专利名称：一种快速分离测定水体中尼古丁的方法
技术领域：
本发明涉及一种快速分离测定水体中尼古丁的方法。
背景技术：
打击制假造假窝点是烟草打假的工作重点。但是随着制售假烟网络化、专业化程度的提高，制假窝点的隐蔽性越来越强，导致烟草打假普遍存在调查取证困难的问题。尼古丁是烟草特有的生物碱，其含量不仅是评价烟叶质量和香烟品质的一个重要指标，也可作为嫌疑点是否存在烟草制品生产的一种判断的依据。从嫌疑点取得的水体，通过一定的方法进行检测，如存在着一定量的尼古丁，可初步推测该嫌疑点可能存在烟草制品生产。为了测定尼古丁，国内外的研究人员做了大量的工作，S. A Al-Tamrah等建立了分光光度法测定烟草中尼古丁的含量，赵立红等通过连续流动分析法测定烟草中尼古丁的含量，许燕娟等用毛细管气相色谱法测定烟草中的烟碱、降烟碱、麦斯明、二烯烟碱、新烟碱、去氢新烟碱、2，3'-联二吡啶、可替宁8种主要生物碱。但是，分光光度法和流动注射光度法缺乏选择性；气相色谱法基体干扰大、灵敏度低；气质方法具有较好的选择性，但是对于复杂的基质，具有相同质荷比的离子碎片出现的几率较高，为了获得较好的选择性，往往也需要达到较好的色谱基线分离。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是烟草制假窝点隐蔽性强、打假普遍存在调查取证困难的问题，提供了一种快速分离测定水体中尼古丁的方法。该方法确证性高，检出限低，前处理简便、快捷。为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案一种快速分离测定水体中尼古丁的方法，该方法包括了样品的前处理、色谱分离和质谱检测，其特征在于样品经离心过滤后，先采用液相色谱柱分离，再进行甲醇-水体系洗脱，最后通过电喷雾串联三重四级杆质谱监测尼古丁可能出现的碎片。进一步，样品经离心过滤的具体步骤是样品离心后取清液通过混纤微孔过滤膜过滤。进一步，液相色谱柱分离所采用的色谱柱为反相C18色谱柱；甲醇-水体系洗脱所用的甲醇-水体系，体积比为95 5;洗脱程序为等度洗脱；流速400ul/min;柱温30°C;进样量10 u I o进一步，通过电喷雾串联三重四级杆质谱监测尼古丁可能出现的碎片的具体步骤是采用ESI源，正离子化模式，气帘气压力设置为0. 17MPa，雾化气0. 55MPa，碰撞气0.04Mpa，离子源温度为550°C，离子化电流设为3iiA，多反应监测(MRM)监测质核比m/z130.1。进一步，该快速分离测定水体中尼古丁的方法可运用于烟草打假的调查取证工作。
本发明的有益之处在于液相色谱-电喷雾串联三重四级杆质谱(LC-ES1-MS/MS)是近年来发展起来的一种联用方法。其电喷雾离子化技术是一种较温和的电离方式，可以在不破坏分子结构的基础上获得待测物质的相关信息(如分子量)。加以适当的碰撞能量，线性离子阱质谱可以在二级或多级质谱水平上获得离子碎片信息，在很大程度上排除了色谱共流出物和在一级质谱中具有相同质荷比物质的干扰。因此，用液相色谱质谱联用来进行测定尼古丁的含量具有选择性好、灵敏度高等特点。上述技术方案的意义在于I、从技术学角度，提供了一种烟草打假的调查取证手段；2、采用烟草特有的尼古丁作为判断依据，确证性高；3、采用液相色谱质谱联用法进行检测，检出限低、前处理简便、快捷。
图1空白样品加标的总离子流图；图2尼古丁 MS/MS谱图及可能出现的离子碎片；图3尼古丁标准工作曲线。
具体实施例方式从嫌疑点取得的水体，经离心过滤后，先采用液相色谱柱分离，再进行甲醇-水体系洗脱，最后通过电喷雾串联三重四级杆质谱监测尼古丁可能出现的碎片。具体步骤如下(I)样品采集从嫌疑点取得的有代表性的水体，密封待测；(2)样品处理将上述样品摇勻，取IOmL离心(7800r/min) 15min,后取清液通过混纤微孔过滤膜过滤，弃去最初的5mL，保留ImL样品进样检测；(3)色谱分离离心过滤后的样品先采用液相色谱柱分离，分离所采用的色谱柱为反相C18色谱柱；再进行甲醇-水体系洗脱。色谱柱Phenomenex Luna 5uC18(150X4. 6mm, 5um);流动相甲醇-水(95 5, V V)等度洗脱；流速 400ul/min ;柱温30°C ;进样量lOiil。(4)质谱检测采用ESI源电离，正离子化模式，气帘气压力设置为0. 17MPa，雾化气0. 55MPa，碰撞气0. 04Mpa,离子源温度为550°C，离子化电流设为3 y A，多反应监测(MRM)监测质核比m/z 130.1。为了探索用液相色谱质谱联用法测定水体中尼古丁的含量，进行了大量的实验，具体如下I实验部分1.1仪器、材料与试剂美国AB SCIEX 5500电喷雾串联三重四级杆质谱；美国Agilent 1290超高效液相色谱仪；美国Millipore超纯水仪；高速冷冻离心机(德国SIGMA，配25mL离心管)；() 2 y m混纤微孔过滤膜；尼古丁(> 99.5%，sigma);甲醇(色谱纯，百灵威化学试剂公司)。1. 2仪器条件
1.2.1色谱方法色谱柱PhenomenexLuna 5u C18 (150 X 4. 6mm, 5um);流动相甲醇-水(95 : 5，V : V)等度洗脱 r iOS400ul/min ;柱温 30°C ;进样量 IOy I。1. 2.1质谱方法质谱检测采用ESI源，正离子化模式，气帘气压力设置为0. 17MPa，雾化气0. 55MPa，碰撞气0. 04Mpa，离子源温度为550°C，离子化电流设为3iiA。多反应监测(MRM)监测质核比m/z 130.1。1. 3样品处理从嫌疑企业排污口取得有代表性的废水样品，摇匀，取IOmL离心(7800r/min) 15min,后取清液通过混纤微孔过滤膜过滤,弃去最初的5mL,保留ImL样品进样检测。 2结果与讨论2.1流动相的选择参考相关文献，分别对甲醇-水(95 5，V/V)等度洗脱，乙腈-磷酸盐(1+9)缓冲溶液(pH = 3，含0. 02mmol/L庚烷磺酸钠)等度洗脱和乙腈-0. 5%醋酸钠水溶液梯度洗脱进行了比较，结果发现后两种流动相都不能很好地分离尼古丁和样品中的其他成分，而在甲醇水(95 5，V/V)等度洗脱下，尼古丁与其他成分的分离效果很好，且峰形尖锐。所以本实验采用甲醇-水(95 5，V/V)作为流动相，在这一条件下的空白样品加标的总离子流图如图1所示。2. 2质谱条件的确定本实验用注射泵直接进样得到尼古丁的二级质谱图(图2)。尼古丁的吡咯环、批啶环断裂形成碎片m/z 84.0和80. O。由于吡咯环胺的丢失能够形成带有共轭双键体系的碎片，这种碎片结构比较稳定，加之胺比较容易从分子丢失，所以，碎片m/z 130. 1、132. 0和106. 2的相对丰度较大。同时随着能量的增加，还会出现m/z 117.0等碎片。本实验选取相对丰度较大的特征子离子m/z 130.1作为检测对象。2. 3线性范围及检出限用尼古丁标准溶液分别配制0. 80,4. 00,8. 00,20. 00,40. 00,80. 00ug/l的标准系列，在设定色谱条件下进行分析。以标准系列峰面积对其质量浓度进行线性回归，计算线性回归方程、线性范围，以3倍信噪比计算检出限，如图3所示。结果发现，在0. 50 50. Oug/I范围线性良好，相关系数为0. 9995，检出限为0. 05ug/l。2. 4准确度和精密度实验准确移取IOml样品，添加3个不同质量水平(分别为低于、约等于、高于真实含量)的尼古丁标准溶液，按上述样品处理方法和色谱条件进行实验，计算尼古丁添加回收率以及测定结果的相对标准偏差，结果如表I所示加标回收率为96. 03% 97. 90%,相对标准偏差小于0. 80% (n = 5)表I样品回收率Table I Recovery experiment
权利要求
1.ー种快速分离测定水体中尼古丁的方法，该方法包括了样品的前处理、色谱分离和质谱检测，其特征在于样品经离心过滤后，先采用液相色谱柱分离，再进行甲醇-水体系洗脱，最后通过电喷雾串联三重四级杆质谱监测尼古丁可能出现的碎片。
2.如权利要求I所述的ー种快速分离测定水体中尼古丁的方法，其特征在于样品经离心过滤的具体步骤是样品离心后取清液通过混纤微孔过滤膜过滤。
3.如权利要求I或2所述的ー种快速分离测定水体中尼古丁的方法，其特征在于液相色谱柱分离所采用的色谱柱为反相C18色谱柱；甲醇-水体系洗脱所用的甲醇-水体系，体积比为95 5 ;洗脱程序为等度洗脱；流速400ul/min ;柱温30°C ;进样量10 μ I。
4.如权利要求I或2所述的ー种快速分离测定水体中尼古丁的方法，其特征在于通过电喷雾串联三重四级杆质谱监测尼古丁可能出现的碎片的具体步骤是采用ESI源，正离子化模式，气帘气压カ设置为O. 17MPa，雾化气O. 55MPa，碰撞气O. 04Mpa,离子源温度为550°C，离子化电流设为3μΑ，多反应监测(MRM)监测质核比m/z 130.1。
5.如权利要求3所述的ー种快速分离测定水体中尼古丁的方法，其特征在于通过电喷雾串联三重四级杆质谱监测尼古丁可能出现的碎片的具体步骤是采用ESI源，正离子化模式，气帘气压カ设置为O. 17MPa，雾化气O. 55MPa，碰撞气O. 04Mpa,离子源温度为550°C，离子化电流设为3μΑ，多反应监测(MRM)监测质核比m/z 130.1。
6.如权利要求I或2所述的ー种快速分离测定水体中尼古丁的方法，其特征在于该方法可运用于烟草打假的调查取证工作。
7.如权利要求3所述的ー种快速分离测定水体中尼古丁的方法，其特征在于该方法可运用于烟草打假的调查取证工作。
8.如权利要求4所述的ー种快速分离测定水体中尼古丁的方法，其特征在于该方法可运用于烟草打假的调查取证工作。
9.如权利要求5所述的ー种快速分离测定水体中尼古丁的方法，其特征在于该方法可运用于烟草打假的调查取证工作。
全文摘要
本发明提供了一种快速分离测定水体中尼古丁的方法。样品经离心过滤，采用液相色谱柱分离，甲醇-水体系洗脱，电喷雾串联三重四级杆质谱监测尼古丁可能出现的碎片，在6min内快速分离测定水体中尼古丁。该方法检出限低、准确率高、操作简便、快捷，非常适合烟草打假的调查取证工作，具有广泛的应用和推广价值。
文档编号G01N30/88GK102980964SQ20121000223
公开日2013年3月20日 申请日期2012年1月5日 优先权日2012年1月5日
发明者张建平, 邓其馨, 黄朝章, 谢卫, 许寒春, 赵艺强, 吴清辉, 苏明亮, 白雪平, 蔡国华, 陈哲峰 申请人:福建中烟工业有限责任公司, 厦门烟草工业有限责任公司