一种利用两轮共培养和絮凝法制备菌藻细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及菌藻共培养技术领域，具体设及一种利用两轮共培养和絮凝法制备菌 藻细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 小球藻是一种单细胞绿藻，其环境适应性强，易于大规模培养，细胞中含有丰富的 营养物质，广泛应用于保健食品、饲料、食品添加剂、精细化加工品和作为医药制剂原料。小 球藻富含短链脂肪酸，是优质的生物柴油原料(徐进，徐旭东，方仙桃，胡哈华.高产油小球 藻的筛选及其油脂分析.水生生物学报，2012,36(3) :426-432.)。蛋白核小球藻是我国常见 的小球藻品种，其含量蛋白高，必需氨基酸丰富，是一种优良的饲料蛋白源(李国平.蛋白核 小球藻粉中氨基酸含量和饲用价值分析.中国野生植物资源.2003，22(2): 23-25)。近年来 小球藻的生产效益显著，前景十分广阔。特别是新兴的菌藻共生技术有望突破当前小球藻 开发方面存在的产率低、收获难、成本高等技术限制，倍受业界关注。
[0003] 已有研究表明微藻和微生物之间存在从寄生到共生等广泛的互作现象，某些微生 物能通过分泌生长激素和信号调节物质促进藻细胞生长，提高藻细胞生物量和生化组分的 积累[Ued曰 H,Otsuk曰 S,Senoo K.Bacterial communities constructed in artificial consortia of bacteria and Chlorell曰 vulg曰ris.Microbes Environment,2010,25(I): 36-40.]。但不同种类的细菌对小球藻生长和代谢的影响不同，有的促进，有的抑制，效果差 别很大。通过筛选获得优良菌株作为小球藻的共生菌，人工构建菌藻共生体系一方面有望 使藻细胞生长速率大幅提高（Park Y,et al.Growth promotion of Chlorella elIipsoidea by co-inoculation with Brevundimonas sp. isolated from the microalga.Hydrobiologia,2008,598(1):219-228;Kim B H,et al.Role of rhizobium,a plant growth promoting bacterium, in enhancing algal biomass through mutualistic interaction.Biomass and Bioenergy ,2014,69(3) :95-105.)，克月良小球藻 生物产量低的技术难题。另一方面，由于小球藻细胞体积小（3-12WI1)，密度低，其细胞表面 带负电荷，在分散状态下十分稳定，难W沉降，运些特点使小球藻采收困难，增加了能耗和 生产成本。目前小球藻采收方法有絮凝法、离屯、法、过滤法和气浮法等，其中离屯、分离是国 内外工厂微藻采收普遍使用的方法，但此法设备投资大，收获成本高，当前小球藻细胞收获 成本大约占生产总成本的1/3,限制了小球藻的工业化应用，寻求低成本、高效率的微藻细 胞采收途径是微藻产业化亟需解决的问题之一化ee J，化O D H，Ramanan R，Kim B H，化H M,Kim H S.Microalgae-associated bacteria play a key role in the flocculation of Chlorella vulgaris.Bioresource Technology,2013,131(2) :195-201.张海阳等：能 源微藻采收技术研究进展。2013，32(9): 2092-2098.)。絮凝沉降法主要是利用化学絮凝剂 的带电性质使藻细胞聚集沉降，具有成本低廉，操作简单，实用性强的优势。但单纯化学絮 凝对小球藻沉降作用可能不理想，而且过高的化学絮凝剂浓度对小球藻产生毒害作用，影 响小球藻后续的工业化应用[左志鹏，等.絮凝沉降法采收小球藻的研究.湖北农业科学， 2015，54(9): 2206-2213.]。生物絮凝剂是微生物自身产生的、具有高效的絮凝作用的天然 高分子物质，主要包括糖、糖脂、蛋白质、DNA等几类物质，生物絮凝剂的作用是多因素作用 的共同结果，主要是通过桥联作用、电性中和、卷扫作用和一些复杂的化学反应对微藻进行 絮凝沉降。与传统的絮凝剂相比，生物絮凝剂易被微生物降解，对环境无毒无害、絮凝效果 明显、适用范围广、絮凝剂的产生菌来源多（施春阳，等.微生物絮凝剂的研究和应用进展
[J].污染防治技术，2013,26(3) :48-51.) eAndrew 等报道将球石藻（Pleurochrysis carterae)与一种微生物共生培养，后者在培养体系的营养组份消耗殆尽时将产生一种具 有絮凝作用的胞外物质，从而使球石藻絮凝，回收率可达90% (Andrew K L，et al.Microbial flocculation，a potentially low-cost harvesting technique for marine microalgae for the production of biodiesel[J]. Journal of Applied Phycology，2009，21 (5): 559-567 .)。微生物共生法与传统离屯、或过滤方法相结合，能实现 能源微藻低成本、高效率、无污染的采收(张海阳等:能源微藻采收技术研究进展。2013,32 (9) :2092-2098.)。因此，人工构建菌藻共生体系中的优良共生菌有可能通过产生生物絮凝 剂类物质改善小球藻细胞的絮凝性能，与化学絮凝剂配合使用应用于藻细胞采收时，减少 化学絮凝剂的使用剂量，在一定程度上减轻化学絮凝剂的毒害作用，并大幅降低藻细胞的 收获成本。
[0004] 开发新型的菌藻共生技术用于小球藻的工业化生产的关键是优良共生菌菌株的 筛选和应用。植物内生菌是能够定殖在健康植物内，并与宿主植物建立和谐共生关系的一 类微生物。水稻植株含有许多内生微生物，是重要的内生细菌资源，其中泛菌属是水稻的常 见内生菌，具有促进植物生长和增加植株干重的作用[S自nchez-Matamoros R C,et 曰I.Structure of the 0-曰ntigen of the Iipopolysscchsride isol曰ted from Psntoes ananatis AEP17,a rhizobacterium associated with rice .Carbohydrate Research, 2013,369:25-30.]，水稻内生泛菌促进宿主水稻的生长的主要机制包括分泌生长素、促进 固氮和溶憐等（RuizaD,et al..Characterization and screening ofplant probiotic traits of bacteria isolated from rice seeds cultivatedin Argentina. The Journal of Microbiology ,2011,49(6) :902-912),由于微藻兼具植物细胞光合作用和微 生物细胞快速生长的特性，理论上对植物具有共生功能的内生菌对微藻细胞也可能发挥类 似的生物学作用，运方面已有少量研究证据表明对植物具有生长促进作用的微生物也能提 高微藻白勺生物量（Kim B H, et al. Role of rhizobium,a plant growth promoting b曰cterium,in enh曰ncing 曰Ig曰I biom曰ss through mutu曰Iistic inter曰ction.Biomsss and Bioenergy，2014,69(3) :95-105.),然而迄今国内外未见应用水稻内生菌与微藻的共 生作用开发小球藻生产新技术的研究。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种利用两轮共培养和絮凝法制备菌藻细胞的方法，通过应用水稻 内生泛菌和小球藻进行菌藻共培养提高藻细胞的生长速率和生物量，同时改善藻细胞絮凝 性能，减少化学絮凝剂的使用和对藻细胞的毒害，提高藻细胞采收效率，降低藻细胞采收成 本，从而大幅降低蛋白核小球的工业生产和开发应用成本。
[0006] -种利用两轮共培养和絮凝法制备菌藻细胞的方法，包括：
[0007] I)将第一次加入的水稻内生泛菌和小球藻在光照下进行第一轮菌藻共培养，培养 结束后，得到第一轮菌藻共培养液；
[000引2)在第一轮菌藻共培养液中再补加第二次加入的水稻内生泛菌，在光照下进行第 二轮菌藻共培养，培养结束后，得到第二轮菌藻共培养液；
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