专利名称：沉积物溶解态反应性磷(drp)二维分布的获取方法
沉积物溶解态反应性磷(DRP) 二维分布的获取方法技术领域
本发明属于环境科学和地球科学领域，涉及对河流、湖泊和海洋沉积物中污染物含量分布的获取方法，特别是涉及一种沉积物溶解态反应性磷(DRP) 二维分布的获取方法。
背景技术：
在水生态系统中，磷是构成初级生产力和食物链最重要的生源要素，同时是水体富营养化的限制性因子。在外源磷输入得到遏制的情况下，沉积物磷污染是造成水体富营养化的主要原因。溶解态反应性磷(Dissolved reactive phosphorus，DRP)是用钼蓝比色法测定得到的磷，绝大部分为磷酸根，还包括少量能在酸性条件下发生水解的有机磷和多聚磷化合物。DRP是沉积物中最具活性的磷，其在沉积物剖面中的含量和分布直接影响着水体的营养状态。获取DRP在沉积物中的含量和空间分布信息，对于研究和评价水体营养状态具有十分重要的意义。
由于分析方法的限制，通常只能得到DRP在沉积物剖面中的一维垂向分布信息。 然而，沉积物性质在横向空间上同样存在着非常大的差异，依据一维DRP数据已不能满足对水体科学研究和评价的需要，迫切需要发展DRP的二维获取技术，同时获取DRP在沉积物剖面中的横向和垂向分布信息。另一方面，常规分辨率(Imm-Icm)的DRP数据不能准确反映DRP在沉积物中的空间变化，迫切需要提高分辨率，在IOOMm-Imm尺度获取DRP的空间分布信息。
当前，获取沉积物中DRP含量分布主要有间隙水扩散平衡(P^per)技术和薄膜扩散梯度(Diffusive gradients in thin films，DGT)技术。其中，薄膜扩散梯度(DGT)技术是一种非破坏性、原位获取沉积物中离子含量分布的新技术。该技术基于Fick第一定律， 通过目标离子的扩散和定量累积，获取目标离子在沉积物中的含量和空间分布信息。DGT 装置主要由固定膜和扩散膜叠加组成(图1)，离子以扩散方式穿过扩散膜，随即被固定膜捕获，并在扩散膜上形成线性梯度分布，扩散膜与固定膜接触一端的离子浓度维持为零，与介质接触一端的浓度为尸―胸上式中#为固定膜上目标离子的积累量Pg, %为扩散层厚度(cm), &为离子在扩散膜中的扩散速率(_78)，嬗为固定膜的面积(cm2) f力扩散时间(s)。即是通过DGT分析得到的沉积物中离子的含量(10Vg/L )。
高分辨获取沉积物中污染物空间分布信息是近年来DGT技术发展的重点之一。要满足DGT的高分辨分析要求(空间分辨率<0. 5mm)，需要使用微粒径的固定剂配置固定膜。 如DGT分析的空间分辨率确定为0. 5mm时，固定剂粒径至少应该<0. 05mm,理论上可以将固定剂粒径过大引起的分析误差控制在10%以内；当固定剂粒径〈0.01mm时，分析误差则可以控制在1以内。考虑到DGT分析过程中还存在其他误差，实际要求的固定膜粒径应远小于理论值。当前常用的固定剂(如Chelex 100)粒径均大于0. 05mm,不能满足DGT的高分辨分析要求。
利用DGT技术已实现对沉积物DRP垂向一维和常规分辨率(>lmm)分布信息的获取，由于分辨率的限制难以在可接受的误差范围内获取DRP二维分布信息；获取DRP二维分布信息还涉及数量众多的微量样品中磷含量的分析，现有测定方法还不具备，因此尚未见该技术对沉积物DRP 二维分布信息的高分辨获取方法的相关报道。本发明通过对二氧化锆磷固定膜(ZL 200910183047. 5)进行改进，结合比色分析技术，发展一种沉积物溶解态反应性磷(DRP) 二维分布的高分辨获取方法。发明内容
本发明的目的在于提供一种利用DGT技术获取沉积物溶解态反应性磷(DRP)二维分布的方法，基于DGT技术原理，采用改进的二氧化锆磷固定膜提取沉积物中的DRP，并对固定膜进行二维、亚毫米切片，微孔板比色分析切片的磷固定量，实现高分辨地获取沉积物溶解态反应性磷(DRP) 二维分布。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现一种沉积物溶解态反应性磷(DRP) 二维分布的获取方法，基于薄膜扩散梯度技术 (DGT)原理，其特征在于，采用改进型^O2聚丙烯酰胺凝胶薄膜为磷固定膜，所述的磷固定膜表面均勻分布粒径< 5Mm的二氧化锆颗粒，将包含磷固定膜的DGT装置垂直放置沉积物中提取沉积物剖面中的DRP，保持上覆水3-5cm ；根据泥印标记沉积物-水界面，取出固定膜，对界面以下部分进行二维、亚毫米切片；在微孔板中用NaOH分别提取各切片中的DRP， 采用微量比色方法测定提取液中DRP含量；将提取液中DRP含量换算成各切片中的DRP固定量，通过Fick第一扩散定律计算得到沉积物剖面中对应位置的DRP浓度，并作出DRP 二维分布图。
所述的改进型磷固定膜采用以下方法制备将含水率为45-55%的二氧化锆粉末和丙烯酰胺溶液按质量体积比1 3 1 6混勻，研磨后超声破碎，静置除去沉淀物后，加入丙烯酰胺溶液体积1/1600 1/1400的四甲基二乙胺(TEMED)和1/40 1/60的10% (wt) 过硫酸铵溶液，混合均勻后将混合液注入玻璃模具中，低于室温下水平放置，待锆粉自由沉降后，升温至40 60°C，直至混合液形成凝胶膜，在去离子水中浸泡12小时以上，得到改进的磷固定膜。
本发明方法通过研磨、超声破碎等措施，制得表面二氧化锆颗粒粒径< 5ΜΠ1的改进型磷固定膜(图2b)，提高了 DGT技术的分辨率，适用于DRP 二维分布的获取。
将改进型磷固定膜组装成的DGT装置分别在磷溶液和混勻沉积物中放置不同时间后，测定固定膜上单位面积磷积累量及其分析误差(图3)。从图3可看出，当单位面积磷积累量在1. 2μδ cm_2和4. 4μδ cm_2时，分析误差可分别控制在20%和10%。一般要求分析误差控制在20%以内(即固定膜上单位面积磷积累量大于1. 2μδ cm_2)，根据沉积物中DRP的浓度范围(一般为0. I-IOmg L—1)，利用Cjoer公式可推算DGT装置在沉积物中的放置时间控制在3-6天即可满足要求。
磷固定膜提取沉积物剖面中的DRP后，进行二维、亚毫米切片，DRP的分析采用钼蓝比色法。固定膜切片中磷固定量的分析采用微量比色的方法测定，利用微孔板提取切片中的DRP和显色，并采用微孔板分光光度计进行比色分析。
所述的技术方案具体包括如下步骤(1)改进型磷固定膜制备将含水率为45-55%的二氧化锆粉末和丙烯酰胺溶液按质量体积比1:3 1:6混勻，研磨后超声破碎，静置除去沉淀物后，加入丙烯酰胺溶液体积 1/1600 1/1400的四甲基二乙胺(TEMED)和1/40 1/60的10% (wt)过硫酸铵溶液，混合均勻后将混合液注入玻璃模具中，低于室温下水平放置，待锆粉自由沉降后，升温至40 60°C，直至混合液形成凝胶膜，在去离子水中浸泡12小时以上，得到改进型磷固定膜。
(2)DGT装置组装将改进型磷固定膜、扩散膜、硝酸纤维素膜依次叠加后组装DGT直ο
(3)充氮将DGT装置放入盛有去离子水的容器中，向水中充入纯氮气去除DGT装置中含有的氧。
(4)DGT装置放置将DGT装置垂直插入沉积物中，保留3-5cm暴露于上覆水中，放置3-6天后，取出磷固定膜并标记沉积物-上覆水界面。
(5) 二维切片将固定膜固定后，对固定膜沉积物-上覆水界面以下部分，用切片刀按相互垂直的两个方向分别进行切片，两次切片产生一定数量、面积相同的方块，方块尺寸小于 1. OmmXl. 0_。
(6) DRP提取切片后将所有方块依次挑入16联排的微孔中，每微孔1个方块，然后向每个微孔加入40μ 1 M NaOH解吸液，将所有16联排微孔放入384微孔板上，充氮气密封后静置16小时。
(7) DRP比色分析从步骤(5)的每个微孔中吸取Μμ L解吸液至新的16联排微孔中，依次加入6 UL 2 M压504和3 μ L的钼锑抗显色液后，将16联排微孔放入384微孔板上，微孔板放入离心机中离心除去气泡后，再35°C恒温显色lh，然后通过微孔板分光光度计在700nm波长下读取每个微孔的吸光值，扣除该微孔的空白吸光值后得到每个微孔中解吸液的吸光度。
(8)数据处理根据标准曲线将解吸液的吸光度换算成解吸液中DRP的浓度，根据下面公式将浓度换算成每个方块中DRP的固定量M = Cx 40x10^上式中，C为每个微孔解吸液中DRP的浓度，单位为Pg/L ；M为每个方块中DRP的固定量，单位为^g;再根据Fick第一定律将该固定量换算成对应沉积物中DRP的含量Cflsr = ^xlO5上式中，Ag扩散膜厚度，单位为cm; 为磷酸根离子在扩散膜中的扩散系数，单位为cm2/s为方块的面积，单位为cm f力放置时间，单位为秒，Ciffir为DRP浓度，单位为Pg/ L0
最后，根据每个方块在沉积物剖面中的位置，作出iW的二维分布图。
本发明方法对二氧化锆磷固定膜进行改进以提高其分辨率，利用改进型磷固定膜4/6页获取沉积物中的DRP，然后利用二维切片、碱提取和384微孔板微量比色等技术，获得DRP的二维分布信息。本发明至少包括以下优点(1)发展了适用于高分辨DGT分析的改进型磷固定膜。与已有磷固定膜(ZL 200910183047. 5)相比，本发明所制备的改进型磷固定膜的突出优点是通过研磨和超声破碎等措施，将二氧化锆固定剂的粒径从30Mm左右降低到5Mm以内，使得二氧化锆颗粒在固定膜表面分布均勻致密，能够满足DGT技术对沉积物磷的高分辨分析的要求。
(2)能够获取DRP的二维空间分布信息。现有技术中对沉积物中DRP空间分布信息的获取局限在一维垂直方向，本发明能够获取DRP的二维空间分布信息，同时反映DRP在沉积物横向和垂向空间上的变化。
(3)获得DRP空间信息的分辨率高。本发明对切片进行亚毫米切割，并对切片固定的DRP进行微量比色分析，将空间分辨率提高到亚毫米级，所得到的精细的DRP 二维数据能够非常准确的反映DRP在沉积物中的空间变化。
(4)对仪器设备的要求低，有利于推广应用。本发明方法只需增加一台微孔板分光光度计(价格10万以内)，在一般实验室均可配置，所需其他仪器设备均为实验室DGT技术的常规配置，因此本发明方法在一般实验室均可实现，有利于推广应用。
下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。本发明的保护范围并不以具体实施方式
为限，而是由权利要求加以限定。
图1是DGT装置组成示意图。
图加和图2b是ZL 200910183047. 5中披露的磷固定膜(a)与本发明的改进型磷固定膜(b)的电镜扫描图像。通过两者对比可以看出，改进型磷固定膜表面二氧化锆颗粒分布均勻致密，粒径< 5Mm，而改进前磷固定膜表面粗糙，粒径在30Mm左右。
图3是DGT装置在磷溶液和混勻沉积物中分别放置不同时间后，利用本发明方法获得的固定膜上单位面积磷积累量及其分析误差。由图可看出，当单位面积磷积累量在 1. 2μδ cm_2和4. 4μδ cm_2时，分析误差可分别控制在20%和10%。
图4是利用本方法获得的太湖沉积物界面(深度为0处)至界面以下3cm区域DRP 含量的二维分布，空间分辨率为0. 45mmX0. 45mm。其中，左边为空白对照，右边为水丝蚓扰动作用下DRP的二维分布。由图可看出，水丝蚓扰动造成界面至界面以下9mm处，以及界面以下20mm至底部的DRP浓度明显低于对照。
具体实施方式
按照本发明方法获取太湖沉积物中溶解态反应性磷(DRP)的二维分布数据。
从太湖大浦口(31° 18' 42.7〃 N，119° 56' 52.2〃 E)采回沉积物柱样2个， 运回实验室内后，按2cm每层对沉积物进行分层，将每层沉积物充分混勻，通过100目筛子去除底栖动物后，按原有顺序重新将沉积物装柱，表面覆盖湖水，放在室内培养。半个月后， 向其中一个样品柱中放入水丝蚓20只，继续培养一个月后，将两个DGT装置分别插入两个7样品柱中，6天后取出分析，获取界面至界面以下3cm区域DRP含量的二维分布信息，并做出 DRP 二维分布图。
获取太湖沉积物中DRP的二维分布的方法具体包括以下步骤(1)改进型磷固定膜制备将含水率为45-55%的二氧化锆粉末和丙烯酰胺溶液(由 28. 5%丙烯酰胺和1.5%甲基丙烯酰胺组成)按质量体积比(g:mL) 1:4混勻，用玛瑙研钵研磨10分钟，再用细胞破碎仪20%频率超声8分钟，静置10分钟，除去沉淀物后，按已加入丙烯酰胺溶液体积的1/1600 1/1400和1/40 1/60分别向混合液中加入四甲基二乙胺 (TEMED)和质量百分浓度10%的过硫酸铵溶液，混合均勻后将混合液缓慢注入夹有U形塑料薄片的两片玻璃板空隙中，将气泡赶尽后，玻璃板在10°C水平放置半小时，待锆粉自由沉降后，升温至45°C，放置约1小时，至混合液形成凝胶薄膜，将成膜后的玻璃板放入去离子水中浸泡12小时以上，然后撬开玻璃板，得到改进型磷固定膜。
改进型磷固定膜表面二氧化锆颗粒分布均勻致密，粒径。改进前后的磷固定膜其电镜扫描图像见图加和图2b。
(2) DGT装置组装将DGT装置底板平放于干净操作台上，将步骤(1)制得的改进型磷固定膜、扩散膜、硝酸纤维素膜依次叠加在DGT装置底板上，赶出气泡后，盖上DGT装置的盖板，即组装成DGT装置。
(3)充氮将DGT装置放入盛有去离子水的容器中，向水中充入纯氮气12小时，以除去DGT装置中含有的氧。
(4) DGT装置放置将DGT装置缓慢垂直插入沉积物中，保留3-5cm暴露于上覆水中。放置3-6天后，取出装置，根据泥印标记沉积物-上覆水界面，然后沿DGT装置盖板边缘划开三层膜，用镊子取出磷固定膜。
(5) 二维切片用双面胶将磷固定膜固定在干净平整的塑料板上，对固定膜沉积物-水界面以下部分，用切片刀先按一个方向进行切片，清洗刀片后再按该方向的垂直方向进行切片，切片宽度均为0. 45mm，两次切片后产生一定数量形状相同、面积 0. 45mm X0. 45mm 的方块。
(6) DRP提取在二维切片后的磷固定膜表面盖上湿滤纸，放置5min，使得双面胶失去粘附力，揭开滤纸，将所有方块依次挑入16联排的微孔中，每微孔1个方块，然后向每个微孔加入40μ 1 M NaOH解吸液，将所有16联排微孔放入384微孔板上，充氮气密封后静置16小时。
(7)DRP比色分析从步骤(6)的每个微孔中吸取Μμ L解吸液至新的16联排微孔中，依次加入6 μ L 2 M H2SO4和3 μ L显色液后，将所有16联排微孔放入384微孔板上， 微孔板放入离心机中，2000 rpm离心5min除去气泡后，再放入恒温箱中，35°C恒温Ih显色， 然后通过微孔板分光光度计在700nm波长下读取每个微孔的吸光值，扣除该微孔的空白吸光值后得到每个微孔中解吸液的吸光度。
(8)数据处理根据标准曲线将解吸液的吸光度换算成解吸液中DRP的浓度，根据下面公式将浓度换算成每个磷固定膜方块中DRP的固定量上式中，C为每个微孔解吸液中DRP的浓度，单位为Pg/L ；M为每个方块中DRP的固定量，单位为^g;再根据Fick第一定律将该固定量换算成对应沉积物中DRP的含量Cflsr = -^xlO5上式中，％为扩散膜厚度(一般为0. 093cm) 为磷酸根离子在扩散膜中的扩散系数，单位为cm7s 为方块的面积，单位为cm2 为放置时间，单位为秒，Cj0ct为DRP浓度， 单位为Pg/L。
最后，根据每个方块在沉积物剖面中的位置，用Origin软件作出Cflffir的二维分布图。
沉积物中DRP的含量分布如图4所示，颜色的深浅代表DRP浓度的高低。对比两个样品的DRP含量分布图可看出，在界面至界面以下9mm处，以及界面以下20mm至底部的部分区域，生物扰动处理的DRP浓度明显低于对照，说明生物扰动对DRP在沉积物中的分布产生了较为明显的影响。
权利要求
1.一种沉积物溶解态反应性磷(DRP) 二维分布的获取方法，基于薄膜扩散梯度技术原理，其特征在于，采用改进型聚丙烯酰胺凝胶薄膜为磷固定膜，所述的磷固定膜表面均勻分布粒径< 5Mm的二氧化锆颗粒，将包含改进型磷固定膜的DGT装置垂直放置在沉积物中提取沉积物剖面中的DRP，保持上覆水3-5cm ；根据泥印标记沉积物-水界面，取出固定膜，对界面以下部分进行二维、亚毫米切片；在微孔板中用NaOH分别提取各切片中的DRP， 采用微量比色方法测定提取液中DRP含量；将提取液中DRP含量换算成各切片中的DRP固定量，通过Fick第一扩散定律计算得到沉积物剖面中对应位置的DRP浓度，并作出DRP 二维分布图。
2.根据权利要求1所述的沉积物溶解态反应性磷(DRP)二维分布的获取方法，其特征在于，所述的改进型磷固定膜采用以下方法制备将含水率为45-55%的二氧化锆粉末和丙烯酰胺溶液按质量体积比1:3 1:6混勻，研磨后超声破碎，静置除去沉淀物后，加入丙烯酰胺溶液体积1/1600 1/1400的四甲基二乙胺和l/4(Tl/60的10% (wt)过硫酸铵溶液，混合均勻后将混合液注入玻璃模具中，低于室温下水平放置，待锆粉自由沉降后，升温至40 60°C，直至混合液形成凝胶膜，在去离子水中浸泡12小时以上，得到改进的磷固定膜。
3.根据权利要求1所述的沉积物溶解态反应性磷(DRP)二维分布的获取方法，其特征在于，DGT装置在沉积物中的放置时间为3-6天。
4.根据权利要求1所述的沉积物溶解态反应性磷(DRP)二维分布的获取方法，其特征在于，提取液中DRP含量的测定采用钼蓝比色法，微量比色方法采用微孔板分光光度计进行比色分析。
5.根据权利要求1所述的沉积物溶解态反应性磷(DRP)二维分布的获取方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤(1)改进型磷固定膜制备将含水率为45-55%的二氧化锆粉末和丙烯酰胺溶液按质量体积比1:3 1:6混勻，研磨后超声破碎，静置除去沉淀物后，加入丙烯酰胺溶液体积的 1/1600 1/1400的四甲基二乙胺和l/4(Tl/60的10% (wt)的过硫酸铵溶液，混合均勻后将混合液注入玻璃模具中，低于室温下水平放置，待锆粉自由沉降后，升温至40 60°C，直至混合液形成凝胶膜，在去离子水中浸泡12小时以上，得到改进型磷固定膜；(2)DGT装置组装将改进型磷固定膜、扩散膜、硝酸纤维素膜依次叠加后组装成DGT装置；(3)充氮将DGT装置放入盛有去离子水的容器中，向水中充入纯氮气去除DGT装置中含有的氧；(4)DGT装置放置将DGT装置垂直插入沉积物中，保留3-5cm暴露于上覆水中，放置 3-6天后，取出磷固定膜并标记沉积物-上覆水界面；(5)二维切片将固定膜固定后，对固定膜沉积物-水界面以下部分，用切片刀按相互垂直的两个方向分别进行切片，两次切片产生一定数量、面积相同的方块，方块尺寸小于 1. OmmX 1. Omm ；(6)DRP提取切片后将所有方块依次挑入16联排的微孔中，每微孔1个方块，然后向每个微孔加入40μ 1 M NaOH解吸液，将所有16联排微孔放入384微孔板上，充氮气密封后静置16小时；(7)DRP比色分析从步骤(5)的每个微孔中吸取MyL解吸液至新的16联排微孔中， 依次加入6 μ L 2 M H2SO4和3 μ L的显色液后，将显色后的16联排微孔放入384微孔板上，微孔板放入离心机中离心除去气泡后，再35°C恒温显色lh，然后通过微孔板分光光度计在700nm波长下读取每个微孔的吸光值，扣除该微孔的空白吸光值后得到每个微孔中解吸液的吸光度；(8)数据处理根据标准曲线将解吸液的吸光度换算成解吸液中DRP的浓度，根据下面公式将浓度换算成每个方块中DRP的固定量M-Cx 40 XlO^5上式中，C为每个微孔解吸液中DRP的浓度，单位为Pg/L ；M为每个方块中DRP的固定量，单位为^g;再根据Fick第一定律将该固定量换算成对应沉积物中DRP的含量Czisr = ^xlO3 ￥上式中，Ag为扩散膜厚度，单位为cm ； Bg为磷酸根离子在扩散膜中的扩散系数，单位为cm2/S !为方块的面积，单位为cm2 ；ι为放置时间，单位为秒，Cflffr为DRP浓度，单位为 ^g/L ；最后，根据每个方块在沉积物剖面中的位置，作出C脑的二维分布图。
全文摘要
一种沉积物溶解态反应性磷(DRP)二维分布的获取方法，基于薄膜扩散梯度技术(DGT)原理，采用二氧化锆粒径≤5μm的改进型ZrO2聚丙烯酰胺凝胶薄膜为磷固定膜，将包含改进型磷固定膜的DGT装置垂直放置沉积物中提取沉积物剖面中的DRP，保持上覆水3-5cm；标记沉积物-水界面后取出固定膜，对界面以下部分进行二维、亚毫米切片；用NaOH提取各切片中的DRP，采用微量比色方法测定提取液中DRP含量，换算成各切片中的DRP固定量，通过Fick第一扩散定律计算得到沉积物剖面中对应位置的DRP浓度，并作出二维分布图。
文档编号G01N21/31GK102507471SQ20111032355
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月23日 优先权日2011年10月23日
发明者丁士明, 孙琴, 许笛, 贾飞 申请人:中国科学院南京地理与湖泊研究所