抗体对溶基质蛋白酶1更为特异。另外，本发明提供一种单克隆抗体，其为与由序列号1的一部分氨基酸序列构成的肽特异地反应、且与溶基质蛋白酶1特异地发生反应的单克隆抗体，其中，该氨基酸序列含有序列号ι的第425号 第436号的序列、该肽的长度为12 20个氨基酸残基。上述单克隆抗体优选不与溶基质蛋白酶2及溶基质蛋白酶3发生交叉反应。序列号1的氨基酸序列表示溶基质蛋白酶1的氨基酸序列，认为由序列号1的第425号 第436号序列构成的肽与交叉反应性有关。另外，本发明提供一种单克隆抗体，其为与溶基质蛋白酶1特异地发生反应的单克隆抗体，其中，通过利用赖氨酰内肽酶将溶基质蛋白酶1分解，使所述抗体对溶基质蛋白酶1的反应性消失。上述单克隆抗体优选与溶基质蛋白酶2及溶基质蛋白酶3不发生交叉反应。通过赖氨酰内肽酶的分解使反应性消失的单克隆抗体具有识别溶基质蛋白酶1蛋白质的高级结构进行反应的可能性。本发明的单克隆抗体可用于免疫染色法。根据使用了本发明的与溶基质蛋白酶2 及溶基质蛋白酶3不发生交叉反应的单克隆抗体的免疫染色法，即便试样中含有溶基质蛋白酶2或溶基质蛋白酶3，它们也不会被染色，可以特异性地将溶基质蛋白酶1可视化。本发明的单克隆抗体可用于对溶基质蛋白酶1进行定量的溶基质蛋白酶1的免疫学测定法。根据使用了本发明的不与溶基质蛋白酶2及溶基质蛋白酶3发生交叉反应的单克隆抗体的免疫学测定法，即便溶基质蛋白酶2及溶基质蛋白酶3含有在试样中也检测不到这些物质，因而可以准确度良好地对溶基质蛋白酶1进行定量。上述免疫学测定法是以使用1种单克隆抗体的竞争型免疫测定、使用2种单克隆抗体的夹心法为代表的免疫测定以及利用使用2种以上单克隆抗体的凝集法等的免疫测定法，当使用2种以上的单克隆抗体时，优选使所用的单克隆抗体中的至少1种为本发明的单克隆抗体。通过使用2种以上的单克隆抗体，对溶基质蛋白酶1的特异性增高，可以更为正确地对溶基质蛋白酶1进行定量。发明的效果根据本发明，能够以更高灵敏度更精确地对溶基质蛋白酶1进行定量。
图1为表示将溶基质蛋白酶1肽分级所获得的各级分的肽与单克隆抗体的反应性的图。
具体实施例方式本发明中使用的单克隆抗体也可以是由Kohler等，Nature，256，495，1975等公开的利用使用骨髓瘤细胞的细胞融合技术所获得的单克隆抗体。本发明中使用的单克隆抗体可通过以下工序制作。1.免疫原性抗原的制备2.利用免疫原性抗原进行的动物免疫3.骨髓瘤细胞的制备4.抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合
5.杂交瘤(融合细胞)的选择及单克隆化6.单克隆抗体的制造7.不与溶基质蛋白酶2及3发生交叉反应的单克隆抗体的挑选1.免疫原性抗原的制备作为抗原，例如可以使用从正常人皮肤成纤维细胞NB1RGB(RCB222)培养上清中根据Obata等，Clin. Chim. Acta, 211, 59-72,1992的方法进行精制所获得的溶基质蛋白酶 1。如此获得的溶基质蛋白酶1还可进一步制成免疫原性缀合物等，但也可直接与适当的佐剂相混合后用于将动物免疫。另外，溶基质蛋白酶1还可借助适当的缩合剂使将其片段化的产物与各种载体蛋白质类相结合而制成半抗原-蛋白质的免疫原性缀合物。例如，可以由从天然细胞中利用分子克隆获得的DNA序列或者已知的基因组序列中使用酶或者通过化学合成获得DNA序列或修饰DNA序列，作为使其在微生物、动物、植物或昆虫等中表达所获得的重组体抗原使用。另外，还可使用利用这些信息通过肽化学合成法获得的含有对溶基质蛋白酶1特异性的氨基酸序列的肽或变构肽。当使其与载体蛋白质类相结合时，可以首先将载体蛋白质类活化。这种活化可举出导入活化键合基团。作为活化键合基团，可举出(1)活化酯或活化羧基、例如硝基苯基酯基、五氟苯基酯基、1-苯并三唑酯基、N-琥珀酰亚胺酯基等，(2)活化二硫基、例如2-吡啶基二硫基等。作为载体蛋白质类，可举出钥孔戚血蓝蛋白(KLH)，牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白、球蛋白、聚赖氨酸等多肽，细菌菌体成分、例如BCG等。2.利用免疫原性抗原进行的动物免疫在对动物进行免疫时，可以按照例如松村繁等编、実験生物学耩座14、免疫生物学、丸善株式会社、昭和60年、日本生化学会编、続生化学実験耩座5、免疫生化学研究法、 灰京化学同人、1986年、日本生化学会编、新生化学実験耩座12、分子免疫学III、抗原·抗体·補体、東京化学同人、1992年等中所记载的方法进行。作为与抗原一同使用的佐剂，例如可举出弗氏完全佐剂、Ribi佐剂、百日咳疫苗、BCG、脂质A、脂质体、氢氧化铝、二氧化硅等。免疫例如使用以BALB/c等小鼠为代表的动物来进行。抗原的投予量例如对于小鼠以约1 400 μ g/动物的量通常注射于宿主动物的腹腔内或皮下，之后每隔1 4周、优选每隔1 2周反复进行2 10次左右的追加免疫至腹腔内、皮下、静脉内或肌肉内。作为免疫用的小鼠，除了 BALB/c系小鼠之外，还可使用BALB/c系小鼠与其他系小鼠的Fl小鼠等。 可以根据需要制备抗体效价测定体系，测定抗体效价以确认动物免疫的程度。3.骨髓瘤细胞的制备作为细胞融合中使用的可无限增殖的细胞株(肿瘤细胞株)，可以从不产生免疫球蛋白的细胞株中挑选，例如可使用P3-NS-l-Ag4-l (NS-U Kohler等人，Eur. J. Immunol.， 6，511 519，1976)、SP2/0_Agl4 (SP2、Shulman 等人，Nature, 276, 269 270，1978)、小鼠骨髓瘤 M0PC-21 细胞系来源的 P3-X63-Ag8-Ul (P3U1、Yelton 等人，Current topics in Microbiol, and Immunol.，81，1 7，1978)、P3_X63_Ag8 (X63、Kohler 等人，Nature, 256, 495 497，1975)、P3-X63_Ag8. 653(653、Kearney 等人，J. Immunol.，123，1548 1550， 1979)等。8-氮杂鸟嘌呤耐性的小鼠骨髓瘤细胞株可以是在于Dulbecco' s Modified Eagle Medium培养基(DMEM培养基)、RPMI_1640培养基等细胞培养基中添加例如青霉素、 阿米卡星等抗生素、胎牛血清(FCS)等，进而添加8-氮杂鸟嘌呤(例如5 45yg/ml)的培养基中传代，在细胞融合的2 5日前用正常培养基传代，准备所需数量的细胞株。另外，使用细胞株还可以是在约37°C下将冷冻保存株完全解冻后用RPMI-1640培养基等正常培养基洗涤3次以上后，在正常培养基中培养，准备所需数量的细胞株。4.抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合根据上述2.的工序进行了免疫的动物、例如小鼠在末次免疫后的2 5日后将其脾脏摘出，获得脾细胞悬浮液。除了脾细胞之外，还可获得生物体各部位的淋巴结细胞，将其用于细胞融合。将如此获得的脾细胞悬浮液与按照上述3.的工序获得的骨髓瘤细胞株放置于例如最小必需培养基(MEM培养基)、DMEM培养基、RPMI-1640培养基等细胞培养基中，添加细胞融合剂、例如聚乙二醇。作为细胞融合剂，可以使用其他各种在该领域中已知的物质，例如进行了灭活的日本血凝病毒(HVJ =Hemagglutinating virus of Japan)等。 优选可添加例如30 60%的聚乙二醇0. 5 anl。这种聚乙二醇的分子量优选为1000 8000、更优选分子量为1000 4000。融合培养基中的聚乙二醇的浓度优选为30 60%。 也可以根据需要添加少量的例如二甲基亚砜等以促进融合。融合中使用的脾细胞(淋巴细胞)骨髓瘤细胞株的比例例如可举出1 1 20 1、更优选为4 1 10 1。融合反应进行1 10分钟，接着添加RPMI-1640培养基等细胞培养基。融合反应处理还可进行多次。融合反应处理后通过离心等将细胞分离，之后移至选择用培养基。5.杂交瘤(融合细胞)的选择及单克隆化作为选择用培养基，例如可举出含有次黄嘌呤、氨基蝶呤及胸腺嘧啶脱氧核苷的含FCS的MEM培养基或RPMI-1640培养基等培养基、所谓的HAT培养基。选择培养基交换的方法通常可以在次日添加与分注至培养板中的容量相当容量的培养基，之后每隔1 3日用HAT培养基每次交换一半量地进行，也可适当对此加以变更地进行。另外，可以在融合后的第8 16日，利用除去了氨基蝶呤的所谓HT培养基每隔1 4日进行培养基交换。作为饲养细胞，例如可使用小鼠胸腺细胞，有其优选的情况。例如利用放射免疫分析(RIA)、 酶免疫分析(ELISA)、荧光免疫分析(FIA)等测定体系或者荧光激活细胞分离装置(FACS) 等，使用溶基质蛋白酶1或其片段肽或标记抗小鼠抗体对杂交瘤的增殖旺盛的培养孔的培养上清检测目标抗体，进行筛选、分离。接着，对产生目标抗体的杂交瘤进行克隆。克隆可通过在琼脂培养基中挑出群落或者通过有限稀释法进行。更优选利用有限稀释法进行克隆。 克隆优选进行多次。6.单克隆抗体的制造所得的杂交瘤株可以在含FCS的MEM培养基、RPMI-1640培养基等适当的增殖用培养基中培养，由其培养基上清中可获得所需的单克隆抗体。为了获得大量的抗体，可举出将杂交瘤腹水化。此时，可以将各杂交瘤移植至与骨髓瘤细胞来源的动物同系的组织相容性动物的腹腔内并使其增殖，或者将各杂交瘤移植至例如裸鼠等中并使其增殖，然后将在该动物的腹水中产生的单克隆抗体回收，从而获得。在杂交瘤移植之前，可以将降植烷(2， 6，10，14-四甲基十五烷)等矿物油投予至腹腔内后使杂交瘤增殖，再采集腹水。腹水液可以直接使用，或者利用以往公知的方法、例如硫酸铵沉淀法等的盐析、利用kphadex等的凝胶过滤法、离子交换色谱法、电泳法、透析、超滤法、亲和层析法、高效液相色谱法等进行精制制成单克隆抗体后使用。优选含有单克隆抗体的腹水可以在进行硫酸铵分级后，利用 DEAE-琼脂糖凝胶等阴离子交换凝胶及蛋白A柱等亲和层析柱等处理来进行精制分离处理。特别优选地可以举出固定有抗原或抗原片段(例如合成肽、重组抗原蛋白质或肽等抗体特异性识别的部位)的亲和层析、固定有蛋白A的亲和层析等。7.不与溶基质蛋白酶2及3发生交叉反应的抗体的挑选从6.中获得的针对溶基质蛋白酶1的单克隆抗体中挑选不与溶基质蛋白酶2及溶基质蛋白酶3发生交叉反应的抗体。挑选可通过免疫测定、例如竞争型免疫测定或非竞争型免疫测定来进行，可使用RIA、ELISA等，也可进行或不进行B-F分离。优选利用直接吸附法或夹心法的ELISA。测定可以是直接法也可以是间接法。另外还可使用间接法的变法、 例如PAP法(过氧化物酶抗过氧化物酶法)、ABC法(亲和素生物素复合法)、蛋白A法等。例如在利用直接吸附法的ELISA中，以一定浓度的溶基质蛋白酶1作为抗原使其固相化。固相可优选使用后示的载体。在固相化后，优选使不参与抗原抗体反应及酶反应的蛋白质吸附于固相上并进行封闭。接着，使对溶基质蛋白酶1的单克隆抗体与固相相接触，进行抗原抗体反应。单克隆抗体可用酶标记，也可不用酶标记。未反应的多余抗体也可通过对固相进行洗涤而除去。在单克隆抗体上标记酶时，添加酶的底物，测定酶反应的产物量。当未在单克隆抗体上标记酶时，使与单克隆抗体特异地发生反应的用酶进行了标记的抗体(二抗)作用于单克隆抗体。将未与单克隆抗体结合的二抗除去，添加酶的底物，测定酶反应的产物量。酶反应的产物量与对溶基质蛋白酶1的反应性成比例。接着，分别以溶基质蛋白酶2及溶基质蛋白酶3为抗原，实施利用上述直接吸附法的ELISA。测定酶反应的产物量。由于酶反应产物的量与对各抗原的反应性成比例，因而将分别使用溶基质蛋白酶2及3时的酶反应产物的量相对于使用溶基质蛋白酶1时的酶反应产物的量分别作为对溶基质蛋白酶2及3的交叉反应性。分别测定对溶基质蛋白酶2及3 的交叉反应性，挑选出与两者均不发生交叉反应的单克隆抗体。除了利用上述直接吸附法的ELISA的测定以外，例如通过夹心法的ELISA，也可将本发明的不与溶基质蛋白酶2及溶基质蛋白酶3发生交叉反应、而与溶基质蛋白酶1特异地发生反应的单克隆抗体挑选出。在夹心法中，使用2种针对溶基质蛋白酶1的抗体。使其中一者为针对6.中获得的溶基质蛋白酶1的单克隆抗体、另一者为已知与溶基质蛋白酶特异地发生反应的单克隆抗体。作为已知与溶基质蛋白酶特异地发生反应的单克隆抗体， 例如可以使用上述专利文献1中记载的针对溶基质蛋白酶1的单克隆抗体。将其中一个的单克隆抗体固相化。在固相化后，优选使不参与抗原抗体反应及酶反应的蛋白质吸附于固相并进行封闭。接着，添加作为抗原的一定浓度的溶基质蛋白酶1及另一个单克隆抗体，进行抗原抗体反应。单克隆抗体可以用酶等进行标记。未反应的多余抗体可以通过对固相进行洗涤而除去。添加酶的底物，测定酶反应的产物量。酶反应产物的量与对溶基质蛋白酶 1的反应性成比例。接着，分别以溶基质蛋白酶2及溶基质蛋白酶3为抗原，实施利用上述夹心法的 ELISA。测定酶反应的产物的量。由于酶反应产物的量与对各抗原的反应性成比例，因而将分别使用溶基质蛋白酶2及3时的酶反应产物的量相对于使用溶基质蛋白酶1时的酶反应产物的量分别作为对溶基质蛋白酶2及3的交叉反应性。分别测定对溶基质蛋白酶2及3 的交叉反应性，挑选出与两者均不发生交叉反应的单克隆抗体。此外，本说明书中的与抗原“特异地发生反应”或“显示反应性”是指在进行利用直接法或夹心法的任一种的ELISA的抗原抗体反应时，例如在室温下进行1小时以上或者在4°C下进行一晚的抗原抗体反应，将固相洗涤后，使用四甲基联苯胺(TMB)等显色剂进行利用酶标记的显色反应，之后利用硫酸停止显色反应，在此测定条件下，A450(与一抗为Ong/ ml时之差)为0.05以上。优选A450为0.08以上、更优选为0. 1以上。另外，本说明书中所说的“对溶基质蛋白酶2的交叉反应性”是指在将单克隆抗体对溶基质蛋白酶1的反应性设为100%时单克隆抗体对溶基质蛋白酶2的反应性的大小。“对溶基质蛋白酶3的交叉反应性”也是同样含义。交叉反应性的大小也可通过上述利用直接吸附法或夹心法的ELISA 的任何一种方法测定。本说明书中所说的“不发生交叉反应”是指通过直接吸附法或夹心法的任何一种ELISA测定的交叉反应性为5%以下的情况。优选通过夹心法测定的交叉反应性为5%以下。本发明的单克隆抗体对溶基质蛋白酶2及3的交叉反应性优选为2. 4% 以下、更优选为1.3%以下。8.溶基质蛋白酶1的反应部位的特定如上获得的与溶基质蛋白酶1特异地发生反应、但不与溶基质蛋白酶2及溶基质蛋白酶3发生交叉反应的单克隆抗体与溶基质蛋白酶1的特定反应部位发生反应。通过鉴定这种反应部位，按照1. 6.中说明过的方法制作与该反应部位发生反应的单克隆抗体， 可以调节所制作的单克隆抗体的交叉反应性。反应部位可以如下鉴定。通过酶将溶基质蛋白酶1分解为肽。利用色谱法等以往公知的方法对所得肽进行分级，在使通过7.获得的单克隆抗体与各级分的肽发生反应时，则在反应性高的级分中含有作为溶基质蛋白酶1的反应部位的肽。该反应性高的级分所含的肽可以利用以往公知的方法进一步精制，利用公知的氨基酸序列分析法，可以确定反应部位的氨基酸序列。9.显示与由溶基质蛋白酶1的一部分构成的肽的反应性的单克隆抗体的挑选另外，本发明提供一种单克隆抗体，其为与由序列号1的一部分氨基酸序列构成的肽特异地发生反应、且与溶基质蛋白酶1特异地发生反应的单克隆抗体，其中，该氨基酸序列含有序列号ι的第425号 第436号的序列，且该肽的长度为12 20个氨基酸残基。 序列号1的氨基酸序列为溶基质蛋白酶1蛋白质的氨基酸序列。认为由序列号1的第425 号 第436号的序列构成的肽与交叉反应性有关。上述单克隆抗体可通过从6.中所得的对溶基质蛋白酶1的单克隆抗体中挑选出显示与由序列号1的第425号 第436号序列构成的肽的反应性的单克隆抗体而获得。挑选可通过7.中所示的测定法进行，例如在7.中所示的利用直接吸附法的ELISA中，使用由序列号1的第425号 第436号序列构成的肽代替溶基质蛋白酶1作为抗原即可。上述单克隆抗体优选不与溶基质蛋白酶2及溶基质蛋白酶3发生交叉反应。与溶基质蛋白酶2及溶基质蛋白酶3不发生交叉反应的单克隆抗体可通过7.所示的方法进行挑选。10.通过溶基质蛋白酶1的分解而使反应性消失的单克隆抗体的挑选另外，本发明提供一种单克隆抗体，其为与溶基质蛋白酶1特异地发生反应的单克隆抗体，其中，通过利用赖氨酰内肽酶将溶基质蛋白酶1分解，使所述抗体对溶基质蛋白酶1的反应性消失。这种单克隆抗体为识别溶基质蛋白酶1蛋白质的二级结构或三级结构等立体结构的单克隆抗体。“通过将溶基质蛋白酶1分解使所述抗体对溶基质蛋白酶1的反应性消失”是指溶基质蛋白酶1分解后的反应性低于分解前的反应性。这种单克隆抗体可以通过从6.中所得的对溶基质蛋白酶1的单克隆抗体中如下进行挑选而获得。通过酶将溶基质蛋白酶1分解成肽。在分解前和分解后比较与溶基质蛋白酶1特异地发生反应的单克隆抗体的对溶基质蛋白酶1的反应性，挑选出溶基质蛋白酶1分解后的反应性低于分解前的反应性的单克隆抗体。分解后的反应性越低，则越是无论溶基质蛋白酶1的一级结构如何而能识别溶基质蛋白酶1的立体结构、与溶基质蛋白酶1发生反应的单克隆抗体。优选在使分解前的对溶基质蛋白酶1的反应性为100%时，分解后的反应性为10%以下。反应性可以通过7.所示方法的直接吸附法或夹心法的任何一种ELISA进行测定，优选通过直接吸附法的ELISA测定的分解后的反应性为分解前的反应性的10%以下。更优选为8.0% 以下、进一步优选为7. 3%以下。如此获得的单克隆抗体可使用市售的同种型特异性的抗小鼠Ig抗体、例如同种型特异性的兔抗小鼠Ig抗体等，对该抗体构成链的重链和轻链的类型进行研究。还可确定对所得单克隆抗体进行编码的碱基序列，并利用基因重组技术制作抗体。还可利用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等酶对这些抗体进行处理，根据情况进行还原制成Fab、Fab’、F(ab’)2等抗体片段后进行使用。作为进行标记的抗体，可以使用IgG 级分、例如对抗体含有物进行硫酸铵分级后利用DEAE-琼脂糖等阴离子交换凝胶进行处理所获得的IgG级分等，可使用进一步进行胃蛋白酶消化后实施还原所获得的特异性结合部Fab’等。作为这些情况下的标记的例子，例如有下述的酶(过氧化物酶、碱性磷酸酶或 β -D-半乳糖苷酶等)、化学物质、荧光物质或放射性同位素等。利用本发明的不与溶基质蛋白酶2及3发生交叉反应、而与溶基质蛋白酶1特异地发生反应的单克隆抗体，可以进行免疫染色法。本发明的免疫染色法包含以下工序使本发明的单克隆抗体与试样中的抗原反应以形成抗原抗体复合体的工序和使该抗原抗体复合体可视化的工序。抗原抗体复合体可以预先在抗体上加以标记，在抗原抗体反应后改变标记，将其变化作为信号进行检测，从而进行可视化。本发明的免疫染色法可以是对与抗原直接反应的抗体(一抗)进行标记的直接法，也可以是对识别未进行标记的一抗的其他抗体(二抗)进行标记的间接法。另外，还可使用间接法的变法例如PAP法(过氧化物酶抗过氧化物酶法)、ABC法(亲和素生物素复合法)、蛋白A法等。另外，还可对试样进行电泳、将电泳后的产物转移至膜上，对该膜进行免疫染色。根据使用了本发明的单克隆抗体的免疫染色法，即便在试样中混有溶基质蛋白酶2或溶基质蛋白酶3，也可仅由溶基质蛋白酶 1将信号特异地检测、可以将溶基质蛋白酶1的存在及分布可视化。另外，还可利用本发明的单克隆抗体进行免疫细胞染色或免疫组织染色。本发明的单克隆抗体可用于免疫学测定法。本发明的免疫学测定法包含以下工序使本发明的单克隆抗体与试样中的抗原反应以形成抗原抗体复合体的工序；对所形成的抗原抗体复合体进行检测的工序；以及由所检测的抗原抗体复合体的量测定试样中的抗原的量的工序。抗原抗体复合体可以用抗原抗体复合体的浊度的形式进行检测，另外还可预先在抗体上加以标记，在抗原抗体反应后改变标记，将其变化作为信号进行检测。免疫学测定法可通过免疫测定、例如竞争型免疫测定或非竞争型免疫测定来进行，还可使用RIA、 ELISA、凝集法、比浊法、免疫层析法、Western blotting法等，也可进行或不进行B-F分离。 免疫学测定法可以是对直接与抗原发生反应的抗体(一抗)进行标记的直接法，也可以是对识别未进行标记的一抗的其他抗体(二抗)进行标记的间接法。另外，还可使用间接法的变法例如PAP法(过氧化物酶抗过氧化物酶法)、ABC法(亲和素生物素复合法)、蛋白A 法等。
作为利用上述直接法的竞争型免疫测定中所使用的单克隆抗体，使用本发明的单克隆抗体。在夹心法中使用2种单克隆抗体时，使至少一者为本发明的单克隆抗体。另一者只要是识别溶基质蛋白酶1的抗体则无特别限定。只要种类不同，则2种均可使用本发明的与溶基质蛋白酶2及3不发生交叉反应、而与溶基质蛋白酶1特异地发生反应的单克隆抗体。另外，也可以使上述2种单克隆抗体中的一者为用标记物进行了标记的可溶性抗体、使另一者为固相化抗体。在利用凝集法等的免疫测定法中使用的2种以上的单克隆抗体中，使至少1种为本发明的单克隆抗体。只要种类不同，则可全部使用本发明的单克隆抗体。另外，只要至少1种为本发明的单克隆抗体，则可使用3种以上的抗体。在上述免疫学测定法中，例如使用含有已知浓度的溶基质蛋白酶1的标准液来制作浓度标准曲线，由该浓度标准曲线测定试样中的溶基质蛋白酶1的浓度，可以进行溶基质蛋白酶1的定量。根据本发明的免疫学测定法，即便在试样中混有溶基质蛋白酶2或溶基质蛋白酶3，也可不对它们进行检测而是特异性地对溶基质蛋白酶1进行定量。本发明的免疫染色法及免疫学测定法中，可以使用酶等进行了标记的单克隆抗体与结合在载体上的抗体依次反应，也可使其同时反应。另外，还可用酶等对本发明的单克隆抗体进行标记，作为免疫染色用试剂或免疫学测定用试剂。在凝集法中，可以使抗原及2种以上的非标记单克隆抗体同时或依次反应。添加抗体及试样的顺序根据所选的载体系的类型的不同而不同。载体例如可以从后述物质中适当选定。在使用致敏了的塑料等珠粒时， 可以将用酶等进行了标记的单克隆抗体与含有待测定物质的检体试样一同放入适当的试管中，之后添加该致敏了的塑料等珠粒来进行反应。在反应时，可以在保持于适当PH、例如 pH约4 9的适当的缓冲液中进行。特别是作为适当的缓冲剂，例如可举出乙酸酯缓冲剂、 柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、Tris缓冲剂、三乙醇胺缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、甘氨酸缓冲齐U、碳酸盐缓冲剂、Tris-盐酸缓冲剂等。缓冲剂可以相互以任意比例混合后使用。抗原抗体反应优选在约0°C 60°C之间的温度下进行。本发明的免疫染色法及免疫学测定法中，与本发明的单克隆抗体、其他抗体及抗原的孵育处理可进行至达到平衡，也可以在达到抗原抗体反应的平衡之前稍早一点的时刻终止反应，可测定液相或固相的任一者的浊度或酶等标记的存在程度。测定操作还可以使用经自动化的测定装置进行，例如使用比色计、发光检测器、光检测器等对浊度或者底物在酶的作用下发生变换所产生的信号进行检测，实施测定。抗原抗体反应中，可以使分别使用的试剂、待测定的物质、酶等标记稳定化，也可寻求适当的方法使抗原抗体反应本身稳定化。进而，为了将非特异性的反应除去、减少阻碍性影响或者将测定反应活化，还可在孵育溶液中添加蛋白质、稳定化剂、表面活性剂、螯合化剂等。可以实施在该领域中普遍采用或者本领域技术人员已知的用于防止非特异性结合反应的封闭处理，例如可以利用哺乳动物等的正常血清蛋白质、白蛋白、脱脂奶、乳发酵物质、骨胶原、明胶等进行处理。只要是为了防止非特异性的结合反应，这些方法可以没有特别限定地使用。例如，在特定的状况下可以适当采用洗涤、搅拌、振荡、过滤或抗原的预抽提等。特定的试剂、缓冲液等的浓度、温度或孵育处理时间等其他的测定条件可以根据试样中的抗原的浓度、试样的性质等要素进行改变。本领域技术人员可以在使用通常的实验法的同时，适当选择对各测定有效的最佳条件来进行测定。已知很多能够将抗原或抗体固相化的载体，本发明中可以从其中适当选择使用。作为特别优选使用的载体，例如可举出玻璃例如活化玻璃、多孔质玻璃、硅胶、二氧化硅-氧化铝、氧化铝、磁铁、磁合金等无机材料，聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚偏氟乙烯、聚醋酸乙烯酯、聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚丙烯酰胺、交联聚丙烯酰胺、苯乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯醛-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物等，交联化白蛋白、骨胶原、明胶、糊精、琼脂糖、交联琼脂糖、纤维素、微晶纤维素、羧甲基纤维素、醋酸纤维素等天然或改性纤维素、交联糊精、尼龙等聚酰胺、聚氨酯、 聚环氧树脂等有机高分子物质，进一步将它们乳化聚合所获得的物质，细胞、红细胞等，根据需要利用硅烷偶联剂导入有官能团的物质。而且，可以举出滤纸、珠粒、试验容器的内壁、例如试管、滴定板、滴定孔、玻璃小室、合成树脂制小室等合成材料构成的小室、玻璃棒、合成材料构成的棒、使末端变粗或变细的棒、末端带有圆形突起或扁平突起的棒、制成薄板状的棒等固体物质(物体)的表面等。可以使抗体结合在这些载体上，可优选使本发明中所得的对溶基质蛋白酶1特异性结合的单克隆抗体结合在这些载体上。载体与这些参与抗原抗体反应的物质的结合可以通过使用吸附等物理手法，或使用缩合剂等、使用经活化的物质等的化学方法、以及利用了相互的化学结合反应的手法等来进行。作为标记，可以举出酶、酶底物、酶抑制剂、辅基类、辅酶、酶前体、脱辅基酶、荧光物质、色素物质、化学发光化合物、发光物质、显色物质、磁性物质、金属粒子、例如金胶体等、放射性物质等。作为酶，可举出脱氢酶，还原酶、氧化酶等氧化还原酶，对转移例如氨基、 羧基、甲基、酰基、磷酸基等具有催化作用的转移酶，对例如酯键、糖苷键、醚键、肽键等进行水解的水解酶，裂解酶，异构酶，连接酶等。酶还可以复合使用多种酶用于检测。例如还可利用酶的循环。作为代表性的酶标记，可举出辣根过氧化物酶(HRP)等过氧化物酶、大肠杆菌 β -D-半乳糖苷酶等半乳糖苷酶、马来酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、乙酰胆碱酯酶、过氧化氢酶、牛小肠碱性磷酸酶、大肠杆菌碱性磷酸酶等碱性磷酸酶等。使用碱性磷酸酶时，可以使用4-甲基伞形酮基磷酸盐等伞形酮衍生物、硝基苯基磷酸盐等磷酸化苯酚衍生物、利用了 NADP的酶循环体系、荧光素衍生物、二氧杂环丁烷衍生物等底物，通过所产生的荧光、发光等进行测定。还可利用荧光素、荧光素酶体系。使用过氧化氢酶时，由于与过氧化氢反应产生氧，因而可以用电极等对该氧进行检测。作为电极，还可以为玻璃电极、使用难溶性盐膜的离子电极、液膜型电极、高分子膜电极等。酶标记还可以替换成生物素标记体和酶标记亲和素(链霉亲和素)。标记还可使用多个不同种类的标记。在这种情况下，还可以连续或非连续地、且同时或分别地进行多个测定。在形成用于检测标记的信号时，还可利用4-羟基苯基乙酸、1，2_苯二胺、四甲基联苯胺等与辣根过氧化物酶、伞形酮半乳糖苷、硝基苯基半乳糖苷等与β -D-半乳糖苷酶、 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等酶试剂的组合，还可使用通过酶的作用可形成氢醌、羟基苯醌、羟基蒽醌等醌化合物、硫辛酸、谷胱甘肽等硫醇化合物、苯酚衍生物、二茂铁衍生物等的化合物。作为荧光物质或化学发光化合物，可举出异硫氰酸荧光素、例如若丹明B异硫氰酸酯、四甲基若丹明异硫氰酸酯等若丹明衍生物、丹磺酰氯、丹磺酰氟、荧光胺、藻胆蛋白、 丫啶鐺盐、荧光素、荧光素酶、水母发光蛋白等鲁米诺、咪唑、草酸酯、稀土类螯合化合物、香豆素衍生物等。进行标记时，可以利用硫醇基与马来酰亚胺基的反应、吡啶基二硫化物基与硫醇基的反应、氨基与醛基的反应等来进行，可以从公知的方法或本领域技术人员可容易操作的方法、以及对这些方法进行了修饰的方法中适当选择后使用。另外，还可使用可用于免疫原性缀合物制作的缩合剂、可用于与载体结合的缩合剂等。作为缩合剂，例如可举出戊二醛、六亚甲基二异氰酸酯、六亚甲基二异硫氰酸酯、 N，N’ -聚亚甲基双碘乙酰胺、N, N’ -亚乙基双马来酰亚胺、乙二醇双琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、双重氮联苯胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺、3-(2-吡啶二硫基)丙酸琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)、 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸N-磺基琥珀酰亚胺酯、(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯、4-(1-马来酰亚胺基苯基)丁酸N-琥珀酰亚胺酯、N-( ε -马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺(EMCS)、亚氨基四氢噻吩、S-乙酰基巯基琥珀酸酐、3- ’-二硫吡啶基)丙亚氨酸甲酯、4-巯基丁亚氨酸甲酯、3-巯基丙亚氨酸甲酯、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基巯基乙酸酯。作为成为本发明的免疫学测定方法对象的试样，可举出所有形态的溶液或胶体溶液等，优选可举出生物来源的流体试样、例如血液、血浆、血清、关节液、脑脊髓液、唾液、羊水、尿、其他体液、细胞培养液、组织培养液、活检检体、例如细胞、组织、脏器、肿瘤组织等。 上述试样可用于检测患者的类风湿性关节炎。特别优选可举出血浆、血清、关节液等。使用了本发明的单克隆抗体的免疫染色法中，优选使用活检检体、例如细胞、组织、脏器、肿瘤组织。对于上述试样，使用本发明的单克隆抗体作为类风湿性关节炎的标记物，可进行免疫细胞染色法或免疫组织染色法。上述试样可在染色前根据需要进行固定化。固定化时，可使用在该领域中广泛使用的物质或者由其衍生的物质。例如可以使用高碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛、戊二醛、Bouin固定液、福尔马林、多聚甲醛、Zamboni固定液、丙烯醛等。另外，还可用石蜡等进行固定化。本发明还提供一种免疫学测定用试剂，其特征在于，含有本发明的单克隆抗体。根据上述免疫学测定用试剂，可以简单且灵敏度良好地对溶基质蛋白酶1特异性地进行检测。另外，上述试剂可用于检测患者的类风湿性关节炎。本发明还涉及一种在药品或临床检查领域或分析测定领域中允许的包装及试剂盒，其含有1个或多个容器，所述容器填充有1个或多个在本发明的免疫染色法或免疫学测定法中所用的上述物质。在包装及试剂盒中，还可以与这种(单一或多个)容器一起附上使用须知，该使用须知是由规定药品、检验试剂或生物学产物的制造、使用或出售的政府机关指示的形态的使用须知(文件)，是表示与和人相关制品的制造、使用或出售有关的该政府机关认可的使用须知(附带文件)。当将测定试剂或试剂盒用于本发明的免疫染色法或免疫学测定法时，不需要设定特别的条件、操作等。可以在各方法中的通常条件、操作法中加以本领域技术人员的通常的技术考量，构建与本发明的测定对象物质或具有与其实质上为相等活性的物质有关的测定体系。实施例以下，利用实施例具体地说明本发明的单克隆抗体及其制造方法以及使用了该单克隆抗体的免疫染色法和使用该单克隆抗体在免疫学上对溶基质蛋白酶1进行定量的方法。但本发明并不限定于这些示例。
(实施例1抗原及标准品的制作)如下所述，根据Obata等人，Clin. Chim. Acta，211，59-72，1992所记载的方法，由正常人皮肤成纤维细胞NBlRGB(RCB22》培养上清中精制出溶基质蛋白酶1。在含10%胎牛血清、14mM HEPESU. 4g/l NaHC03的RITC80-7基础培养基(pH为7.幻中、在5% C02存在下、37°C下对NBlRGB细胞进行培养，直至汇合成片(confluent)。用IOOml的RITC80-7 基础培养基洗涤细胞后，在含有2g/l乳清蛋白水解物及10000U/1白细胞介素1 α的无血清RITC80-7基础培养基300ml中进行培养，并将其上清回收。将上述上清供至琼脂糖凝胶4B柱。在该琼脂糖凝胶4B柱中填充有下述物质根据手册记载的操作法预先在CNBr-活化琼脂糖凝胶(GE HEALTHCARE公司)上结合有对溶基质蛋白酶1的单克隆抗体55-3G3(国际保藏号FERM BP-3744、保藏日平成3年(1991 年)6月12日、保藏机关独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心、茨城县筑波市东1-1-1筑波中心中央第6)的物质。利用含0. lMNaCl、5mM CaCl2及5g/l CHAPS的 30mM Tris盐酸缓冲液(pH为8. 0)对供有上清的柱进行洗涤，利用3M KSCN将结合于柱的蛋白质洗脱。接着，将上述洗脱液供至用含0.4M NaClUOmM CaCl2及0. 5g/l Brij 35的 50mM Tris盐酸缓冲液(pH为7. 5)进行了平衡化的S印hadex G-25柱(GE HEALTHCARE公司)。收集空隙体积级分，供至用G-25色谱柱进行平衡化的缓冲液相同的缓冲液进行了平衡化的伴刀豆球蛋白A-琼脂糖凝胶柱(GE HEALTHCARE公司)，收集未结合于柱的蛋白质。最后将未结合在伴刀豆球蛋白A柱上的蛋白质级分供至Ultrogel AcA44柱 (PALL公司)，进行色谱分级。通过月桂基硫酸聚丙烯酰胺凝胶电泳确认了蛋白质的纯度。精制过的酶是均一的、显示分子量为57kDa。将该精制酶作为抗原及标准品。溶基质蛋白酶2以R & D Systems 公司制的产品作为标准品使用、溶基质蛋白酶3以Abcam公司制的产品作为标准品使用。(实施例2单克隆抗体的制备)如下所述，根据Obata等人，Clin. Chim. Acta，211，59-72，1992所记载的方法，以实施例1所精制的溶基质蛋白酶1作为抗原，制备了单克隆抗体。(a)利用溶基质蛋白酶1的动物免疫将44. 6 μ g通过实施例1所记载的方法制备的溶基质蛋白酶1与等重量的弗氏完全佐剂一起腹腔内投予6周龄BALB/c雌性小鼠2只，进行初次免疫。之后，在第19日用溶解于含 0. 4MNaCl、10mM CaCl2 及 0. 5g/l Brij35 的 50m M Tris 盐酸缓冲液(pH 为 7. 5)中的40. 4μ g溶基质蛋白酶1进行追加免疫。作为末次免疫，在第55日用43. 2μ g的溶基质蛋白酶1进行免疫。从末次免疫经过3日后，将小鼠脾脏摘出，制备脾脏细胞。(b)抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合使用以下的材料及方法。RPMI 1640 培养基在 RPMI 1640 (JRH Biosciences 制)中添加 24mM 碳酸氢钠、 ImM丙酮酸钠、50U/ml青霉素G钾、50 μ g/ml硫酸链霉素及100 μ g/ml硫酸阿米卡星，用干冰使PH为7. 2，利用0. 22 μ m微孔过滤器进行除菌过滤。NS-I培养基在上述RPMI-1640培养基中添加除菌过滤后的FBS (JRH Biosciences制)直至达到15% (ν/ν)的浓度。PEG4000 溶液在 RPMI-1640 培养基中制备聚乙二醇 4000 (PEG4000，Merck andCO.，Inc.制)50% (w/w)的无血清溶液。脾脏细胞与8-氮杂鸟嘌呤耐性骨髓瘤细胞SP2 (SP2/0_Agl4)的融合按照Oi等人，Selected Methods in Cellular Immunology, 351-371, W. H. Freeman & Co. , 1980 的方法进行。以5 : 1的比例将(a)中制备的脾脏细胞(活细胞率100% )与骨髓瘤细胞(活细胞率100%)融合。用上述RPMI-1640培养基分别对脾脏细胞和骨髓瘤细胞进行洗涤。 接着，将分别悬浮于相同培养基中的脾脏细胞3. 2 X IO8个和骨髓瘤细胞6. 4X IO7个混合。 接着，通过lOOOr.p.m.下10分钟的离心分离使细胞沉淀，将上清完全地抽吸除去。用1分钟的时间将加热至37°C的PEG4000溶液2. Iml滴加到沉淀的细胞中，同时缓慢地搅拌，搅拌1分钟使细胞再次悬浮、分散。接着，用2分钟的时间滴加加热至37°C的RPMI-1640培养基4. anl。用2 3分钟的时间一边不停搅拌一边滴加相同培养基14. 7ml使细胞分散。在 IOOOr. p. m.下对其离心分离7分钟，将上清完全地抽吸除去。接着，在该沉淀细胞中快速添加加热至37°C的NS-I培养基21ml，小心地利用移液管将大的细胞团块分散。然后添加相同培养基42ml进行稀释，在聚苯乙烯制96孔微孔(岩城硝子制)中添加每孔为6X IO5个 /0. Iml的细胞。在 % C02/93%空气中、在温度37°C、湿度100%下培养该微孔。(c)利用选择培养基的杂交瘤的选择性增殖所使用的培养基如下所示。HAT培养基在上述实施例2(b)中所述的NS-I培养基中进一步添加次黄嘌呤 (100 μ Μ)、氨基蝶呤(0. 4μΜ)及胸腺嘧啶脱氧核苷(16 μ Μ)。HT培养基除了除去氨基蝶呤之外，与上述HAT培养基为相同组成。在上述(b)的培养开始后次日(第1日)、用移液管在细胞中添加HAT培养基2滴 (约0. Iml)。在第2、3、5及8日用新的HAT培养基将培养基的一半(约0. Iml)替换。在第11日，对于观察到杂交瘤的充分生长的所有孔，利用以下(d)所记载的ELISA研究阳性孔。(d)细胞融合后的利用ELISA的抗溶基质蛋白酶1抗体产生杂交瘤的选择如下所述，进行利用直接吸附法的ELISA。在96孔微孔板(Nunc公司)中按照 IOOng/孔被覆用0. IM磷酸缓冲液(pH为7. 0)进行了稀释的溶基质蛋白酶1作为抗原。在 4°C下放置一晚以上后，将包被液吸走，用含0. 05% Tween20的PBS(pH为7. 2)对微孔板进行洗涤。以100 μ 1/孔的量添加欲确认的杂交瘤的培养上清(一抗)，在室温下孵育(静置) 约1小时。洗涤后，以100μ 1/孔的量添加作为二抗的用封闭液将山羊抗小鼠Ig(G+M+A) 免疫球蛋白-过氧化物酶(POD) (CAPPEL公司)稀释至1/10000的液体，在室温下孵育(静置)约1小时。洗涤后，以100 μ 1/孔的量添加作为底物的过氧化氢和四甲基联苯胺(TMB)， 在室温下反应约20分钟，以100 μ 1/孔的量添加IM硫酸使反应停止，利用酶标仪(T0S0H、 MPRA4)对测定波长450nm下的吸光度进行测定。对于与溶基质蛋白酶1的反应显示阳性的 16孔实施细胞的冷冻及复苏，实施利用有限稀释法的克隆。(e)克隆使用以下的材料及方法。RPMI 1640 培养基- )在 RPMIIMO 培养基(SIGMAR8758)5OOmld 瓶)中添加胎牛血清(FOETAL BOVINE SERUM) (SIGMA F9423) 50ml、青链霉素溶液 (Penicillin-Streptomycin Solution)(SIGMAP0781)2. 5ml。
含BriClone 的 RPMI 1640 培养基；在 RPMI 1640 培养基-O)中添加 BriClone (杂交瘤克隆培养基)(NICB公司制)至达到5%。在RMI 1640培养基-(2)中使冷冻细胞复苏，使用含BriClone的RPMI1640培养基在96孔微孔的36孔、36孔及M孔中每孔分别添加5个、1个及0. 5个的杂交瘤。在第 5日，在所有孔中追加约0. Iml的RPMI 1640培养基42)。克隆开始后，从第11日开始，在第14日可见杂交瘤的充分生长，对于它们进行下述(f)所记载的ELISA。当所测试的所有孔均非阳性时，确认抗体阳性孔中的群落数，在孔中选择1 3个单群落(没有时选择群落数尽量少的孔)，进行再次克隆。结果，如表1所示，获得12个克隆的对溶基质蛋白酶1的单克隆抗体产生细胞。(f)克隆时的利用ELISA的抗溶基质蛋白酶1抗体产生杂交瘤的选择如下所述，进行利用直接吸附法的ELISA。在利用直接吸附法的ELISA中，在96孔微孔板(Nunc公司)中按照50ng/孔包被用0. IM磷酸缓冲液(pH为7. 0)进行了稀释的溶基质蛋白酶1作为抗原。在4°C下放置一晚以上后，将包被液吸走，用200μ 1/孔的封闭液 (含BSA及0. IM NaCl的0. OlM磷酸缓冲液、pH为7. 0)在室温下封闭1小时以上。用含0. Tween20及0. IM NaCl的0. OlM磷酸缓冲液(pH为7. 0)对微孔板进行洗涤后，以 100 μ 1/孔的量添加欲确认的杂交瘤的培养上清(一抗)，在室温下孵育(静置)约1小时。洗涤后，以100 μ 1/孔的量添加作为二抗的用封闭液将山羊抗小鼠Ig(G+M+A)免疫球蛋白-过氧化物酶(POD) (CAPPEL公司)稀释至1/3000的液体，在室温下孵育(静置)约1小时。洗涤后，以 100 μ 1/孔的量添加 TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX 公司，Products TMBW-1000-01)，在室温下使其反应约5 10分钟。以100 μ 1/孔的量添加IM硫酸使反应停止，利用酶标仪(TECAN SPECTRA)对测定波长450nm下的吸光度进行测定。(实施例3单克隆抗体的亚类的鉴定)根据实施例2(d)所记载的ELISA，如下鉴定单克隆抗体的亚类。进行实施例2(d) 所记载的直到包被有溶基质蛋白酶1的96孔微孔的封闭之前的操作。用含0. Tween20 及0. IM NaCl的0. OlM磷酸缓冲液(pH为7. 0)进行洗涤后，以100 μ 1/孔的量添加各单克隆抗体产生杂交瘤的培养上清，在室温下孵育(静置)约1小时。在洗涤后，以50 μ 1/孔的量添加同种型特异性的兔抗小鼠Ig抗体(Mouse MonoAb-ID Kit、Zymed Laboratories 公司)，在室温下孵育(静置)约1小时。进一步洗涤后，以50 μ 1/孔的量添加用封闭液将辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体稀释至1/50的溶液，在室温下孵育 (静置)约1小时。洗涤后，以100 μ 1/孔的量添加TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX 公司、Product#TMBW-1000_01)使其显色，以 100 μ 1/ 孔的量添加 IM 硫酸使反应停止，对测定波长450nm下的吸光度进行测定。结果如表1所示，所得的单克隆抗体是Y l/κ为4个、γ 2b/ κ为3个、μ / κ为4个、α / Κ为1个。表1针对溶基质蛋白酶1的单克隆抗体
克隆号亚类296-21C4Y 2b/κ
权利要求
1.一种单克隆抗体，其与溶基质蛋白酶2及溶基质蛋白酶3不发生交叉反应，而与溶基质蛋白酶1特异地发生反应。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其对溶基质蛋白酶2及溶基质蛋白酶3的交叉反应性为其对溶基质蛋白酶1的反应性的5%以下。
3.一种单克隆抗体，其为与序列号1的一部分氨基酸序列所构成的肽特异地发生反应、且与溶基质蛋白酶1特异地发生反应的单克隆抗体，其中，该氨基酸序列含有序列号1 的第425号 第436号的序列，且该肽的长度为12 20个氨基酸残基。
4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其与序列号1的一部分氨基酸序列所构成的肽特异地发生反应，该氨基酸序列含有序列号1的第425号 第436号的序列，且该肽的长度为12 20个氨基酸残基。
5.一种单克隆抗体，其为与溶基质蛋白酶1特异地发生反应的单克隆抗体，其中，通过利用赖氨酰内肽酶将溶基质蛋白酶1分解，使所述抗体对溶基质蛋白酶1的反应性消失。
6.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中，通过利用赖氨酰内肽酶将溶基质蛋白酶1 分解，使所述抗体对溶基质蛋白酶1的反应性消失。
7.一种免疫染色法，其特征在于，使用权利要求1 6任一项所述的单克隆抗体。
8.溶基质蛋白酶1的免疫学测定法，其特征在于，使用权利要求1 6任一项所述的单克隆抗体对溶基质蛋白酶1进行定量。
9.根据权利要求8所述的免疫学测定法，其为使用针对溶基质蛋白酶1的2种以上的单克隆抗体的免疫学测定法，其中，所述单克隆抗体中的至少1种为权利要求1 6任一项所述的单克隆抗体。
全文摘要
本发明的目的在于以更高的灵敏度更正确地对溶基质蛋白酶1进行定量。本发明提供不与溶基质蛋白酶2及溶基质蛋白酶3发生交叉反应、而与溶基质蛋白酶1特异地发生反应的单克隆抗体。
文档编号G01N33/573GK102300878SQ20108000637
公开日2011年12月28日 申请日期2010年1月21日 优先权日2009年2月3日
发明者中村协枝, 藤本升 申请人:第一精密化学株式会社