专利名称：鼠李糖乳杆菌菌毛多肽和产生它们的方法
技术领域：
本发明涉及生命科学和食品、饲料或制药工业。具体而言，本发明涉及新的肽、蛋白质、菌毛结构、多核苷酸以及包含所述多核苷酸、肽、蛋白质或菌毛结构的载体、宿主细胞、产品和药物组合物。本发明也涉及基因簇和抗体。另外，本发明涉及用于产生所述肽、蛋白质、或菌毛结构或产生包含所述肽、蛋白质、或菌毛结构的产品的方法。另外，本发明涉及用于筛选细菌菌株、用于减低或抑制致病菌黏附、促进细菌细胞黏附于黏液和/或上皮和/ 或用于调节受试者中免疫应答的疗法以及用途和方法。再者，本发明涉及用于检测待鉴定和/或抑制的益生细菌菌株或病原菌株的方法。
背景技术：
细菌病原体对宿主组织的侵袭性黏附经常受到从微生物细胞表面向外突出的称作菌毛或伞毛的延长毛发样蛋白质性纤维的促进。在革兰氏阴性致病细菌中，充分认识到菌毛作为定植物在发病机理中的作用并且菌毛装配的总体机理因超过50年的研究被清晰地定义。结构最充分表征的革兰氏阴性菌毛是例如存在于肠致病性大肠杆菌(E.coli)中的I型形式和例如存在于奈瑟氏菌属(Neisseria)和假单胞菌属(I^eudomonas)物种以及大肠杆菌中的IV型形式。一般，革兰氏阴性菌毛长(长度1至4μπι)且薄(宽度5至8nm)， 并且还显示柔性和坚韧的结构特性。这些菌毛总体上由一系列非共价连接的多个蛋白亚基组成，其中所述多个蛋白亚基的装配依赖于特定伴侣蛋白，但是不依赖任何酶活性。经常地，具有黏附特性的蛋白质位于菌毛的顶端。通常认为微生物表面的蛋白质亚基的插入长度促进黏附性顶端蛋白质与相应宿主细胞受体部位之间的无障碍接触，其中所述的宿主细胞受体部位由胞外基质(ECM)的组件或糖蛋白和糖脂的特定糖部分潜在地代表(Scott J. R.和Zahner D，2006，Mol Microbiol 62，320-330 ;Telford，J. L.，等人 2006，Nat Rev Microbiol 4，509-519)。革兰氏阳性菌毛样结构的存在实际上首先在二十世纪60年代后期借助牛肾盂炎棒杆菌(Corynebacterium renale)的电子显微镜结果(Yanagawa,R.等人 1968，Jpn J Vet Res 16,31-37)观察到，并且在后续数年中，已经在一些其他革兰氏阳性细菌物种中找到菌毛，包括在人类中的3种主要侵袭性致病链球菌病原体即，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)禾口月市炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)中最近发现菌毛(Telford，J. L.，等人 2006，Nat Rev Microbiol 4,509-519) 革兰氏阳性菌毛的最详细表征研究源自棒杆菌、链球菌和芽孢杆菌病原体。不同于革兰氏阴性细菌中，革兰氏阳性细菌中的菌毛在宽度上窄得多0至 3nm)并且更难以眼观区分，这也提示在许多革兰氏阳性细菌物种中为何忽视这些菌毛的存在(Kang，H. J.等人2007，Science 318，1625-1628)。迄今，已经通过白喉棒杆菌 (Corynebacterium diphtheriae)中菌毛生物发生的体内表征研究实施对菌毛装配过程的最彻底描述，这也通常是对全部革兰氏阳性菌毛的总体描述(T0n-That，H. *khneewind， 0. 2004, Trends Microbiol 12，2观_2；34)。在结构上，原型菌毛作为由共价交联的蛋白质亚基(称作菌毛蛋白)组成的聚合物出现，其中所述的蛋白质亚基又共价地在基部锚定于细
6胞壁的肽聚糖组分，同时这两种共价键均酶促依赖于不同分选酶家族膜结合转肽酶(即分别是菌毛蛋白特异性分选酶和持家性分选酶)的催化作用(Mandlik，A.等人2008，Trends Microbiol 16，33-40)。革兰氏阳性菌毛一般由3种菌毛蛋白亚基组成，并且在白喉棒杆菌的情况下，这些蛋白质(或编码它们的基因)命名为完全形成菌毛的轴或主链的主要菌毛蛋白亚基SpaA(SpaA)(分选酶介导的菌毛蛋白装配)、附属小菌毛蛋白亚基SpaB(SpaB)和位于菌毛顶端的具有黏附特性的另一种小菌毛蛋白亚基SpaC(SpaC)(
图1)。编码这3种菌毛蛋白亚基的基因作为菌毛蛋白基因簇连同紧邻的至少一种编码菌毛蛋白特异性分选酶的基因定位于相同基因座内部。另外，菌毛蛋白簇内部的基因经常在两端侧翼为转座元件， 提示其源于水平基因转移。全部这些基因的转录处于相同的方向并显示有操纵子调控作用 (Scott J.R.禾口 Zahner D，2006，MoI Microbiol 62，320—330)。依赖于每种菌毛蛋白亚基一级序列内部的几个不同保守基序和结构域的整体革兰氏阳性菌毛装配过程的修订模型包括4个基本阶段(Mandlik，Α.等人2008，Proc Natl Acad Sci USA 105,14147-14152 ；Telford, J. L.，等人 2006，Nat Rev Microbiol 4， 509-519)(图1)。在第一阶段，各自含有N端信号肽的菌毛蛋白通过Sec依赖性途径经细菌细胞膜分泌并且随后因C端跨膜结构域的存在而停留在细胞膜中，其中所述的C端跨膜结构域由具有约20个残基的疏水区和带正电荷的尾组成。在装配过程的第二阶段，紧邻于该跨膜结构域之前的细胞壁分选信号(CWSS)，优选LPXTG-基序，可用于细胞膜锚定的菌毛蛋白的分选酶依赖性剪切。菌毛蛋白特异性分选酶剪切在苏氨酸(T)和甘氨酸(G)残基之间的这个5残基基序并且形成酰基-酶中间体， 其涉及苏氨酸残基的羧基与存在于分选酶的催化口袋内部的半胱氨酰硫醇之间的共价硫酯键。第三阶段代表菌毛蛋白亚基通过形成异肽键而聚合并且涉及剪切硫酯键和通过亲核攻击来自赖氨酸(K)残基侧链的ε氨基从菌毛蛋白亚基释放分选酶，其中所述的赖氨酸(K)残基在第二个菌毛蛋白亚基的菌毛蛋白基序(WXXXVXVYPKN)中保守。认为酰胺键在第一菌毛蛋白亚基中的苏氨酸残基的C-末端羧基和来自第二菌毛蛋白亚基的菌毛蛋白基序赖氨酸中的侧链氨基之间形成，其中所述的第二菌毛蛋白亚基作为共价硫酯仍与另一种菌毛蛋白特异性分选酶结合(Budzik,J. Μ.等人2008，Proc Natl Acad Sci USA 105， 10215-10220)。在这个菌毛装配模型中，逐步增长的聚合物结构由菌毛基部处的额外菌毛蛋白亚基送入并且总体长度受与菌毛蛋白特异性分选酶结合的可用菌毛蛋白亚基的量控制。由于菌毛蛋白基序是主要菌毛蛋白亚基(SpaA)及附属小菌毛蛋白亚基(SpaB)的特征性特征，然而在展示黏附特性的小菌毛蛋白亚基(SpaC)的一级序列中缺失，这种菌毛蛋白亚基有可能位于菌毛轴和第一菌毛蛋白亚基的顶端以启动菌毛聚合。聚合的菌毛对细胞壁的附着代表装配过程的第四阶段。这里，附属小菌毛蛋白亚基(SpaB)发出停止菌毛聚合的信号，但是仅当与持家性分选酶结合时才如此，所述持家性分选酶的基因在基因组上其他地方编码。在这个终末阶段，逐步增长的主要菌毛蛋白亚基 (SpaA)的逐步增长的聚合结构通过菌毛蛋白特异性分选酶从硫酯键转移，以与作为持家性分选酶酰基-酶中间体被偶联的SpaB小菌毛蛋白亚基的菌毛蛋白-基序中赖氨酸的侧链形成酰胺键。由肽聚糖脂质II前体的五肽的氨基的亲核攻击随后允许持家性分选酶催化连接SpaB菌毛蛋白连接的菌毛聚合物附着于细胞壁。E-box代表第三且表征较少的保守的一级序列基序aXLXETXAPXGY)，其存在于来自众多革兰氏阳性细菌的菌毛蛋白亚基的 LPXTG基序与菌毛蛋白基序之间。
迄今，借助X射线晶体学的三维(3-D)结构测定已经仅针对两种革兰氏阳性菌毛蛋白亚基蛋白揭示对于装配和功能的结构深入认识。Krishnan等人Q007，Mructure 15 893-903)已经解析了无乳链球菌的小菌毛蛋白GBS52的晶体结构并且揭示存在与金黄色葡萄球菌(S. aureus)胶原结合蛋白Cna共享结构相似性的两种IgG样结构域折叠，这也表明这个小菌毛蛋白亚基如何可能促进菌毛黏附于特定宿主组织。由Kang等人0007， Science318,1625-1628)解析的来自酿脓链球菌的主要菌毛蛋白Spy0128的晶体结构已经展示菌毛蛋白亚基内部的赖氨酸和天冬氨酸残基的侧链之间自我产生的分子内异肽键也如何能够弥补分选酶催化的分子间异肽键以维持菌毛的总体强度和稳定性。大部分益生微生物是革兰氏阳性乳杆菌和双歧杆菌成员并且具有在发酵食品和乳制品中使用的悠久传统(Goldin，B. R.和 Gorbach，S. L. 2008，Clin Infect Dis 46， S96-S100 ；Ljungh, Α.禾口 Wadstrom，Τ·2006，Curr Issues Intest Microbiol 7，73-89; Salminen, S.等人1998，Br J Nutr 80，S147-S171)。文献中未描述过益生性乳杆菌的菌毛结构或编码这些菌毛结构的基因。从未在鼠李糖乳杆菌(LactcAacillus rhamnosus)中证实菌毛样结构或多核苷酸的存在。发明简述本发明的目的是提供新的菌毛多肽以及编码它们的多核苷酸。另外，本发明的目的是提供新的菌毛结构。再者，本发明的目的是提供涉及上述肽、多肽、蛋白质、菌毛结构和多核苷酸的新方法、用途和产品。本发明涉及肽，其中所述的肽包含与SEQ ID NO 1 (GG00441)具有至少94%序列同一性、与 SEQ ID NO 2 (GG00442)具有至少 94%序列同一性、与 SEQ ID NO 3 (GG00443)具有至少84%序列同一性、与SEQ ID N04(GG00444)具有至少91%序列同一性、与SEQ ID NO 5 (GG02369)具有至少83%序列同一性、与SEQ ID NO 6 (GG02370)具有至少94%序列同一性、与SEQ ID NO 7(GG02371)具有至少93%序列同一性或者与SEQ ID N08 (GG02372)具有至少93%序列同一性的序列或其片段或变体。本发明也涉及编码肽序列的多核苷酸，其中所述的肽序列与SEQ ID NO 1 (GG00441)或其片段或变体具有至少94%序列同一性、与SEQ ID N02 (GG00442)或其片段或变体具有至少94%序列同一性、与SEQ ID N03 (GG00443)或其片段或变体具有至少84% 序列同一性、与SEQ ID N04(GG00444)或其片段或变体具有至少91%序列同一性、与SEQ ID N05 (GG02369)或其片段或变体具有至少83%序列同一性、与SEQ ID N06 (GG02370)或其片段或变体具有至少94%序列同一性、与SEQ ID N07(GG02371)或其片段或变体具有至少93%序列同一性或者与SEQ ID N08 (GG02372)或其片段或变体具有至少93%序列同一性。本发明也涉及包含至少一种本发明肽的菌毛结构、包含至少一种本发明肽或菌毛结构的产品并涉及包含至少一种本发明肽或菌毛结构的药物或营养组合物。另外，本发明涉及产品，其包含用作药物或用于预防或治疗腹泻、动脉性高血压、 血管病、变态反应、癌症、特应性疾病、病毒病、传染病、尿道感染、呼吸道感染、龋齿、肠易激综合征(IBS)、炎性肠病(IBD)、粘膜炎症、肠通透性紊乱、肥胖症、代谢综合征、氧化性应激或腹痛的至少一种本发明肽或菌毛结构。另外，本发明涉及至少一种本发明肽或菌毛结构在制造用于预防或治疗腹泻、动脉性高血压、血管病、变态反应、癌症、特应性疾病、病毒病、传染病、尿道感染、呼吸道感染、 龋齿、IBS、IBD、粘膜炎症、肠通透性紊乱、肥胖症、代谢综合征、氧化性应激或腹痛的药物中的用途。另外，本发明涉及用于预防或治疗腹泻、动脉性高血压、血管病、变态反应、癌症、 特应性疾病、病毒病、传染病、尿道感染、呼吸道感染、龋齿、IBS、IBD、粘膜炎症、肠通透性紊乱、肥胖症、代谢综合征、氧化性应激或腹痛的至少一种本发明肽或菌毛结构。此外，本发明涉及包含SEQ ID NOs 9_16任一者或其简并序列的序列或编码本发明肽的多核苷酸，涉及包含本发明多核苷酸的载体，涉及包含本发明的多核苷酸或肽的宿主细胞并且涉及包含至少一种本发明多核苷酸的基因簇。另外，本发明涉及针对本发明肽或其功能域的一种或多种抗体。本发明也涉及用于预防或治疗腹泻、动脉性高血压、血管病、变态反应、癌症、特应性疾病、病毒病、传染病、尿道感染、呼吸道感染、龋齿、IBS、IBD、粘膜炎症、肠通透性紊乱、 肥胖症、代谢综合征、氧化性应激或腹痛的方法，包括施用至少一种本发明肽或菌毛结构至受试者。本发明也涉及用于筛选包含至少一种本发明多核苷酸或其片段的细菌菌株的方法，其中该方法包括i)提供来自细菌菌株的DNA或RNA ；ii)使针对本发明多核苷酸或其片段特异的引物或探针与来自步骤i)的DNA或 RNA杂交并任选地扩增该多核苷酸或其片段；iii)检测与本发明多核苷酸或其片段同源的至少一种多核苷酸或其片段。本发明也涉及至少一种本发明多核苷酸或其片段或至少一种本发明抗体用于筛选细菌菌株的用途。本发明涉及使用至少一种本发明抗体筛选包含至少一种本发明肽或菌毛结构的细菌菌株的方法，其中该方法包括i)提供细菌菌株的蛋白质；ii)使用所述抗体检测至少一种多肽、菌毛结构或其片段。本发明涉及减低或抑制致病细菌对受试者胃肠道、对其上皮或对其黏液黏附的方法，其中该方法包括施用至少一种本发明肽和/或菌毛结构至该受试者。本发明涉及至少一种本发明肽和/或菌毛结构用于减低或抑制致病菌对受试者胃肠道、对其上皮或对其黏液黏附的用途。本发明涉及用于减低或抑制致病菌对受试者胃肠道、对其上皮或对其黏液黏附的至少一种本发明肽或菌毛结构。本发明涉及促进细菌细胞黏附于或任何其他物质黏附于黏液或上皮的方法，其中该方法包括i)产生至少一种本发明肽或菌毛结构或其片段；ii)在细菌细胞上或任何其他物质上展示该肽、菌毛结构和/或其片段；iii)使所述细菌细胞或任何其他物质与黏液或上皮接触。
本发明涉及至少一种本发明肽和/或菌毛结构用于促进细菌细胞或任何其他物质黏附于黏液或上皮的用途。本发明涉及用于促进细菌细胞或任何其他物质黏附于黏液或上皮的至少一种本发明肽和/或菌毛结构。本发明涉及调节受试者中免疫应答的方法，其中所述方法包括i)产生至少一种本发明肽或菌毛结构或其片段；ii)在宿主细胞上展示该肽、菌毛结构和/或其片段；iii)任选地使该宿主细胞与黏液或另一个宿主细胞接触。本发明涉及至少一种本发明肽或菌毛结构用于调节免疫应答的用途。本发明涉及用于调节免疫应答的至少一种本发明肽或菌毛结构。本发明涉及产生本发明产品的方法，其中该方法包括对产品产生至少一种本发明肽或菌毛结构的步骤。本发明也涉及产生至少一种本发明肽或菌毛结构的方法，其中该方法以下步骤i)提供本发明的至少一种多核苷酸；ii)用所述多核苷酸转化宿主细胞；iii)培养来自步骤ii)的宿主细胞以产生所述肽或菌毛结构；iv)任选地回收所述肽或菌毛结构。此外，本发明涉及产生至少一种本发明肽或菌毛结构的方法，其中该方法包括以下步骤i)破坏产生或包含至少一种本发明肽或菌毛结构的细胞；ii)任选地回收所述肽或菌毛结构。另外，本发明涉及产生至少一种本发明肽的方法，其中该方法以下步骤i)提供氨基酸；ii)用合成至少一种肽从步骤i)的氨基酸制造本发明的至少一种肽。本发明涉及通过使用生物信息学方法检测潜在的益生性细菌菌株的方法，其中该方法包括以下步骤i)提供至少一种肽、多核苷酸或其片段的序列；ii)将步骤i)的序列针对序列集合的序列进行比较；iii)检测与步骤i)的序列具有生物学适合片段或与步骤i)的序列具有高同一性的序列。本发明也涉及通过使用生物信息学方法检测本发明肽或菌毛结构有效针对的病原菌株的方法，其中该方法包括i)提供至少一种肽、多核苷酸或其片段的序列；ii)将步骤i)的序列针对序列集合的序列进行比较；iii)检测与步骤i)的序列具有生物学适合片段或与步骤i)的序列具有高同一性的序列。本发明的肽、菌毛结构和多核苷酸提供了用于食品、饲料、化妆品和制药工业中进一步开发的工具。本发明使得多种细菌菌株的快速与有效筛选方法和可靠且精确的定性或定量分析成为可能。因此，本发明的方法和手段使得发现新的益生细菌菌株以及发现新产品(包括成分、补充剂和营养品)、药物和治疗方法成为可能。另外，借助本发明，更有效和特异的疗法变得可获得。存在向消费者提供新产品的持续、明显的需要，其中所述的新产品对健康具有明确证实的效果并且以这样的形式产生，从而允许这些产品原样地或作为另一种产品(如药品或食品或饲料产品)的一部分使用。根据本发明，产品也可用作允许作为例如日常膳食或药物的便利部分(convenient part)或补充剂使用的胶囊剂、丸剂或片剂。附图简述图Ia和Ib显示革兰氏阳性棒状杆菌中菌毛装配和共价附着于细胞壁的模型。图2显示包括编码菌毛蛋白特异性分选酶、主要菌毛轴蛋白、小菌毛轴蛋白和加帽菌毛蛋白质的基因的鼠李糖乳杆菌GG(LGG)菌毛簇。CWSS表示细胞壁分选信号，即在许多革兰氏阳性细菌中发现的保守基序，Pilin基序和E-盒也表示在许多革兰氏阳性细菌中存在的保守基序。图 3 显示与 LGG 菌毛结构的肽 GG00442、GG00443、GG00444、GG02370、GG02371 和 GG02372结合的多克隆抗体的实例。图4显示LGG的突出菌毛结构的相差原子力显微镜显微图片。图fe和5b显示重组组氨酸标记的LGG蛋白即SpaA、SpaB, SpaC, SpaD和SpaF菌毛蛋白与人肠黏液的体外结合。使用切除的人肠组织作为聚苯乙烯微量滴定平板上的黏液来源。通过酶联免疫吸附测定法检测结合的蛋白质。图6a和6b分别地显示使用SpaA和SpaC菌毛蛋白特异性多克隆抗体时，在 mTSB-培养基或MRS+0.6%牛胆汁培养基中培育的LGG和(作为阴性对照的)鼠李糖乳杆菌LC705(LC7(^)的细胞壁级分的蛋白质印迹。图6a显示在LGG中存在含有SpaA的菌毛和 SpaA单体，并且图6b显示在LGG中存在含有SpaC的菌毛和SpaC单体。泳道1 重组SpaA/ SpaC菌毛蛋白；泳道2 在mTSB中培育的LGG ；泳道3 在MRS+0. 6%牛胆汁中培育的LGG ； 泳道4 在mTSB中培育的LC705 ；泳道5 在MRS+0. 6%牛胆汁中培育的LC705。使用的抗体在每幅图的顶部显示。在图6b中，分图A 泳道1至5曝光1秒；分图B 泳道2-5分别曝光60秒。分子量标准的位置在左边显示为千道尔顿。HMW表示高分子量梯。图6c显示含有SpaB的菌毛和SpaB单体在LGG细胞壁级分的蛋白质印迹中存在。泳道1 分子量标记； 泳道2 在MRS中培育的LGG。用SpaB菌毛蛋白特异性多克隆抗体、山羊抗兔IgG-AP缀合物(Bio Rad)和BCIP/NBT显色剂进行检测。图7a_c显示PCR筛选具有菌毛结构的新益生菌菌株的结果。图7a_c分别显示鼠李糖乳杆菌GG、鼠李糖乳杆菌LC705和干酪乳杆菌(LactcAacillus case) ATCC 334的扩增产物。泳道1 分子量标记；泳道2 采用SpaF的引物的扩增产物；泳道3 采用SpaE的引物的扩增产物；泳道4 采用SpaD的引物的扩增产物；泳道5 采用SpaC的引物的扩增产物；泳道6 采用SpaB的引物的扩增产物；泳道7 采用SpaA的引物的扩增产物。图8a_d显示表明spaC、spaB或spaA在干酪乳杆菌ATCC 334、鼠李糖乳杆菌LC705 和鼠李糖乳杆菌GG中存在的DNA印迹杂交信号。图8a显示通过琼脂糖凝胶电泳分离的已消化基因组DNA并且图汕、8(3和8d显示分别使用DIG-标记的鼠李糖乳杆菌GG spaC基因的801-bp PCR扩增产物、鼠李糖乳杆菌GG spaB基因的612-bp PCR扩增产物或鼠李糖乳杆菌GG spaA基因的780-bp PCR扩增产物作为探针时，相同DNA的DNA印迹杂交。泳道1 分子量标记I HindIII-(pX174HaeIII混合物；泳道2 :DIG标记的分子量标记II (Roche)； 泳道3 用HindIII消化的干酪乳杆菌ATCC 334 ；泳道4 用HindIII消化的鼠李糖乳杆菌 LC705，泳道5 用HindIII消化的鼠李糖乳杆菌GG ；泳道6 -；泳道7 未标记的探针。图9显示用活的鼠李糖乳杆菌GG 2xl06cfu/ml或用大约30pmol/ml纯化的His 标签标记的鼠李糖乳杆菌GG蛋白SpaA、SpaB和SpaC刺激巨噬细胞期间的TNF- α水平。图10显示来自人肠黏液致病细菌屎肠球菌由鼠李糖乳杆菌GG或SpaC、SpaB和 SpaA菌毛蛋白逐出。黏附(％)表述为5个平行实验的平均数士S. D.。*指显著减少的屎肠球菌黏附(P < 0. 05)。图Ila和lib显示编码图2中所述的菌毛操纵子的核苷酸序列。图Ila显示编码 GG00441-GG00444基因的操纵子(粗体)。推定性保守元件_35序列(下划线)、-10序列 (双下划线)、核糖体结合位点(下划线斜体)和rho终止子(点下划线)。图lib显示编码GG02369-GG02372基因的操纵子(粗体)。推定性保守元件_35序列(下划线)、-10序列(双下划线)、核糖体结合位点(下划线斜体)和rho终止子(点下划线)。发明详述乳酸细菌已经在食物工业中长久使用并且它们如今用在多种食物供给品如乳产品中。例如，已知乳杆菌和双歧杆菌具有益生效果，但是没有充分理解益生细菌影响健康的方式。因此，需要深入研究益生菌。本发明基于革兰氏阳性细菌也具有菌毛结构的研究结果。另外，本发明基于在革兰氏阳性细菌中、具体在乳杆菌中，更具体在鼠李糖乳杆菌中的新菌毛肽和结构中的发现。菌毛结构的肽总体而言，革兰氏阳性细菌菌毛从细菌的外膜伸出，通常1-4 μ m长和2-8nm宽并且以低数目出现。认为菌毛促进细菌黏附于靶表面。实际上，如本文中所用，表达“菌毛结构”指修长的毛状或毛发样蛋白质纤维，包含多个蛋白亚基(优选地多于1个亚基)。这些蛋白质的装配可以依赖于特定蛋白质，即分选酶。具有黏附特性的蛋白质通常位于菌毛的顶部。具有异聚体菌毛结构的其他蛋白质可以是黏附性的。如本文中所用，表述“菌毛结构的部分”指菌毛的任何组分，优选该菌毛的任何蛋白质或任何片段或任何变体。在本发明的优选实施方案中，菌毛结构位于微生物的表面上或源自其中。如本文中所用，表述“肽”指任何肽，如二肽、多肽、蛋白质和/或菌毛蛋白。在本发明的具体实施方案中，菌毛蛋白的特征性特征是主要菌毛蛋白亚基 (SpaA)，附属小菌毛蛋白亚基(SpaB)和加帽菌毛蛋白亚基(SpaC)。菌毛蛋白特异性分选酶通过转移SpaA至逐步增长的菌毛蛋白聚合物结构中的 SpaC来起作用(图1)。在本发明的优选实施方案中，包含与SEQ ID NO 1 (GG00441)具有至少94%序列同一性的序列或与SEQ ID N05 (GG002369)具有至少83%序列同一性的序列的肽是菌毛蛋白特异性分选酶(图2，对于编码2图中所述的菌毛操纵子的核苷酸序列，还见图11)。SpaA同样形成菌毛结构的主链。不同菌毛结构的长度取决于SpaA在主链中的量 (图1)。在本发明的优选实施方案中，包含与SEQ ID N02 (GG00442)具有至少94%序列同一性的序列或与SEQ ID N06 (GG002370)具有至少94%序列同一性的序列的肽是主要菌毛轴蛋白，即主要菌毛蛋白亚基(图2，对于编码2图中所述的菌毛操纵子的核苷酸序列，还见图11)。GG00442和GG02370含有分选酶识别位点，因而是分选酶的底物。SpaB同样在菌毛形成的最晚时期(终末阶段)添加至菌毛结构并且它形成菌毛至细胞壁的连接(图1)。在本发明的优选实施方案中，包含与SEQ ID NO 3(GG00443)具有至少84%序列同一性的序列或与SEQ ID N07 (GG002371)具有至少93%序列同一性的序列的肽是小菌毛轴蛋白(图2，对于编码2图中所述的菌毛操纵子的核苷酸序列，还见图11)。 GG00443和GG002370含有分选酶识别位点，因而是分选酶的底物。SpaC可能位于菌毛轴和第一菌毛蛋白亚基的顶端以启动菌毛聚合(图1)。在本发明的优选实施方案中，包含与SEQ ID NO 4(GG00444)具有至少91%序列同一性的序列或与SEQ ID NO 8 (GG002372)具有至少93%序列同一性的序列的肽是结合性菌毛蛋白(图 2，对于编码2图中所述的菌毛操纵子的核苷酸序列，还见图11)。GG00444蛋白含有von Willebrand因子(vWF)结构域，并且GG00444和GG02372含有分选酶识别位点，因而是分选酶的底物。在本发明的具体实施方案中，本发明的肽或多肽包含与SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、 7或8的氨基酸序列或与其片段或变体具有至少60、65、70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、 88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99. 5,99. 8,99. 9 或 100% 同一性的序列。根据本发明的具体实施方案，该肽与SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7或8的氨基酸序列任一者或与其片段或变体具有至少 60、65、70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99、99. 5,99. 8,99. 9 或 100% 同一性。在本发明的另一个具体实施方案中，该肽具有在序列SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7 或8任一者或其片段或变体中所示的序列。与本发明序列比较的任何序列或片段的同一性指与本发明完整序列比较的任何序列的同一性。序列同一性可以例如通过使用BLAST(基本局部比对搜索工具)或 FASTA(FAST-AII)确定。在所述搜索中，设置参数"空位罚分"和"矩阵"一般选择为默认。如本文中所用，肽的片段或变体指肽的可以具有生物学功能的任何部分或变体。 变体指在肽序列中具有微小变动如例如小缺失、突变或插入的肽。如本文中所用，“肽的功能性片段或变体”例如指能够在不同菌毛蛋白亚基之间形成异肽键(例如，菌毛蛋白特异性分选酶的转肽酶活性)、作为分选酶的底物(例如，SpaA,SpaB, SpaC,SpaD, SpaE和SpaF的功能)或与细胞壁结合(例如，SpaC和SpaF的功能)或与其他蛋白质或片段结合(例如， SpaC的功能)的片段或变体。另外，“肽的功能性片段或变体”可以指包含生物学结构域的任何片段或变体。如今，多肽内部的结构域通常定义为空间上明显的结构，其可想象地折叠并独立地发挥作用(Ponting C. P.和 Russell R. R. 2002，Annu Rev Biophys Biomol Struct. 31 45-71)。基于使用流行结构域-数据库PFAM (Finn，R.D.等人2009年11月17日，Nucleic Acids Res.[先于印刷版的电子版发布])的工具分析例如SEQ ID NO 4的多肽序列，本研究中将SEQ ID NO 4的多肽序列表征为具有小于或等于0. 1的显著性E值的3个结构域。从SEQ ID NO 4第137至271位的氨基酸形成第一结构域(PF00092_von Willebrand因子A型结构域)，其中所述的第一结构域也存在于许多介导和参与蛋白质-蛋白质相互作用的蛋白质中(Colombatti，A.等人1993，Matrix. 13 :297-306 ； Whittaker C. A.禾Π Hynes R. 0. 2002，MoI Biol Cell. 13 :3369-87 ；Konto-Ghiorghi, Y 等人 2009，PLoS Pathog. 5 :el000422)。含有 von Willebrand 因子 A 型结构域的蛋白质经常在多蛋白质复合体中发挥功能并且已经记载参与真核生物中的众多生物学事件，包括膜运输、蛋白酶体、转录、DNA修复、细胞黏附、移行、归巢、图式形成和信号转导 (Colombatti，A.等人Matrix. 13 =297-306)。最近，证实致病性无乳链球菌菌株NEM316的菌毛蛋白的von Willebrand因子A型结构域是该蛋白质对人上皮细胞的黏附功能必需的 (Konto-Ghiorghi, Y.等人 2009，PLoS Pathog. 5 :el000422)。从SEQ ID NO 4第617至691位的氨基酸形成第二结构域(PF05738_Cna蛋白B 型结构域)并且从SEQ ID NO 4第749至821位的氨基酸形成第三结构域(PF05738-Cna 蛋白B型结构域)。已经记载Cna蛋白B型结构域在金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)胶原结合表面蛋白中共有重要作用。然而，该区域不介导胶原蛋白结合，但是相反， 作为“柄”发挥作用，其中所述的柄将该蛋白质的其他区域从细菌表面伸出并且因而促进细菌黏附于胶原(Deivanayagam，C. C.等人 2000，Structure. 8 :67-78)。最近，对 Cna 蛋白 B 型结构域提出另一个特性，因为指出它含有证实对于菌毛装配和不同菌毛蛋白亚基连接在一起重要的异肽键形成残基(Kang, H. J.等人2007，Science 318，1625-1628)。片段的序列同一性百分数可以如对完整多肽那样，使用相同的工具和设置进行度量。可以如上所述与SEQ ID NO 4类似地分析本发明的任何多肽序列。Cna蛋白B型结构域存在于SEQ ID NO 2(第73-155和第193-295位氨基酸)、SEQ ID NO 3(第72-164 位氨基酸)、SEQ ID NO 6 (第 374-470 和第 69-168 位氨基酸)、SEQ ID NO 7 (第 238-3 位氨基酸)和SEQ ID NO 8 (第743-805和第839-906位氨基酸)中。基于现有知识，具有足够高同一性百分数的多肽共享相似的空间结构并且有可能涉及相似的(尽管并非必然涉及相同的)功能。功能与结构等价性的序列水平同一性百分数是比对长度的函数(Sander C.和 Schneider R. 1991，Proteins. 9 :56-68)。例如，当具有至少50个氨基酸的多肽的序列水平同一性百分数超过35%时，它们具有良好的结构相似性。因而，现有知识说明序列同一性百分数高于35%并且长度超过50个氨基酸的多肽序列可能涉及相似的功能、具有相似的空间结构并且使用相同的抗体相关筛选方法予以检测。在本发明的优选实施方案中，具有SEQ ID NO 2_4或6_8的肽是菌毛结构的一部分。在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的菌毛结构包含本发明的至少1种肽，更优选地包含本发明的至少2种或至少3种肽。另外，在本发明的优选实施方案中，该菌毛结构包含肽 GG00442 (SEQ ID NO 2)，GG00443 (SEQ ID NO 3)和 GG00444(SEQ ID NO 4)和 / 或月太 GG02370(SEQ ID NO 6)，GG02371 (SEQ ID NO 7)和 GG02372(SEQ ID NO 8)。革兰氏阳性及益生性细菌本发明的肽或菌毛结构可以来自任何细菌，如革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。然而，在本发明的优选实施方案中，所述肽或菌毛结构来自革兰氏阳性细菌。可以包含本发明肽或菌毛结构的革兰氏阳性细菌包括但不限于乳杆菌、乳球菌、双歧杆菌、丙酸杆菌、明串珠菌、链球菌、棒状杆菌、放线菌和分枝杆菌。在本发明的优选实施方案中，所述肽或菌毛结构来自益生性细菌(如益生性乳杆菌、乳球菌、双歧杆菌、肠球菌、丙酸杆菌、明串珠菌和链球菌或酵母。益生菌是活的微生物， 优选地是非致病性微生物，当以足够的量施用至人或动物时，其促进宿主的健康(Fuller， R. 1989，J. App 1. Microbiol. 66 :365-378)。当作为食物或食物补充剂以足够的量消费时，益生菌将对宿主产生有益的健康好处。益生菌在人或动物中的健康好处包括可能预防和治疗许多疾病。益生菌的健康促进作用例如包括平衡和维系肠菌群、刺激免疫系统和抗癌变活性。益生菌在人肠道中有用效果基于活细菌细胞、其细胞结构和代谢产物所引起的几个独立因素。如果一种细菌满足以下要求，则可以称它为益生菌(Lee，Y-K和&ilminen，S. 1995 Trend Food Sci Technol,6 =241-245)它在消化道中优势的苛刻条件(胃部低pH、消化系统的酸，等)下仍是活的；附着于肠壁；定植至GIT ；在肠内代谢；是技术上可应用的(承受加工过程)；显示经临床检验和报道过的健康效果；并且是消费安全的。胃肠道不同部分之间的微生物含量存在巨大差异，全部肠细菌的约95%出现在结肠中。除暂居微生物之外，估计超过400个细菌物种在结肠中旺盛生长。优势物种如下拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、粪球菌属 (Coprococcus)、消化链球菌属(P印tostr印tococcus)、真细菌属(Eubacterium)禾口瘤胃球菌属(Ruminococcus) ο 乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、梭杆菌属 (Fusobacterium)、韦荣球菌属(Veillonella)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)禾口肠杆菌科(Enterobacteriaceae)物种的数目略少。所述物种的某些代表有用的微生物，而其他甚至可以有害(Tannock，G. W. 1998，Int. Dairy J. 8 :527-533)。肠菌群组成的变化或其量的突然降低(因重度腹泻、抗生素治疗等所致)增加了潜在致病性物种的感染性，这可以造成严重后果(变态反应爆发、肠病、癌症)。在本发明的优选实施方案中，所述肽或菌毛结构与胃肠道(GIT)结合，最优选地与胃肠道的上皮结合。在本发明的另一个优选的实施方案中，所述肽或菌毛结构与黏液结合。黏液是来自黏液产生细胞的滑腻分泌产物，粘稠胶质。黏液保护例如在GIT中的上皮细胞。除了杀菌酶类和免疫球蛋白之外，黏液也含有粘蛋白和无机盐。如本文中所用，胃肠道指从嘴至肛门的管，其参与消化食物。GIT包括口、食道、胃、十二指肠、空肠、回肠、小肠、 大肠(结肠)、盲肠、直肠和肛门。记载最详细的益生菌包括鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosus) GG、约氏乳杆菌 (L. johnsonii)LAl、干酪乳杆菌(L. casei) Shirota 和乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)Bbl20此外，已经在本领域文献中描述众多的其他益生菌。在本发明的优选实施方案中，所述肽或菌毛结构来自鼠李糖乳杆菌，最优选地来自鼠李糖乳杆菌GG(LGG，LGG )菌株，其是最初来自美国的非致病性革兰氏阳性分离株(US4839281 A)。LGG菌株分离自人粪便，它能够在PH 3良好生长并且甚至在更低pH 3以及高胆酸含量下存活。该菌株显示优异的黏液和上皮细胞黏附性并且定植GIT。来自葡萄糖的乳酸产率是良好的在MRS培养液中培育时，该菌株产生1. 5-2%乳酸。该菌株不发酵乳糖并且它不从乳糖产生乳酸。该菌株发酵以下糖类D_阿拉伯糖、核糖、半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、鼠李糖、卫矛醇、肌醇、甘露醇、山梨醇、N-乙酰葡糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七叶苷、水杨苷、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、龙胆二糖、D-塔格糖、L-岩藻糖和葡萄糖酸。该菌株在15-45°C 良好生长，最佳温度是3-37°C。LGG已经以保藏号ATCC 53103保藏于保藏机构美国典型培养物保藏中心。菌毛基因编码菌毛结构的菌毛蛋白的基因簇集在LGG基因组中的相同基因座上。在LGG基因组中通过生物信息学方法总计找到编码菌毛肽的两个不同基因簇(图2，对于编码2图中所述的菌毛操纵子的核苷酸序列，还见图11)。在本发明的一个优选实施方案中，所述多核苷酸具有SEQ ID N0s9-16任一者或其简并序列或片段的序列，或它编码本发明的肽或其片段。具有SEQ ID NOs 9-16任一者中所示序列的简并序列的核苷酸意指它含有1个或多个不同的核苷酸，但是仍编码相同的氨基酸。如本文中所用的“多核苷酸”是核苷酸序列，如DNA或RNA序列，并且可以是单链或双链的多核酸。术语“多核苷酸”包括基因组DNA、cDNA和mRNA。多核苷酸也可以是分离的 DNA。在本发明的另一个优选的实施方案中，所述基因簇包含本发明的至少一种多核苷酸。在本发明的另一个优选的实施方案中，所述基因簇包含本发明的至少2种、至少3种或至少4种多核苷酸。最优选地，该基因簇包含SEQ ID NOs 9_12或SEQ ID NOs 13-16中所示的多核苷酸。如本文中所用，“基因簇”指编码联合功能(协同作用)所需的肽/蛋白质 (在此例如编码菌毛结构)的至少2个基因的集合。相同簇的基因通常一起归并在相同的遗传基因座上。根据本发明的具体实施方案，该多核苷酸与SEQ ID NO 9、10、11、12、13、14、15或 16的核苷酸序列任一者或与其片段具有至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、81、 82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99. 5、99. 8、99.9 或 100 %
同一性。在本发明的另一个具体实施方案中，该多核苷酸具有在序列SEQ IDNO 9、10、11、 12、13、14、15或16任一者中所示的序列。产品和药物组合物在本发明的一个优选实施方案中，所述产物包含本发明的至少一种肽或菌毛结构。该产物也可以包含本发明的至少2种或至少3种肽。在一个优选的实施方案中，产物包含本发明肽的至少一个片段。本发明的产品可以选自但不限于由食品、动物饲料、营养品、食物补充剂、食物成分、健康食品、药品和化妆品组成的组。在发明的一个优选实施方案中，产品是食品或饲料产品。在本发明的另一个实施方案中，产品是功能性食品，即具有任何健康促进和/或疾病预防或治疗特性的食品。优选地，本发明的食品选自由奶产品、烘焙产品、巧克力和甜食、糖和口香糖、谷物产品、小吃、基于浆果或水果的产品和饮料/饮品组成的组。奶产品包括但不限于乳、酸乳、酸奶和其他发酵的乳产品如奶酪和膏糊(spreads)、 乳粉、儿童食品、婴儿食品、学步儿童食品、婴儿配方食品、果汁和汤。除本发明的肽或菌毛结构之外，该产品也可以含有其他starters、益生菌等。在本发明的优选实施方案中，该产品是药物组合物。在本发明的一个优选实施方案中，该药物组合物包含本发明的至少一种肽或菌毛结构，并且在另一个实施方案中包含本发明的至少2种或至少3种肽。药物组合物可以例如以固体、半固体或液体形式，如以片齐U、丹剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、阴道凝胶剂和软膏剂、阴道栓剂等形式使用。优选地，该组合物用于口服施用或用于肠道施用。
除本发明的至少一种肽或菌毛结构之外，药物组合物还可以包含益生元，可药用载体(例如水、葡萄糖或乳糖)、佐剂、赋形剂、辅助赋形剂、杀菌剂、稳定剂、增稠剂或着色剂、香料、粘合剂、填充剂、润滑剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂、凝胶剂、抗氧化剂、防腐剂、缓冲齐U、PH调节剂、湿润剂或相应产品中通常存在的组分。本发明的产品或药物组合物包含足以产生所希望效果的量的所述肽或菌毛结构。 商业地获得或通过本领域已知的常规技术制备所述产品或药物组合物的其他成分以及其他特定组分。所述产品或药物组合物可以通过本领域已知的任何方法制造。对产品产生肽或菌毛结构意指该肽或菌毛结构可以例如添加至任何产品或与任何物质混合。该肽或菌毛结构也可以在产品中产生，例如，通过适宜条件下表达。在成品完成期间，可以与制备过程中或在其之后添加或混合肽或菌毛结构。在本发明的优选实施方案中，将本发明的肽或菌毛结构添加至产品。生产方法本发明的肽或菌毛结构可以例如通过合成方法(例如，肽合成法)或通过采用基因修饰生物的重组生产法产生。在本发明的优选实施方案中，所述肽或菌毛结构是重组的。 如本文中所用，“重组"遗传材料指一般作为一种或多种遗传材料(例如各种来源的DNA 链)组合的材料，并且它已经通过合并或插入所述序列产生。重组产生能够对基因或基因产物，或者例如基因的表达实现特定和/或特别性状(例如过量表达或不足表达)。本发明的多核苷酸可以例如置于任何内源或外源调节物(如启动子)的控制下。重组蛋白衍生自重组DNA。至少一种目的多核苷酸可以从细胞分离或合成地产生。可以将这种核苷酸转化至宿主细胞。用于产生本发明任何肽的合适宿主细胞可以是任意的真核细胞或微生物，优选地是细菌，最优选地乳酸细菌如乳杆菌、乳球菌、双歧杆菌、肠球菌、明串珠菌和链球菌，或丙酸杆菌、或酵母。如本文中所用，“转化"指通过外来遗传材料、优选通过DNA遗传地改变细胞， 从而导致这种遗传材料的表达。可以原样地导入外来遗传材料或将其掺入任何其他遗传材料，如载体、质粒等。任何基因工程方法或任何分子克隆方法可以用于以本发明的多核苷酸转化宿主细胞。存在多种导入外来材料至真核细胞中的方法。材料，如聚合物(例如， DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺)、脂质体和纳米粒子(例如，金)已经作为载体用于转化。遗传材料也可以通过使用例如病毒或载体作为载体导入细胞。用于导入外来材料至细胞中的其他方法包括但不限于核转染法、电穿孔法、接合法、转染法、声致穿孔法(sonoporation)、 热休克法和磁转染法(magnetofection)。多种转染试剂(如磷酸钙或脂转染胺试剂)的使用是本领域熟知的。用于导入外来材料至细菌细胞中的优选方法是电穿孔法。本发明的肽或菌毛结构也可以由天然表达该肽或菌毛结构的细胞产生。在天然细胞或转化的宿主细胞已经在适宜条件下产生本发明的肽后，可以例如从细胞中纯化该肽或可以回收分泌形式的肽，例如，从培养基回收。为了纯化该肽，可以例如通过超声处理、辐射、加热、裂解、机械搅拌(剪切)、酶方法、‘cell pomb'或化学试剂 (低渗休克、去垢剂和溶剂)或其混合物破坏细胞。肽或菌毛结构可从正在生长或有代谢活性的生物，即活生物和/或冻干生物，或无活力的生物，例如，热杀死、照射或裂解的生物获得。肽或菌毛结构可从死细胞或活细胞获得。肽或菌毛结构可以在一个细胞中产生并且随后展示在相同的细胞上，或该肽或菌毛结构可以在除了表面上展示该肽或菌毛结构的细胞之外的另一个细胞中产生。任何已知方法如免疫法可以用于产生针对本发明肽的抗体。可以针对所述肽的任何表位或功能域产生抗体并且这些抗体可以单克隆或多克隆的。在本发明的优选实施方案中，抗体是多克隆的(图3)。如本文中所用，“肽的功能域”指该肽的具有生物学功能的任何部分。治疗细菌，一大类单细胞微生物，在真核生物如人、动物和植物中引起多种疾病。然而， 仅在近年来菌毛在重要病原体表面上的存在引起研究者当中的兴趣。因为GIT及其小型生物群影响受试者的健康，所以细菌菌毛的利用强化了新疗法。本发明的肽、菌毛结构或多核苷酸可以用于治疗或预防由微生物如细菌或病毒所致或由任何其他原因如失衡营养、压力生活方式或遗传素质所致疾病的方法中。可用本发明的肽、菌毛结构、多核苷酸或用本发明药品预防或治疗的疾病或不适包括但不限于腹泻如旅行者腹泻、动脉性高血压、血管病、变态反应、特应性疾病、尿道感染、呼吸道感染、龋齿、肠易激综合征、炎性肠病，以及治疗轻微肠不适以及增强/促进个体总体健康。本发明的组合物也用于预防和治疗胃肠病症和疾病，并用于促进总体健康。所述病症或疾病优选地选自由粘膜炎症、肠通透性紊乱、IBD、IBS 和其他胃肠病症组成的组。在本发明的特别实施方案中，肽或菌毛结构作为疫苗使用(免疫应答)。减少或抑制致病菌黏附于受试者GIT的方法导致预防或缓解由该病原体所致的症状。病原体因本发明肽或菌毛结构的竞争从GIT的上皮或表面逐出。本申请的实施例11 描述了用LGG菌毛蛋白逐出有害致病菌的竞争测定法。待逐出的优选病原体包括但不限于大肠杆菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、拟杆菌、利斯特菌、葡萄球菌、肠球菌、梭菌和链球菌。如本文中所用，“致病菌”指引起任何疾病或任何有害作用的任意细菌。如本文中所用，“黏附” 指至少两个分子或结构因化学或物理结合/力或无这些结合/力情况下彼此锚定。不同类型的黏附，如机械黏附、化学黏附、分散性黏附(dispersive adhesion)、静电黏附和扩散黏附，是已知的。黏附可以是可逆或不可逆的事件，但是在生物化学系统中，黏附通常是可逆的。獎肠球菌(Enterococcus faecalis)禾口屎肠球菌(Enterococcus faecium)是新出现医院内感染病原体的肠细菌，包括高度抵抗临床重要的抗生素万古霉素的万古霉素抗性肠球菌(VRE) (de Regt，M. J.等人，2008，J Antimicrob Chemother. 62 (6) 1401-1406)。这些物种属于引起住院患者中血液、手术部位和肠道感染的医院内感染的前三位细菌病原体(Richards，M. J 等人，2000，Infect Control Hosp Epide-miol 21: 510-51 。肠球菌可以引起类型广泛的疾病尿道感染、菌血症、败血症、心内膜炎、伤口和组织感染、腹内和盆腔感染(Kayser，F. H.等人 2003，Int J Food Microbiol88 (2_3) 255- ，并且感染手术部位，尤其在植入装置存在的情况下(Baldassarri L等人， 2005，Int J Artif Organs 28(11) :1101-1109)以及引起脑膜炎(Pintado V 等人，2003， Medicine (Baltimore). 82 (5) :346-64)、慢性根尖牙周炎(Hancock H. H 等人，2001. Oral Surg Oral Med Oral pathol91 :579-586)和尖周损害(Sunde PT 等人，2002，J Endod 28 304-310)。近来，已经描述屎肠球菌分离株含有位于表面的菌毛，并且值得注意地，绝大部分 (71%)的医院获得的屎肠球菌菌株和重要部分(43%)的非医院的屎肠球菌菌株含有菌毛基因(Hendricks AP 等人，2008，Microbiologyl54 :3212-3223)。在一项双盲和安慰剂作对照的研究中，已经描述鼠李糖乳杆菌GG的消费有效地清除来自VRE阳性患者中感染的肠球菌(Manley K. J等人，2007 Med J Aust. 186(9) =454-457) 含有菌毛的鼠李糖乳杆菌GG 与VRE之间竞争的分子证据源自结合研究，该研究表明鼠李糖乳杆菌对人胃肠黏液的结合作用比抗万古霉素的屎肠球菌高20-130倍(Pultz N. J等人，2006Curr Microbiol. 52(3) 221-224)。令人惊奇地，在本发明的结合测定法中，纯化的His标签标记的LGG蛋白SpaA、 SpaB和SpaC抑制病原体例如抗万古霉素屎肠球菌与黏液的结合。减低或抑制致病菌对受试者胃肠道、对其上皮或对其粘液黏附的方法可以包括以下步骤i)产生至少一种本发明肽或其片段或菌毛结构；ii)在细胞或黏液上展示该肽、片段和/或菌毛结构。除减少有害或致病菌的粘附之外，本发明还提供促进有益细胞或其他物质如酶、 重组细胞、微胶囊、纳米胶囊或药物与GIT黏附的可能性。促进细菌细胞与黏液和与GIT黏附的方法或本发明肽或菌毛结构用于促进细菌细胞黏附于肠粘液的用途涉及新肽或菌毛结构在体内、离体或体外黏附于GIT的令人惊奇的能力。所述菌毛肽或菌毛结构作为将细胞或任何其他物质如药物、酶、微生物、重组细胞、微胶囊、纳米胶囊与GIT连接的工具而发挥作用。调节受试者中免疫应答的方法和所述肽或菌毛结构用于调节免疫应答的用途基于出乎意料的发现，即本发明的肽或菌毛结构引起免疫应答的变化。免疫应答指针对身体、 离体或体外系统中抗原的应答或指针对另一种调节物的应答。这种应答可以由淋巴细胞和 /或由特异性抗体识别抗原所介导。免疫应答的一个目的是摧毁抗原(其通常为外源)或中和之。如本文中所用，“调节"指免疫应答的任何变动，如增加或减少。免疫应答的变动可以通过任何合适的医学、生理学或生物学试验监测，所述的试验包括但不限于这些试验，它们基于检测信号途径的激活以及检测标记基因的转录或翻译水平或蛋白质(例如抗体或受体)的量。目前，不存在可用于确定细胞或生物中免疫应答的单一标记。然而，优选的标记包括但不限于肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白细胞介素12(IL_12)、IL_10、IL-I β和干扰素 a (IFN- a )。其他可能的标记是 IL-1 a、IL-6、IL-18、IFN- y、IL-4、TGF- β、IL-1 Ra和IL-18BP。在本发明的优选实施方案中，标记选自由TNF-α、Thl细胞因子、IL-10和 IL-12组成的组。TNF-α 是炎性细胞因子(Bertazza L 和 Mocellin S. 2008, Front Biosci. 13 2736-43)，其激活免疫系统并启动炎症反应以对抗感染。TNF-α也随IL-6和INF-γ —起介导炎症的全身作用，如发热和合成急性期蛋白。适宜量的TNF-α以及其他促炎细胞因子的产生对于消除感染是重要的。然而，不适宜或过多量的促炎细胞因子，如TNF-α，已经与病理生理状况如类风湿性关节炎、椎关节炎、眼色素层炎、银屑病和炎性肠病关联。与IFN-Y 一样，TNF-α也是Thl型细胞因子之一，并且因此它激活巨噬细胞并抑制B细胞并且因而促进Thl型免疫。TNF-α也参与肥大细胞活化，并且因此参与变态反应。Thl型应答导致细胞介导的免疫。Thl型应答协调针对胞内病原体的宿主应答并且在激活吞噬细胞和促进微生物杀伤方面发挥中心作用，这在不同的感染(如呼吸道感染和胃肠感染如腹泻)中是重要的。Thl型应答在也在平衡变态反应中的免疫应答方面是重要-在变态反应中，免疫应答偏向Th2型应答，导致超敏反应，并且刺激Thl型免疫应答的物质可以平衡这种情况。可以从任何生物学样品或受试者通过体外、离体或体内试验检查免疫应答的变动。益生性菌株的特性可以在细胞培养(体外)中利用例如外周血单核细胞(PBMC)、人单核细胞、巨噬细胞和树突细胞进行研究。离体实验的实例包括确定嗜中性粒细胞和单核细胞的吞噬作用、突发性氧化作用，即嗜中性粒细胞和单核细胞的超氧化物产生、NK细胞活性、淋巴细胞增殖和外周血单核细胞、单核细胞或淋巴细胞的细胞因子产生。体内实验包括但不限于确定针对疫苗的应答(例如疫苗特异性抗体或疫苗特异性抗体形成细胞)，迟发型超敏反应和针对减毒病原体的应答。作为益生作用的备选，本发明的肽或菌毛结构可以在细胞或受试者中引起任何其他作用。这些其他作用也可以相对于益生作用单独或额外地出现。益生作用可以是其他免疫调节物和肽或菌毛结构的组合。在本发明，用于治疗或预防的受试者可以是任何真核生物，优选地是人或动物，特别是宠物和生产动物。所述动物可以选自由生产动物和宠物组成的组，如奶牛、马、猪、山羊、绵羊、家禽、狗、猫、兔、爬行动物和蛇。筛选方法本发明的任何多核苷酸或其任意片段可以用于筛选具有相似菌毛结构的细菌菌株。在筛选细菌菌株的方法中，可以例如通过基于PCR的方法，如常规PCR和测序法或微型测序法；杂交方法，如DNA印迹杂交或RNA印迹杂交；使用不同程序及参数的任何生物信息学方法；和通过使用针对本发明肽的抗体的任何基于抗体的方法、流式细胞术、免疫沉淀法、免疫共沉淀法、免疫组织化学、免疫荧光法、ELISA和ELIS-POT技术确定至少一种编码菌毛肽或其片段的多核苷酸或其片段。因此，在本发明的优选实施方案中，使用基于LGG菌毛基因设计引物，通过PCR筛选具有菌毛结构的新细菌菌株。在本发明的另一个优选实施方案中，使用本发明LGG基因的扩增产物作为探针，通过DNA印迹杂交筛选具有菌毛结构的新细菌菌株。在用于筛选本发明多核苷酸的同源序列或片段的方法中优选引物或探针的严格杂交条件。如本文中所用，“同源序列”或“具有高同一性的序列”指与另一个序列可以相同或但不必相同的序列。然而，这些序列是相似的并且它们具有高同一性％。“生物学适合片段”指相似的序列或具有超过35%同一性百分数和超过50个氨基酸长度的序列。在本发明的另一个优选实施方案中，通过计算方法从现存或新建立的序列表或数据库中筛选具有菌毛结构的新细菌菌株和联种群。待筛选的样品可以取自任何生物或任何物质，并且可以是例如细菌培养物、组织样品、血样(血清或血浆样品)、食物样品或环境样品。在本发明的优选实施方案，待筛选的细菌菌株是潜在的益生性细菌菌株。就本发明的筛选方法而言，可以检测与致病性细菌菌株或包含已知致病性组分的细菌菌株相关的菌株。此类菌株可以包含这样的序列，其具有在功能上与本发明序列如与 SEQ ID NO 4(GG00444)相对应的片段，和至少35%至100%序列同一性，或包含本发明的多核苷酸，如包含SEQ ID N012的多核苷酸或其简并序列形式，或编码本发明的肽。在本发明中，筛选可以在体内、体外、在计算机上或离体条件下实施。本发明由以下实施例说明，所述实施例无论如何不意图是限制性的。实施例1.重组LGG菌毛蛋白的克隆、表达和纯化使用侧翼5'-末端和3'末端寡核苷酸引物对(一条引物含有EcoRI位点(对于GG02372，&icl位点)并且另一条引物带Biol位点(见表1))从LGG基因组DNA中PCR 扩增 SpaA (GG00442)、SpaB (GG00443)、SpaC (GG00444)、SpaD (GG02370)、SpaE (GG02371)和 SpaF(GG02372)的编码序列，不包括编码N端信号肽和C端细胞壁分选信号(CWSQ的区域。 扩增的PCR片段用限制性核酸内切酶EcoRI (或对于GG02372，Sacl)和Biol切割，随后连接到受T7调节的表达载体pET28b+中的相应位点中，并且所得重组质粒(对于GG00442， PKTH5319 ；对于 GG00443，pKTH5320 ；对于 GG00444，pKTH5321 ；对于 GG02370，pKTH5324 ； 对于GG02371，pKTH5379 ；并且对于GG02372，pKTH5341)在用于表达胞内C端六组氨酸标记蛋白质的大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS中增殖。在使用标准方案的全部DNA操作中使用已建立的方法。为了蛋白质生产，将大肠杆菌在37°C于补充有50μ g/ml卡那霉素的 Luria-Bertani培养基中培育至对数中期，通过ImM IPTG诱导蛋白质表达3小时，通过离心收获细胞，并且将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液[50mM NaH2PO4(pH 8. 0), 300mM NaCl,10mM 咪唑]中。通过超声处理破坏细胞，通过离心澄清，并且将无细胞的裂解物通过0.45 μ m滤器。随后通过Ni2+螯合的亲和层析法纯化加6组氨酸标签的菌毛蛋白。简言之，将无细胞的裂解物分别施加至Ni-NTA琼脂糖柱(Qiagen)，用洗涤缓冲液[50mM NaH2PO4 (pH 8.0)， 300mM NaCl，20mM咪唑]洗涤，并且蛋白质用洗脱缓冲液[50mM NaH2PO4 (pH 8. 0), 300mM NaCl,250mM咪唑]从该柱洗脱。将含有纯化蛋白质的柱级分汇集，对于SpaA(GG00442)、 SpaC (GG00444)、SpaD (GG02370)、SpaE (GG02371)和 SpaF(GG02372)蛋白而言，使用 BioRad EconoPac IODG脱盐柱针对IOmM Tris-HCl(pH 8. 0)进行缓冲液交换，并且对于 SpaB(GG00443)蛋白而言，针对50mM乙酸钠(pH 5. 1)进行缓冲液交换，并且使用30kDa Micros印滤器(Pall Life Sciences)浓缩。通过SDS-PAGE监测重组菌毛蛋白的纯度并且通过A28tl量值估计蛋白质浓度。实施例2.重组LGG菌毛蛋白特异性多克隆抗体的产生牛艮据 Johnston B. Α.等人(1991, Laboratory of Animal Science 41 :15-21)描述的免疫方案产生对 SpaA(GG00442)、SpaB(GG00443)、SpaC(GG00444)、SpaD(GG02370)、 SpaE(GG02371)和SpaF(GG0237》菌毛蛋白特异的兔多克隆抗体。简述之，起初施用皮下 (SC)注射(lml)400yg纯化的重组菌毛蛋白在弗氏完全佐剂中的1 1混合物，随后以3 周间隔三次加强注射(SC)200yg蛋白质在弗氏不完全佐剂中的1 1混合物。最后加强注射后两周进行终末血液收集。使用标准方案实施从该血液制备抗血清。
权利要求
1.肽，其包含与SEQID NO 4(GG00444)具有至少91 %序列同一性的序列或其片段或变体。
2.肽，其包含与SEQID NO 1 (GG00441)具有至少94%序列同一性的序列或其片段或变体。
3.肽，其包含与SEQID NO 2 (GG00442)具有至少94%序列同一性的序列或其片段或变体。
4.肽，其包含与SEQID NO 3 (GG00443)具有至少84%序列同一性的序列或其片段或变体。
5.肽，其包含与SEQID NO 5 (GG02369)具有至少83%序列同一性的序列或其片段或变体。
6.肽，其包含与SEQID NO 6 (GG02370)具有至少94%序列同一性的序列或其片段或变体。
7.肽，其包含与SEQID NO 7(GG02371)具有至少93%序列同一性的序列或其片段或变体。
8.肽，其包含与SEQID NO 8 (GG02372)具有至少93%序列同一性的序列或其片段或变体。
9.根据权利要求1和3-4和/或6-8任一项所述的肽，其中该肽是菌毛结构的一部分。
10.菌毛结构，其包含根据权利要求1和3-4和/或6-10任一项所述的至少一种肽。
11.根据权利要求10所述的菌毛结构，其包含根据权利要求1和3-4所述的肽。
12.根据权利要求10所述的菌毛结构，其包含根据权利要求6-8所述的肽。
13.根据前面权利要求任一项所述的肽或菌毛结构，其是重组的。
14.根据前面权利要求任一项所述的肽或菌毛结构，其来自细菌。
15.根据前面权利要求任一项所述的肽或菌毛结构，其来自鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)0
16.根据前面权利要求任一项所述的肽或菌毛结构，其来自鼠李糖乳杆菌GG(LGG)菌株。
17.根据前面权利要求任一项所述的肽或菌毛结构，其与胃肠道结合。
18.根据前面权利要求任一项所述的肽或菌毛结构，其与黏液结合。
19.产品，包含根据权利要求1-18任一项所述的至少一种肽或菌毛结构。
20.根据权利要求19所述的产品，其是食品或饲料产品。
21.根据权利要求20所述的食品，其中该食品选自由奶产品、烘焙产品、巧克力和甜食、糖和口香糖、谷物产品、小吃、基于浆果或水果的产品和饮料/饮品组成的组。
22.根据权利要求21所述的食品，其中该食品选自由乳、酸乳、酸奶、奶酪与spreads、 乳粉、儿童食品、婴儿食品、学步儿童食品、婴儿配方食品、果汁和汤组成的组。
23.药物组合物，包含根据权利要求1-18任一项所述的至少一种肽或菌毛结构。
24.产品，其包含作为药物使用的根据权利要求1-18任一项所述的至少一种肽或菌毛结构。
25.根据权利要求1-18任一项所述的至少一种肽或菌毛结构的产品，其用于预防或治疗腹泻、动脉性高血压、血管病、变态反应、癌症、特应性疾病、病毒病、传染病、尿道感染、呼吸道感染、龋齿、肠易激综合征、炎性肠病、粘膜炎症、肠通透性紊乱、肥胖症、代谢综合征、 氧化性应激或腹痛。
26.根据权利要求18任一项所述的至少一种肽或菌毛结构在制造药物中的用途，所述药物用于预防或治疗腹泻、动脉性高血压、血管病、变态反应、癌症、特应性疾病、病毒病、传染病、尿道感染、呼吸道感染、龋齿、肠易激综合征、炎性肠病、粘膜炎症、肠通透性紊乱、肥胖症、代谢综合征、氧化性应激或腹痛。
27.多核苷酸，其包含SEQID NOs 9_16任一者的序列或其简并序列或编码根据权利要求1-9或13-18任一项所述的肽。
28.载体，其包含根据权利要求27所述的多核苷酸。
29.宿主细胞，其包含根据权利要求27所述的多核苷酸或根据权利要求1-18任一项所述的肽。
30.基因簇，其包含根据权利要求27所述的至少一种多核苷酸。
31.抗体，其针对根据权利要求1-9或13-18任一项所述的肽的任一种或针对它们的功能域。
32.用于治疗或预防腹泻、动脉性高血压、血管病、变态反应、癌症、特应性疾病、病毒病、传染病、尿道感染、呼吸道感染、龋齿、肠易激综合征、炎性肠病、粘膜炎症、肠通透性紊乱、肥胖症、代谢综合征、氧化性应激或腹痛的方法，包括对受试者施用根据权利要求1-18 任一项所述的至少一种肽或菌毛结构。
33.筛选包含SEQID NOs 9_16的至少一种多核苷酸或其片段的细菌菌株的方法，其中该方法包括i)提供来自细菌菌株的DNA或RNA;ii)将对SEQID NOs 9-16的多核苷酸或其片段特异的引物或探针与来自步骤i)的 DNA或RNA杂交并任选地扩增该多核苷酸或其片段；iii)检测与SEQID NOs 9-16的多核苷酸或其片段同源的至少一种多核苷酸或其片段。
34.根据权利要求31所述的SEQID NOs 9_16的至少一种多核苷酸或其片段或至少一种抗体用于筛选细菌菌株的用途。
35.使用根据权利要求31的至少一种抗体筛选包含根据权利要求1-18任一项所述的至少一种肽或菌毛结构的细菌菌株的方法，其中该方法包括i)提供细菌菌株的蛋白质； )使用所述一种或多种抗体检测至少一种多肽、菌毛结构或其片段。
36.根据权利要求33或35所述的方法或根据权利要求34所述的用途，其中细菌菌株是益生性的。
37.减低或抑制致病菌对受试者胃肠道、对其上皮或对其黏液黏附的方法，其中该方法包括对受试者施用根据权利要求1-18任一项所述的至少一种肽和/或菌毛结构。
38.根据权利要求1-18任一项所述的至少一种肽和/或菌毛结构用于减低或抑制致病菌对受试者胃肠道、对其上皮或对其黏液黏附的用途。
39.促进细菌细胞黏附于或任何其他物质黏附于黏液或上皮的方法，其中该方法包括i)产生根据权利要求1-18任一项所述的至少一种肽或菌毛结构或其片段； )在细菌细胞上或任何其他物质上展示该肽、菌毛结构和/或其片段； iii)使所述细菌细胞或任何其他物质与黏液或上皮接触。
40.根据权利要求1-18任一项所述的至少一种肽或菌毛结构用于促进细菌细胞或任何其他物质黏附于黏液或上皮的用途。
41.调节受试者中免疫应答的方法，其中该方法包括i)产生根据权利要求1-18任一项所述的至少一种肽或菌毛结构或其片段； )在宿主细胞上展示该肽、菌毛结构和/或其片段； iii)任选地使该宿主细胞与另一个宿主细胞接触。
42.根据权利要求1-18任一项所述的至少一种肽或菌毛结构用于调节受试者中免疫应答的用途。
43.产生根据权利要求19-22任一项所述的产品的方法，其中该方法包括对该产品产生根据权利要求1-18任一项所述的至少一种肽或菌毛结构的步骤。
44.根据权利要求43所述的方法，其中该方法包括添加根据权利要求1-18任一项所述的至少一种肽或菌毛结构至该产品。
45.产生根据权利要求1-18任一项所述的至少一种肽或菌毛结构的方法，其中该方法包括以下步骤i)提供根据权利要求27所述的至少一种多核苷酸； )用所述多核苷酸转化宿主细胞；iii)培养来自步骤ii)的宿主细胞以产生所述肽或菌毛结构；iv)任选地回收所述肽或菌毛结构。
46.产生根据权利要求1-18任一项所述的至少一种肽或菌毛结构的方法，其中该方法包括以下步骤i)破坏产生或包含根据权利要求1-18任一项所述的至少一种肽或菌毛结构的细胞； )任选地回收所述肽或菌毛结构。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述细胞是死细胞或活细胞。
48.产生根据权利要求1-9或13-18任一项所述的至少一种肽的方法，其中该方法包括以下步骤i)提供氨基酸； )通过合成至少一种肽从步骤i)的氨基酸制造本发明的至少一种肽。
49.通过使用生物信息学方法检测潜在的益生性细菌菌株的方法，其中该方法包括以下步骤i)提供根据权利要求1-9、13-18或27所述的至少一种肽、多核苷酸或其片段的序列； )将步骤i)的序列针对序列集合的序列进行比较； iii)检测与步骤i)的序列具有生物学适合片段的序列。
50.通过使用生物信息学方法检测根据权利要求1-18所述的肽或菌毛结构有效针对的病原菌株的方法，其中该方法包括i)提供根据权利要求1-9、13-18或27所述的至少一种肽、多核苷酸或其片段的序列； )将步骤i)的序列针对序列集合的序列进行比较；iii)检测与步骤i)的序列具有生物学适合片段的序列。
全文摘要
本发明涉及生命科学和食品、饲料或制药工业。具体而言，本发明涉及新的肽、菌毛结构、多核苷酸以及包含所述多核苷酸、肽或菌毛结构的载体、宿主细胞、产品和药物组合物。本发明也涉及基因簇和抗体。另外，本发明涉及用于产生所述肽或菌毛结构或产生包含所述肽或菌毛结构的产品的方法。另外，本发明涉及用于筛选细菌菌株、用于减低或抑制致病菌黏附、促进细菌细胞黏附于黏液和用于调节受试者中免疫应答的治疗以及用途和方法。再者，本发明涉及用于检测益生细菌菌株或病原菌株的方法。
文档编号G01N33/48GK102317311SQ201080006238
公开日2012年1月11日 申请日期2010年2月2日 优先权日2009年2月2日
发明者A·帕尔瓦, I·冯奥索夫斯基, I·帕尔瓦, J·雷乌纳宁, M·坎凯宁, R·萨托卡里, S·廷屈宁, S·韦斯特隆德, T·萨卢斯耶尔维, W·M·德福斯 申请人:维利奥有限公司