利用两轮加菌共培养提高小球藻产量的方法和制备生物饲料的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物和生物技术领域，具体设及一种利用两轮加菌共培养提高小球 藻产量的方法和制备生物饲料的方法。
【背景技术】
[0002] 小球藻是一种单细胞绿藻，其环境适应性强，易于大规模培养，细胞中含有丰富的 营养物质，广泛应用于保健食品、饲料、食品添加剂、精细化加工品和作为医药制剂原料，其 开发利用已经引起国内外广泛的重视。我国常见的小球藻种类有蛋白核小球藻、楠圆小球 藻、普通小球藻等，其中蛋白核小球藻藻粉粗蛋白核必需氨基酸含量高，是一种优良的饲料 蛋白源(李国平.蛋白核小球藻粉中氨基酸含量和饲用价值分析.中国野生植物资源.2003， 22(2) :23-25)。蛋白核小球藻还可W清除废水中不同形态的氮和憐，可用于工厂化水产养 殖废水的净化处理(陈海敏等，工厂化水产养殖废水菌藻联合处理模式研究.浙江树人大学 学报，2002,2(4) :64-67),还能利用偶氮染料为唯一氮源和碳源生长，对印染废水中的偶氮 染料具有较强的脱色能力(郑金来等，生物降解常见染料的研究进展.环境污染治理技术与 设备，2000，1 (3): 39-43)。因此，如何在提高细胞生长速率，短时间内获得大量的藻细胞是 开发应用蛋白核小球藻的关键技术环节。
[0003] 已有研究表明微藻和微生物之间存在从寄生到共生等广泛的互作现象，某些微生 物对藻细胞的生长代谢影响显著某些微生物对藻细胞的生长代谢影响显著，能促进藻细胞 生长和生化组分的积累[Ueda H,et al.Bacterial communities constructed in 曰rtifici曰I consorti曰 of b曰cteri曰曰nd Chlorell曰 vulg曰ris.Microbes Environment, 2010,25(1) :36-40.]。植物内生菌是能够定殖在健康植物内，并与宿主植物建立和谐共生 关系的一类微生物。水稻植株含有许多内生微生物，是重要的内生细菌资源，来源于水稻植 株的内生泛菌可W显著促进宿主水稻的生长，提高其生物量、叶绿素及憐含量的生物学作 用（FengY,et al.Rice endophyte Pantoea agglomeransYS19promotes hostplant growth and affects allocations of hostphotosynthates. Journal ofApplied Microbiology，2006，100(5):938-945.刘佳，等.内生成团泛菌HAUMl对宿主水稻的定殖及 促生作用.湖北农业科学，2011，50 (23): 4820-4824.)。由于小球藻与植物细胞一样具有叶 绿体，能够进行光合作用，其生化代谢特征与植物具有相似性，理论上，对植物具有代谢调 节作用的植物内生菌也能影响小球藻的生长和代谢活动，但迄今国内外未见采用包括水稻 内生菌在内的植物内生菌促进小球藻生长及生化组分合成积累的技术研究和应用。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种利用两轮加菌共培养提高小球藻产量的方法和制备生物饲料 的方法，应用水稻内生泛菌进行两轮菌藻共培养，达到快速增加小球藻生长速率的目的效 果。
[0005] -种利用两轮加菌共培养提高小球藻产量的方法，包括：
[0006] 1)将第一次加入的水稻内生泛菌和小球藻在光照下进行第一轮菌藻共培养，培养 结束后，得到第一轮菌藻共培养液；
[0007] 2)在第一轮菌藻共培养液中再补加第二次加入的水稻内生泛菌，在光照下进行第 二轮菌藻共培养，培养结束后，得到第二轮菌藻共培养液；
[0008] 3)对第二轮菌藻共培养液进行细胞分离，得到小球藻细胞沉淀和内含水稻内生泛 菌的上清菌液。
[0009] W下作为本发明的优选技术方案：
[0010] 步骤1)中，所述的第一轮菌藻共培养的条件为:培养条件均为23°c~33°C，光强 1500~2500LUX，光周期为10~14虹昼/10~Hhr夜，主要为静置培养，每天摇动培养瓶混匀 2~6次直至培养周期结束，培养周期为6~12天。进一步优选，所述的第一轮菌藻共培养的 条件为:培养条件均为28°C，光强2000LUX，光周期为12hr昼/1化r夜，主要为静置培养，每天 摇动培养瓶混匀4次直至培养周期结束，培养周期为8天。
[0011] 所述的第一次加入的水稻内生泛菌和小球藻的菌藻比为1~10000:1，在一定范围 内，水稻内生泛菌的比例越高，越能够促进小球藻的生长，越能够提高小球藻产量。进一步 优选，所述的第一次加入的水稻内生泛菌和小球藻的菌藻比为10~1000:1。
[0012] 所述的水稻内生泛菌可采用市售产品，可采用中国农业微生物保藏中屯、(ACCC)出 售的编码为10454的水稻内生泛菌菌种。
[0013] 所述的小球藻可W为蛋白核小球藻，也可采用市售产品，可采用中国科学院野生 生物种质库淡水藻种库(FACHB)市售的编号为FACHB-1222的蛋白核小球藻。
[0014] 步骤2)中，所述的第二轮菌藻共培养的条件为:培养条件均为23°C~33°C，光强 1500~2500LUX，光周期为10~14虹昼/10~Hhr夜，主要为静置培养，每天摇动培养瓶混匀 2~6次直至培养周期结束，培养周期为2~12天。进一步优选，所述的第二轮菌藻共培养的 条件为:培养条件均为28°C，光强2000LUX，光周期为12hr昼/1化r夜，主要为静置培养，每天 摇动培养瓶混匀4次直至培养周期结束，培养周期为4~8天。
[0015] 所述的第二次加入的水稻内生泛菌和第一次加入的水稻内生泛菌的比为0.25~ 4:1。进一步优选，所述的第二次加入的水稻内生泛菌和第一次加入的水稻内生泛菌的比为 1:1，能够更好地促进小球藻的生长，越能够提高小球藻产量。
[0016] 步骤3)中，所述的细胞分离包括:第二轮菌藻共培养液先在超声波条件下处理，之 后离屯、，得到小球藻细胞沉淀和内含水稻内生泛菌的上清菌液。
[0017] 进一步优选，所述的超声波条件为:在140W~180W、30kHz~50kHz超声波条件下处 理15s~45s。所述的离屯、为在1000~140化/min低速离屯、3~IOmin。更进一步优选，所述的 超声波条件为:在160W、40曲Z超声波条件下处理30s。所述的离屯、为在1200r/min低速离屯、 5min。在160W、40曲Z超声波条件下处理30s，使水稻内生泛菌细胞和小球藻细胞发生分离， 120化/min低速离屯、5min，使较大的小球藻细胞沉淀下来而较小的水稻内生泛菌仍悬浮上 清中，分别收集沉淀中的小球藻细胞和上清中的水稻内生泛菌细胞。
[0018]本发明中，小球藻细胞沉淀经洗涂重悬后可作为水中偶氮染料降解等污水净化处 理的生物基料，也可经干燥后获得蛋白核小球藻细胞产品，作为制备饲料、提取油脂、蛋白、 色素和生长因子等相关生物产品的原料。
[0019] 小球藻细胞沉淀经处理后得到小球藻细胞干品，所述的处理包括:洗涂、离屯、和干 燥，将小球藻细胞沉淀加入蒸馈水重悬洗涂后，经6000~100(K)r/min离屯、5~20min后收集， 之后在30°C~50°C低溫条件下烘干，得到小球藻藻细胞干品。进一步优选，将小球藻细胞沉 淀加入蒸馈水重悬洗涂后，经8000r/min离屯、IOmin后收集，之后在40°C低溫条件下烘干，得 到小球藻藻细胞干品。
[0020] -种制备生物饲料的方法，包括：
[0021] 1)根据所述的利用两轮加菌共培养提高小球藻产量的方法制备得到小球藻细胞 沉淀；
[0022] 2)将小球藻细胞沉淀经洗涂、离屯、和干燥后得到小球藻细胞干品，将小球藻细胞 干品制成生物饲料。
[0023] 所述的洗涂、离屯、和干燥具体为：将小球藻细胞沉淀加入蒸馈水重悬洗涂后，经 6000~lOOOOr/min离屯、5~20min后收集，之后在30°C~50°C低溫条件下烘干，得到小球藻 藻细胞干品。进一步优选，将小球藻细胞沉淀加入蒸馈水重悬洗涂后，经8000r/min离屯、 IOmin后收集，之后在40°C低溫条件下烘干，得到小球藻藻细胞干品。
[0024] 小球藻细胞干品可直接制作为藻生物饲料，也可W将小球藻细胞干品添加到饲料 配方中，得到复合生物饲料。
[0025] 本发明补菌增藻技术的机理在于:在菌藻互作的共培养过程中，由于采用的是小 球藻适合的培养基和培养条件，共生细菌能够促进微藻的生长，相反，微藻可能产生细菌生 长抑制物质，如绿藻素等抑制菌细胞的增殖，如此随着培养周期的延长，菌藻培养液中藻细 胞呈逐渐增长趋势，而菌细胞数量则逐渐衰减，会越来越少，最后菌藻培养体系中只有极少 量的菌细胞存活。因此，菌对藻的增殖促进作用在一定范围内随接种菌藻比的增大而增大， 而且在补菌初期的增藻效果比后期更为明显，运也是决定本发明所设定的接种菌藻比、共 培养周期时段长短和补菌接种时间的技术基础。作为优选，本发明W接种菌藻比10-1000: 1，首轮培养8天，第二轮及此后补菌共培养时间W4-8天为主，W达到理想的技术效果。
[0026] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0027] 本发明中，蛋白核小球藻活细胞沉淀经洗涂重悬后可作为水中偶氮染料降解等污 水净化处理的生物基料，也可经干燥后获得蛋白核小球藻细胞产品，作为制备饲料、提取油 月旨、蛋白、色素和生长因子