等相关生物产品的原料。本发明技术操作简单，成本低廉，具有快 速增加蛋白核小球藻细胞生长量的显著效果，采用本发明的两轮菌藻共培养技术可使蛋白 核小球藻的活细胞获得量比对照提高23.68~93.97倍，在菌藻接种比为1000:1时，可使蛋 白核藻细胞干重得率(mg/L)比对照提高60.10倍，蛋白核小球藻蛋白产率(mg/L)比对照提 高54.08倍，在蛋白核小球藻的应用开发方面效益显著，前景广阔。
[0028] 本发明将水稻内生泛菌应用于小球藻的培养生产，创建了一种应用水稻内生泛菌 增加蛋白核小球藻生长速率的两轮菌藻共培养技术，为小球藻的工业化生产提供了新途 径。应用本发明的两轮菌藻共培养技术能快速增加蛋白核小球藻的生长速率，在短时间内 获得大量蛋白核小球藻细胞，同时实现菌细胞的重复循环利用，操作简单，成本低，收益高。
【具体实施方式】
[0029] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的技术方案进行清 楚、完整的描述。给出的实施例仅为了阐释本发明，而不是为了限制本发明的应用范围。W 下出现的百分数，如没有特别说明，均为质量百分数。
[0030] 实施例一：
[0031] 1)采用水稻内生泛菌菌种购自中国农业微生物保藏中屯、(ACCC)，编码为10454,菌 种按常规方法活化挑单菌落后，接种到含IOmL LB液体培养基的=角瓶中，进行扩增培养， 将扩增培养16h后处于对数生长期的菌液按菌液:液体LB培养基体积比=1:10接种后进行 二次扩培，培养条件为37°C，200rpm恒溫摇床中黑暗培养。第二次扩培IOh至ODsoo=I作为菌 藻共培养的种子细胞，根据生长曲线，菌生长处于对数期，采用常规平板计数法测定培养液 中的有效活菌数(C即，Colon厂化rming化its)，此时菌液浓度约为2 X 10化即/mL。根据菌 藻共培养所需菌细胞数量，取适量种子菌液于室溫25°C8000;r/min离屯、lOmin，沉淀用3倍体 积无菌水洗涂两次，再离屯、IOmin收集菌体细胞，加入与种子菌液等体积的BGl 1液体培养基 悬浮备用。
[0032] 2)采用蛋白核小球藻藻种购自中国科学院野生生物种质库淡水藻种库(FAOffl), 具体为，编号为FAC皿-1222。取蛋白核小球藻原藻液，按1(T 2，1(T3，1(T4进行梯度稀释，取稀 释藻液10化L涂布于BGl 1固体培养基(为BG11液体培养基中添加2 %琼脂），培养皿置于光照 培养箱中培养，7天后，BGll培养基中长出深绿色的单藻落，用无菌枪头挑取单藻落到含 IOmL BGll液体培养基的S角瓶中，进行扩增培养。将扩增培养7天后处于对数生长期的藻 细胞按藻液:液体BGl 1培养基体积比=1:10接种后进行二次扩培，如此共扩培3次，每次培 养7天。培养条件为:28°C，光强2000LUX，光周期为12虹昼/1化r夜，每天早晚各摇动一次。第 3次扩增培养结束后，应用常规血球板计数法计算细胞培养液中的小球藻细胞浓度为2.6 X IO7个cel 1/mL，作为小球藻种子细胞培养液。
[0033] 3)同时设定菌藻共培养组和纯藻培养对照组，其中菌藻共培养组蛋白核小球藻种 子细胞初始接种浓度为2 X IO6个cell/mL，水稻内生泛菌种子细胞初始接种浓度为2 X IO5CFlVmL,如此菌藻细胞接种比为10:1，混匀后进行首轮菌藻共培养。纯藻培养对照组仅 接种蛋白核小球藻种子细胞，初始接种浓度为2X IO5个cell/mL。两组培养体系均为500ml X 3瓶，培养条件均为28 °C，光强2000LUX，光周期为12hr昼/1化r夜，主要为静置培养，每天 摇动培养瓶混匀4次，培养周期为8天。
[0034] 4)共培养第9天，按菌藻共培养初始接种的水稻内生泛菌细胞浓度2X 10化即/mL 补接种入水稻内生泛菌种子细胞，进行第二轮菌藻共培养，培养周期为4天。
[0035] 5)两轮菌藻共培养结束后，将培养液震荡混匀后，取培养液Iml采用血球计数板法 测定培养液中的蛋白核小球藻细胞数目，结果:纯藻培养对照组培养液中藻细胞浓度平均 值为3.58 X IO7个cel VmL，菌藻共培养组藻细胞浓度为9.50 X IO8个cell/血，同比是对照的 23.68倍。
[0036] 实施例二：
[0037] 1)采用水稻内生泛菌菌种购自中国农业微生物保藏中屯、(ACCC)，编码为10454,菌 种按常规方法活化挑单菌落后，接种到含IOmL LB液体培养基的=角瓶中，进行扩增培养， 将扩增培养16h后处于对数生长期的菌液按菌液:液体LB培养基体积比=1:10接种后进行 二次扩培，培养条件为37°C，200rpm恒溫摇床中黑暗培养。第二次扩培IOh至ODsoo=I作为菌 藻共培养的种子细胞，根据生长曲线，菌生长处于对数期，采用常规平板计数法测定培养液 中的有效活菌数(c即，Colon厂化rming化its)，此时菌液浓度约为2 X 10化即/mL。根据菌 藻共培养所需菌细胞数量，取适量种子菌液于室溫25°C8000;r/min离屯、lOmin，沉淀用3倍体 积无菌水洗涂两次，再离屯、IOmin收集菌体细胞，加入与种子菌液等体积的BGl 1液体培养基 悬浮备用。
[0038] 2)采用蛋白核小球藻藻种购自中国科学院野生生物种质库淡水藻种库(FAOffl), 具体为，编号为FAC皿-1222。取蛋白核小球藻原藻液，按1(T2，1(T3，1(T 4进行梯度稀释，取稀 释藻液10化L涂布于BGl 1固体培养基(为BG11液体培养基中添加2 %琼脂），培养皿置于光照 培养箱中培养，7天后，BGll培养基中长出深绿色的单藻落，用无菌枪头挑取单藻落到含 IOmL BGll液体培养基的S角瓶中，进行扩增培养。将扩增培养7天后处于对数生长期的藻 细胞按藻液:液体BGl 1培养基体积比=1:10接种后进行二次扩培，如此共扩培3次，每次培 养7天。培养条件为:28°C，光强2000LUX，光周期为12虹昼/1化r夜，每天早晚各摇动一次。第 3次扩增培养结束后，应用常规血球板计数法计算细胞培养液中的小球藻细胞浓度为2.6 X IO7个cel 1/mL，作为小球藻种子细胞培养液。
[0039] 3)同时设定菌藻共培养组和纯藻培养对照组，其中菌藻共培养组蛋白核小球藻种 子细胞初始接种浓度为2 X IO5个cell/mL，水稻内生泛菌种子细胞初始接种浓度为2 X IO7C即/mL,如此菌藻细胞接种比为100:1，混匀后进行首轮菌藻共培养。纯藻培养对照组仅 接种蛋白核小球藻种子细胞，初始接种浓度为2X IO5个cell/mL。两组培养体系均为500ml X 3瓶，培养条件均为28 °C，光强2000LUX，光周期为12hr昼/1化r夜，主要为静置培养，每天 摇动培养瓶混匀4次，培养周期为8天。
[0040] 4)共培养第9天，按菌藻共培养初始接种的水稻内生泛菌细胞浓度2X IO7C即/mL 补接种入水稻内生泛菌种子细胞，进行第二轮菌藻共培养，培养周期为4天。
[0041] 5)两轮菌藻共培养结束后，将培养液震荡混匀后，取培养液Iml采用血球计数板法 测定培养液中的蛋白核小球藻细胞数目，结果:纯藻培养对照组培养液中藻细胞浓度平均 值为3.58 X IO7个CeIVmL，菌藻共培养组培养液中藻细胞浓度平均值为1.72 X IO9个Ce 11/ mL，比对照增加47.05倍。。
[0042] 实施例
[0043] 1)采用水稻内生泛菌菌种购自中国农业微生物保藏中屯、(ACCC)，编码为10454,菌 种按常规方法活化挑单菌落后，接种到含IOmL LB液体培养基的=角瓶中，进行扩增培养， 将扩增培养16h后处于对数生长期的菌液按菌液:液体LB培养基体积比=1:10接种后进行 二次扩培，培养条件为37°C，200rpm恒溫摇床中黑暗培养。连续扩培=次，培养条件为37°C， 2(K)rpm恒溫摇床中黑暗培养。第S次扩培IOh至ODsoo = I作为菌藻共培养的种子细胞，根据 生长曲线，菌生长处于对数期，采用常规平板计数法测定培养液中的有效活菌数（CFU， Colony-Forming化its)，此时菌液浓度约为2 X 108CFU/mL。根据菌藻共培养所需菌细胞数 量，取适量种子菌液于室溫25°C8000;r/min离屯、lOmin，沉淀用3倍体积无菌水洗涂两次，再 离屯、IOmin收集菌体细胞，加入与种子菌液等体积的BGll液体培养基悬浮备用。
[0044] 2)采用蛋白核小球藻藻种购自中国科学院野生生物种质库淡水藻种库(FAOffl), 具体为，编号为FAC皿-1222。取蛋白核小球藻原藻液，按1(T2，1(T3，1(T 4进行梯度稀释，取稀 释藻液10化L涂布于BGl 1固体培养基(为BG11液体培养基中添加2 %琼脂），培养皿置于光照 培养箱中培养，7天后，BGll培养基中长出深绿色的单藻落，用无菌枪头挑取单藻落到含 IOmL BGll液体培养基的S角瓶中，进行扩增培养。将扩增培养7天后处于对数生长期的藻 细胞按藻液:液体BGl 1培养基体积比=1:10接种后进行二次扩培，如此共扩培3次，每次培 养7天。培养条件为:28°C，光强2000LUX，光周期为12虹昼/1化r夜，每天早晚各摇动一次。第 3次扩增培养结束后，应用常规血球板计数法计算细胞培养液中的小球藻细胞浓度为2.6 X IO7个cel 1/mL，作为小球藻种子细胞培养液。
[0045] 3)同时设定菌藻共培养组和纯藻培养对照组，其中菌藻共培养组蛋白核小球藻种 子细胞初始接种浓度为2 X IO5个c