专利名称：一种固定化绿藻细胞的生物电极及其使用和测试方法
技术领域：
本发明涉及一种固定化绿藻细胞的生物电极及其使用方法，即在平面多孔电极材料上使用硅溶胶-凝胶方法固定绿藻细胞，构建绿藻生物电极。在电解液中加入电子介体实现绿藻细胞光反应中心与电极间的电子传递，以三电极体系并外加电压对电极进行测试。
背景技术：
绿藻制氢是目前制氢领域中的研究热点。绿藻在光合作用II过程中能将水分解成氧气、质子和电子，电子经过光合系统I的电子传递链及铁氧化还原蛋白传递给氢酶，氢酶将质子还原为氢气。绿藻产氢过程中，产氢电子来源包括依赖于PS II的直接途径和不依赖于PS II的间接途径，二者的分配比例以及具体的电子传递机理对产氢藻株的调控改造及规模产氢的实用化具有重要意义，相关研究尚未有确定性结果。由于微藻细胞内部生化反应及代谢网络的复杂性，同时其反应中心往往附着于生物膜与外界隔离，无法直接得到其内环境的信息，包括氧化还原电位与代谢产物的影响等等无法直接考察，以细胞作为对象研究其关键反应中心动力学变化规律在现阶段受到极大限制。而以生物燃料电池或电解电池技术研究绿藻产氢代谢中电子传递，即通过电子介体将生化反应中心，尤其是光合系统产生电子直接传递至电极并加以检测考察，对深入研究绿藻产氢过程中代谢机理，以及与其他代谢网络的相互关系具有重要意义。例如Torimura等以蓝藻为研究对象，使用DMBQ作为光诱导电子的传递介体，在悬浮体系及碳糊电极系统下实现了基于微藻的生物光电转换，获得了大约I微安量级的光诱导电流。综观这些类似的研究，其中的关键问题在于如何实现电子在生化反应中心与电池的电极间的高效传递，在此问题上藻细胞悬浮体系及碳糊电极系统由于扩散限制以及由此导致的还原态介体重新与氧结合的增强，均会大大降低电子的传递效率。将微藻细胞固定于电极材料上则可有效地解决这一问题，现有研究中藻细胞的固定化虽有大量报道，但以硅溶胶-凝胶方法固定藻细胞在电极材料上制备绿藻生物电极并结合介体的使用应用于光诱导电子传递的研究，在国内外均未有报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种固定化绿藻细胞的生物电极及其使用和测试方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种固定化绿藻细胞的生物电极，将绿藻细胞与硅溶胶混合涂层固定于电极材料上，构建绿藻生物电极。该生物电极是在平面多孔电极材料上采用硅溶胶-凝胶固定绿藻细胞制备而成。在平面多孔电极材料上采用硅溶胶-凝胶方法固定绿藻细胞；具体操作步骤如下I)硅溶胶的制备取四乙氧基硅烷、PH = 2-3的HCl水溶液在室温下强烈搅拌形成酸性硅溶胶，用NaOH将硅溶胶pH调整为7. 5-8. 5备用；2)取生长对数后期的绿藻藻细胞，重悬在一定体积的硅溶胶中，充分混匀，用移液器吸取一定体积的混合液平铺在多孔电极材料上，在空气中风干，即制备了绿藻生物电极。步骤(I)中硅溶胶的制备取四乙氧基硅烷、PH = 2-3的HCl水溶液体积比为I 8-10，搅拌时间为24-72h，酸性硅溶胶pH为2. 2-2. 4。调硅溶胶pH所用NaOH为1M。步骤(2)中取生长对数后期，浓度约1-6X 106cells/mL的绿藻，经1500_4000r/min离心浓缩2-5min，倒掉上层水后，即得所述的藻细胞。电极材料为碳纸、不锈钢网或钛电极，电极面积为O. 5_24cm2,移液器吸取藻-娃溶胶的混合液体积为25-300 μ L。所述的固定化绿藻细胞的生物电极的使用方法，以制备的绿藻生物电极作为工作电极，对电极是钼电极或钛电极，将工作电极和对电极置于添加有电解质溶液的电解池中；在可见光存在下，在电解质溶液中加入电子介体实现绿藻细胞光反应中心与电极间的电子传递，在工作电极和对电极间可形成电势差；加入电子介体终浓度为10-400 μ Μ。所述电解质溶液为盐·度为20-35。绿藻为海水绿藻采用灭菌海水为电解质溶液，绿藻为淡水绿藻采用磷酸缓冲液为电解质溶液。所述的固定化绿藻细胞的生物电极的测试方法，以三电极体系并外加电压对电极进行测试；以绿藻生物电极作为工作电极，与对电极及参比电极构成三电极体系，在电解池溶液中加入电子介体，在电化学工作站上进行测试。具体为；制备的绿藻生物电极作为工作电极，与对电极及参比电极构成三电极体系，并在电解质溶液体系中加入终浓度为10-400 μ M电子介体，使用电化学工作站对电极进行测试；测试前通队排氧20min，且在整个测试过程中保持电解池搅拌体系无氧；对电极是钼电极或钛电极，参比电极是Ag/AgCl电极或甘汞电极；电解质溶液为盐度为20-35 ;绿藻为海水绿藻采用灭菌海水为电解质溶液，绿藻为淡水绿藻采用磷酸缓冲液为电解质溶液。磷酸缓冲液浓度为50mM，pH7. 0-8. O。电解池溶液体积为50_500ml，对电极及参比电极测试前均经酸洗处理。电子介体为对苯醌、2，6- 二甲氧基-1，4-苯醌或2，6- 二氯_1，4_苯醌中的一种或二种以上。本发明与现有技术相比具有如下优点1.使用硅溶胶-凝胶方法固定化绿藻细胞，有良好的透光性、机械强度和生物相容性。2.缩小了电子介体的扩散距离，降低了还原性的介体与氧重新结合的风险，提高了电子传递及光电转化的效率。3.具有灵敏的光响应能力，可以得到较高的光诱导电流，达到70微安的量级，稳定性及重复性较好。4.可以达到超过1%的光子-电子转换效率。5.可实现生物光合系统与电化学系统高效耦联，表征生物体系光诱导电子传递过程，实现基于绿藻细胞的直接光电或光能-氢能转化，高效低成本且简单易行。本发明工艺简单，操作方便，绿藻固定在电极上能有效提高电子传递效率，可用于绿藻光诱导电子传递研究。
图1为实施例1中绿藻生物电极对光的响应曲线；图2为实施例2中不同光强下的光响应曲线；图3为实施例2中光电流对光强的拟合；图4为对比实施例3中悬浮藻液的光响应曲线。实施案例下面详细介绍本发明的两个实施例。实施例1亚心型四月藻生物电极对光的响应(I)硅溶胶的制备在60mL水、30mL O. OlM HCl的搅拌体系中缓慢滴入IOmL四乙氧基硅烷，反应50h后，用IM NaOH溶液调整pH为7. 50，接着反应48h，硅溶胶的pH为7. 81，制备好的硅溶胶备用。(2)取生长对数后期，浓度约3. 50X 106cells/mL的亚心型四爿藻57mL，经2000r/min离心浓缩lmin，倒掉上清液后，即得所述的藻细胞。将离心得到的藻细胞重悬在2mL硅溶胶中，移液器吸取藻-硅溶胶的混合液体积为50 μ L，在空气中风干，即为绿藻生物电极。(3)三电极体系中，工作电极是绿藻生物电极，对电极是钼电极或钛电极，参比电极是Ag/AgCl电极或甘汞电极，电极材料为碳纸，电极面积为2. 4cm2，灭过菌的天然海水为电解池溶液，电解池溶液体积 为IOOmL。(4)在暗条件下，三电极电解池中通氮气20min后，进行电化学阻抗谱，随后进行O. 5V恒电位扫描；待基线稳定之后，加入电子介体对苯醌，终浓度为200 μ M，电流平稳之后进行光照，光响应曲线如图1所示。光电流达到94. 2微安。实施例2不同光强下的光响应(I)硅溶胶的制备在60mL水、30mL O. OlM HCl的搅拌体系中缓慢滴入IOmL四乙氧基硅烷，反应48h后，用IM NaOH溶液调整pH为7. 49，接着反应4天，硅溶胶的pH为8. 0，制备好的硅溶胶备用。(2)取浓度约2. 64X 106cells/mL的亚心型四爿藻38mL，藻细胞的Fv/Fm = O. 754，yield = O. 606,经2000r/min离心浓缩lmin,倒掉上清液后，即得所述的藻细胞。将离心得到的藻细胞重悬在ImL娃溶胶中,移液器吸取藻-娃溶胶的混合液体积为50 μ L,在空气中风干，即为绿藻生物电极。(3)三电极体系中，工作电极是绿藻生物电极，对电极是钼电极或钛电极，参比电极是Ag/AgCl电极或甘汞电极，电极材料为碳纸，电极面积为2. 4cm2，灭过菌的天然海水为电解池溶液，电解池溶液体积为IOOmL。(4)在暗条件下，三电极电解池中通氮气20min后，进行电化学阻抗谱，随后进行O. 5V恒电位扫描；待基线稳定之后，加入电子介体对苯醌，终浓度为300 μ M，电流平稳之后进行光照，改变不同的光强，光响应曲线如图2所示。经图3光电流对光强进行线性拟合，得到直线斜率O. 2611 μ A/μ E，R2为O. 9976，斜率与电极面积(2. 4cm2)的比值，得到1. 13%的光子-电子转换效率。
对比实施例3悬浮藻液的光响应(I)取浓度约3. OOX 106cells/mL的亚心型四爿藻IOOmL,经2000r/min离心浓缩lmin，倒掉上清液后，即得所述的藻细胞。(2)三电极体系中，对电极是钼电极或钛电极，参比电极是Ag/AgCl电极，工作电极材料为碳纸，电极面积为2. 4cm2，将离心得到的藻细胞重悬在IOOmL电解池溶液，电解液为灭过菌的天然海水。(3)在暗条件下，三电极电解池中通氮气20min后，进行电化学阻抗谱，随后进行O. 5V恒电位扫描；待基线稳定之后，加入电子介体对苯醌，终浓度为100 μ M，电流平稳之后进行光照光响应曲线如图4所示。对比实施例3中光电流为3. 8微安，实施例1的结果是它的大约25倍，充分展示出本发明具有的更 灵敏、高效的优点。
权利要求
1.一种固定化绿藻细胞的生物电极，其特征在于 将绿藻细胞与硅溶胶混合涂层固定于多孔电极材料上，构建绿藻生物电极。
2.按照权利要求1所述的生物电极，其特征在于 在平面多孔电极材料上采用硅溶胶-凝胶方法固定绿藻细胞； 具体操作步骤如下 1)硅溶胶的制备取四乙氧基硅烷、PH= 2-3的HCl水溶液在室温下强烈搅拌形成酸性硅溶胶，用NaOH将硅溶胶pH调整为7. 5-8. 5备用； 2)取生长对数后期的绿藻藻细胞，重悬在硅溶胶中，充分混匀，用移液器吸取混合液平铺在多孔电极材料上，在空气中风干，即制备了绿藻生物电极。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于 步骤⑴中硅溶胶的制备取四乙氧基硅烷、PH = 2-3的HCl水溶液体积比为1 8-10，搅拌时间为24-72h，酸性硅溶胶pH为2. 2-2.4。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中电极材料为碳纸、不锈钢网或钛电极；混合液平铺在多孔电极材料上的厚度1-15微米。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中绿藻藻细胞在硅溶胶中的浓度为4000-30000万个细胞/mL。
6.一种权利要求1-5任一项所述的固定化绿藻细胞的生物电极的使用方法，其特征在于 以制备的绿藻生物电极作为工作电极，对电极是钼电极或钛电极，将工作电极和对电极置于添加有电解质溶液的电解池中；在可见光存在下，在电解质溶液中加入电子介体实现绿藻细胞光反应中心与电极间的电子传递，在工作电极和对电极间可形成电势差； 加入电子介体终浓度为10-400 μ M。
7.按照权利要求6所述的使用方法，其特征在于 电解质溶液为盐度为20-35。
8.按照权利要求6或7所述的使用方法，其特征在于 绿藻为海水绿藻采用灭菌海水为电解质溶液，绿藻为淡水绿藻采用磷酸缓冲液为电解质溶液。
9.一种权利要求1-5任一项所述的固定化绿藻细胞的生物电极的测试方法，其特征在于 以三电极体系并外加电压对电极进行测试； 制备的绿藻生物电极作为工作电极，与对电极及参比电极构成三电极体系，并在电解质溶液体系中加入终浓度为10-400 μ M电子介体，使用电化学工作站对电极进行测试；测试前通N2排氧20min，且在整个测试过程中保持电解池搅拌体系无氧；对电极是钼电极或钛电极，参比电极是Ag/AgCl电极或甘汞电极； 电解质溶液为盐度为20-35 ； 绿藻为海水绿藻采用灭菌海水为电解质溶液，绿藻为淡水绿藻采用磷酸缓冲液为电解质溶液。
10.按照权利要求5或8所述的方法，其特征在于电子介体为对苯醌、2，6_二甲氧基-1，4-苯醌或2，6_ 二甲氧基-1，4-苯醌中的一种或二种以上。
全文摘要
本发明涉及一种固定化绿藻细胞的生物电极及其使用方法。该生物电极是在平面多孔电极材料上采用硅溶胶-凝胶方法固定绿藻细胞制备而成。制备的绿藻生物电极作为工作电极，与对电极和参比电极构成三电极体系，并在电解液中加入电子介体，外加电压对电极进行光响应测试。利用所制备的绿藻生物电极可以实现绿藻光合系统与电化学系统间的电子传递，并可得到94.2微安的光电流，是藻细胞悬浮体系的光电流的25倍，国际上尚无相关的硅溶胶固定化微藻制备生物电极用于光电流研究的技术报道。本发明可实现生物光合系统与电化学系统高效耦联，表征生物体系光诱导电子传递过程，实现基于绿藻细胞的直接光电或光能-氢能转化，具有高效低成本且简单易行的特点。
文档编号G01N27/327GK103048370SQ20111030839
公开日2013年4月17日 申请日期2011年10月12日 优先权日2011年10月12日
发明者陈兆安, 吕艳霞, 陆洪斌, 周建男 申请人:中国科学院大连化学物理研究所