专利名称：一种定向发射荧光成像检测装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种荧光成像检测装置，尤其是涉及一种棱镜型表面等离子体耦合定向发射荧光成像检测装置。
背景技术：
由于荧光分析技术在免疫分析、基因表达、药物筛选、生物传感、细胞成像等生命科学领域的应用日益增加，因此新型荧光技术及仪器的研究具有重大的意义和广阔的发展前景。表面等离子体耦合定向发射荧光法(Surface Plasmon Coupled Directional Emission, SP⑶Ε)是近来所提出的新型荧光分析方法，其原理为在光滑的纳米金属表面 200nm范围内，激发态的荧光团与纳米金属表面自由电子产生的表面等离子体子耦合作用后，以荧光发射波长对应的SPCDE角(即esrcDE)进入棱镜基体辐射。作为一种新型荧光技术，SPCDE除具有提高荧光强度、量子产率和光稳定性等金属表面荧光所具备的优点外，还展现出高度的角度定向发射、荧光发射P偏振、波长可分辨性以及有效的背景信号抑制等独特的优点。
根据激发方式的不同，SP⑶E可分为Kretschmarm模式(KR模式，如图1所示)与反Kretschmarm模式(RK模式，如图2所示)。在KR模式中，激发光源1通过棱镜2以表面等离子体共振角θ SPK入射到金属膜3表面，引发表面等离子体，产生瞬逝场，从而激发瞬逝场深度内(约金属表面几百纳米左右)的荧光团样品膜4，激发态的荧光团与金属表面的等离子体发生近场作用后，以一定的角度定向辐射。而在RK模式中，激发光源1直接照射到荧光团样品膜4，激发表面的荧光团。近表面的激发态荧光分子和金属3表面的等离子体发生近场作用，从而通过棱镜2定向辐射。其中，以物镜替换棱镜，也可实现上述两种模式的SP⑶E检测。近来，有相关文献报道物镜型SP⑶E成像技术研究。该类工作是在商品化或自制的全内反射显微镜装置上，通过蒸镀或溉射金属层的载玻片实现。上述基于物镜型的SPCDE成像系统，主要有以下不足之处1、装置价格昂贵或结构复杂。商品化的全内反射显微镜价格极其昂贵，在自制的装置中，需要使用高数值孔径的物镜或者是代替物镜的抛物面状元件，其中，高数值孔径的物镜价格不菲，而代替物镜的抛物面状元件采用注塑法制备，模具设计与加工困难且精密度要求高，并且不同发射波长的染料对应不同形状结构的模具，制备及操作上相当复杂。2、基于物镜型的成像系统，通过物镜收集发射信号，所得到的光斑面积小，只能对待检测样品的较小区域成像，无法对感兴趣区域实现快速定位。3、物镜型成像系统基本采用KR模式，由于瞬逝场激发作用的参与增强了激发荧光团的能量，强激发容易造成荧光团漂白或样品的损伤。此外，采用KR模式时，只有以表面等离子体共振角入射的激发光才能引发表面等离子体产生瞬逝场，因此需调整入射光的角度；同时，激发光及其反射光与发射光的角度差较小，需要采用高性能的滤光片去除激发光或其反射光的干扰。因此基于物镜型的SPCDE成像装置在普通实验室中较难以实现和推广，限制了该成像技术的推广与应用。
中国专利CN101949847A公开一种无透镜荧光成像检测装置，由左右激发光源、加热板、微芯片、滤光片、CCD芯片和其外围驱动电路组成。无透镜荧光成像检测装置充分利用CCD芯片象素小、集成度高的特点，通过减少CCD芯片与反应物质的距离，建立了微芯片中检测单元与CCD芯片各象素的对应关系，不经透镜即可直接成像，大大减少了检测装置的体积和复杂程度。发明内容
本发明的目的旨在克服上述现有的检测装置的不足，提供一种结构简单、成本低廉、操作简便、常规实验室容易实现的定向发射荧光成像检测装置。
本发明设有激光扩束系统、样品系统和检测系统；
所述激光扩束系统设有激光光源、显微物镜、针孔、平凸透镜、衰减器和矩形光栏; 所述激光光源发出的激发光依次经显微物镜、针孔和平凸透镜扩束准直后，成为平行光束， 所述平行光束依次通过衰减器和矩形光栏，得到矩形光斑；
所述样品系统设有旋转台、样品架、棱镜和光学石英基底，所述棱镜置于样品架上并固定在旋转台中心，所述光学石英基底表面设有纳米级金属薄膜，所述纳米级金属薄膜表面设有荧光传感膜；所述光学石英基底与棱镜之间涂有光学常数与两者匹配的溶液；
所述检测系统设有CCD旋转臂、CCD接收器和滤光片，所述CCD旋转臂固定在旋转台台面，CCD旋转臂可随旋转台台面360度自由旋转，CCD旋转臂连接在旋转台台面，用于采集图像的CCD接收器和滤光片设在CCD旋转臂上。
所述激光光源可采用固定激光器，所述固体激光器可采用波长为405nm、473nm、 532nm、593. 5nm、808nm、980nm、1064nm或1342nm等的固体激光器，所述固体激光器的功率可为 50 500mw/cm2。
所述针孔的直径可为0. 015 0. 025mm。
所述矩形光栏可由菲林图案组成，所述矩形光栏的大小可为(5 15)mmX (5 15)mm。
所述荧光传感膜可采用罗丹明B荧光传感膜(IihB-PVA膜)等。
所述棱镜可采用等腰直角三角棱镜。
所述光学常数与两者匹配的溶液可采用甘油等。
所述C⑶旋转臂可通过螺丝等紧固部件固定在旋转台台面上。
所述空间滤波器含有05 40) X倍物镜。
所述CCD接收器可固定在CCD旋转臂末端，而旋转臂与旋转台台面连接部分为中空部分。因此，样品架通过此中空部位时，处于旋转台的正中心，且可独立固定于光学平台上，不随旋转台一起转动。
本发明所述样品包括等腰直角三角棱镜、样品膜，其中样品膜包括纳米级的金属薄膜和荧光传感膜。棱镜固定在样品架上，纳米级金属薄膜附于光学石英基底，光学石英基底附于棱镜上面，中间涂有折射率油层；荧光传感膜附于纳米级金属薄膜表面。
激发光源经空间滤波器扩束和平凸透镜准直后，成为光强分布均勻的平行光束， 经过矩形光栏后，光斑由圆形变成矩形。其中，采用菲林图案作为矩形光栏，可根据实际需要，改变矩形窗口大小，制作简便且成本低廉。矩形光斑直接照射在棱镜表面的样品膜上， 在棱镜另一侧产生定向发射。通过旋转台调整CCD检测器的检测角度，采集不同角度下的荧光发射信号，并以图像格式存储。将采集到的图像通过软件处理，获取各个角度下对应的荧光信号强度，实现数据分析。
与现有的表面等离子体耦合定向发射荧光成像的检测装置对比，本发明具有以下优点可对待测样品的较大区域实现同时的成像检测，有效避免由于样品局部不均勻等造成的影响，同时也可在同等条件下获取样品不同区域的相关信息，对待测样品感兴趣区域实现快速定位；采用棱镜作为耦合元件，代替价格昂贵的高数值孔径物镜或制作复杂的抛物面元件，不仅容易加工，价格便宜，而且可适用于不同发射波长染料的检测。另外，本发明结构简单，成本低廉，易于在普通实验室中实现和推广。
图1为现有的表面等离子体耦合定向发射荧光的Kretschmarm(KR)模式示意图。
图2为现有的表面等离子体耦合定向发射荧光的Kretschmarm(RK)模式示意图。
图3为本发明实施例的结构组成示意图。
图4为本发明实施例CCD旋转臂的结构组成示意图。
图5为本发明实施例在不同偏振发射条件下所采集的荧光成像数据。在图5中， 实验条件为以荧光染料微阵列为检测样品，在最强荧光发射角度，即检测角度为58°时； 图像21为在未加偏振器所采集到的荧光成像数据，图像22为完全水平偏振所采集到的荧光成像数据，图像23为完全垂直偏振所采集到的荧光成像数据。
图6为在激发波长为532nm，发射波长为580nm状态下的荧光强度角分布极坐标图。在图6中，极坐标为荧光检测角度(° )，纵坐标为相对荧光强度Fluorescence Intensity ；图中Exc.表示激发波长(532nm)；检测角度θ F为58°。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
如图3所示，本发明实施例设有激光扩束系统、样品系统和检测系统。
所述激光扩束系统设有激光光源5、显微物镜6、针孔7、平凸透镜8、衰减器9和矩形光栏10 ；所述激光光源5发出的激发光依次经显微物镜6、针孔7和平凸透镜8扩束准直后，成为平行光束，所述平行光束依次通过衰减器9和矩形光栏10，得到矩形光斑。
所述样品系统设有旋转台11、样品架、棱镜12和光学石英基底，所述棱镜12置于样品架上并固定在旋转台11中心，所述光学石英基底表面设有纳米级金属薄膜13，所述纳米级金属薄膜13表面设有荧光传感膜14 ；所述光学石英基底与棱镜12之间涂有光学常数与两者匹配的溶液(如甘油)。
所述检测系统设有CXD旋转臂15、(XD接收器16和滤光片17，所述CXD旋转臂15 固定在旋转台11台面，CCD旋转臂15可随旋转台11台面360度自由旋转，CCD旋转臂15 连接在旋转台11台面，用于采集图像的CCD接收器16和滤光片17设在CCD旋转臂15上。
所述激光光源可采用固定激光器，所述固体激光器可采用波长为405nm、473nm、 532nm、593. 5nm、808nm、980nm、1064nm或1342nm等的固体激光器，所述固体激光器的功率可为50 500mW/cm2。所述针孔的直径可为0. 015 0. 025mm。所述矩形光栏可由菲林图案组成，所述矩形光栏的大小可为(5 15)mmX (5 15)mm。所述棱镜可采用等腰直角三角棱镜。所述CCD旋转臂可通过螺丝等紧固部件固定在旋转台台面上。所述空间滤波器含有(25 40) X倍物镜。所述CCD接收器可固定在CCD旋转臂末端，而旋转臂与旋转台台面连接部分为中空部分。因此，样品架通过此中空部位时，处于旋转台的正中心，且可独立固定于光学平台上，不随旋转台一起转动。
参见图4，CXD旋转臂15通过4个紧固螺丝18固定在旋转台11台面。CXD旋转臂15与旋转台11连接部位的正中心19为中空部位，样品架通过此中空部位，处于旋转台 11的正中心，且可独立固定于光学平台上，当CCD旋转臂15随旋转台11转动时，样品架始终保持不动。C⑶接收器16的固定沟槽20可方便调整CXD接收器16的位置。
本实施例以罗丹明B荧光传感膜(IihB-PVA膜)为检测对象。
所述纳米级金属薄膜可采用真空溅射法制备，具体方法如下在洁净的石英基底表面溅射厚度为2nm的铬膜作为粘附层，再溅射厚度为50nm金膜，即得纳米级光滑金属薄膜。
所述荧光传感膜可采用旋涂法制备，具体方法如下在纳米级光滑金属薄膜表面旋转镀膜上含有罗丹明B的PVA膜，结合光漂白方法，制备所需的荧光传感膜。
固体激光器5波长可采用532nm，功率约为250mW/cm2 (波长的选择由检测的荧光染料的激发波长决定)，其发出的激光经40X倍显微物镜6和孔径为Φ0. 025mm的针孔7 组成的空间滤波器扩束和平凸透镜8准直后，成为光强分布均勻的平行光束。调整衰减器 9，对平行光束进行衰减，直至得到合适的光强(避免造成荧光的光漂白，同时保证在C⑶上获取清晰的成像)。菲林图案形成的矩形光栏10大小为7mmX 7mm，将扩束准直后的平行光束由圆形光斑变成矩形光斑。
在SPCDE成像中，光斑直接照射在荧光传感膜14，此时光斑的面积大小由矩形光栏决定。调整样品架，使矩形光斑垂直照射荧光传感膜14表面，从而激发染料分子。激发态的染料分子与纳米金属薄膜13表面产生的等离子体作用后，在等腰直角三角棱镜12另一侧产生定向发射，通过滤光片17后，辐射到CXD接收器16。
固定CXD接收器16的位置后，调整CXD接收器的成像透镜直至CXD接收器16上呈现清晰的图像。通过转动旋转台11，改变CXD旋转臂15的角度，从而实现CXD接收器16 采集不同检测角度下的SPCDE成像信息，以图像格式存储。采集到的图像用Image J处理， 获取各个图像的信号强度并加以分析。
以本发明所述基于棱镜型表面等离子体耦合定向发射荧光成像装置进行罗丹明B 荧光传感膜14的成像检测，考察其信号角度分布。分析不同检测角度下所获取的荧光成像信息，结果显示，在检测角度为58°时，荧光发射信号最强，具有显著的信号角度分布。此外，用荧光染料微阵列样品进行荧光偏振性检测，在最强荧光发射角度，即检测角度为58° 时检测，对比在不同偏振发射条件下所采集到的荧光成像信息，结果证实SPCDE中的荧光发射信号是垂直偏振的，即P偏振。因此，该装置满足SPCDE的实验要求，可用于表面等离子体耦合定向发射荧光的成像检测。图5为检测角度为58°时，在不同偏振发射下所采集到的荧光成像信息。其中图像21为在未加偏振器所采集到的荧光成像数据，图像22为完全水平偏振所采集到的荧光成像数据，图像23为完全垂直偏振所采集到的荧光成像数据。
图6为在激发波长为532nm，发射波长为580nm状态下的荧光强度角分布极坐标图，最强的荧光发射信号所对应的检测角度。
权利要求
1.一种定向发射荧光成像检测装置，其特征在于设有激光扩束系统、样品系统和检测系统；所述激光扩束系统设有激光光源、显微物镜、针孔、平凸透镜、衰减器和矩形光栏；所述激光光源发出的激发光依次经显微物镜、针孔和平凸透镜扩束准直后，成为平行光束，所述平行光束依次通过衰减器和矩形光栏，得到矩形光斑；所述样品系统设有旋转台、样品架、棱镜和光学石英基底，所述棱镜置于样品架上并固定在旋转台中心，所述光学石英基底表面设有纳米级金属薄膜，所述纳米级金属薄膜表面设有荧光传感膜；所述光学石英基底与棱镜之间涂有光学常数与两者匹配的溶液；所述检测系统设有CCD旋转臂、CCD接收器和滤光片，所述CCD旋转臂固定在旋转台台面，CCD旋转臂可随旋转台台面360度自由旋转，CCD旋转臂连接在旋转台台面，用于采集图像的CCD接收器和滤光片设在CCD旋转臂上。
2.如权利要求1所述的一种定向发射荧光成像检测装置，其特征在于所述激光光源采用固定激光器。
3.如权利要求2所述的一种定向发射荧光成像检测装置，其特征在于所述固体激光器采用波长为 405nm、473nm、532nm、593. 5nm、808nm、980nm、1064nm 或 1342nm 的固体激光器， 所述固体激光器的功率可为50 500mW/cm2。
4.如权利要求1所述的一种定向发射荧光成像检测装置，其特征在于所述针孔的直径为 0.015 0. 025mm。
5.如权利要求1所述的一种定向发射荧光成像检测装置，其特征在于所述矩形光栏由菲林图案组成，所述矩形光栏的大小为(5 15)mmX (5 15)mm。
6.如权利要求1所述的一种定向发射荧光成像检测装置，其特征在于所述荧光传感膜采用罗丹明B荧光传感膜。
7.如权利要求1所述的一种定向发射荧光成像检测装置，其特征在于所述棱镜采用等腰直角三角棱镜。
8.如权利要求1所述的一种定向发射荧光成像检测装置，其特征在于所述光学常数与两者匹配的溶液采用甘油。
9.如权利要求1所述的一种定向发射荧光成像检测装置，其特征在于所述CCD旋转臂通过螺丝等紧固部件固定在旋转台台面上。
10.如权利要求1所述的一种定向发射荧光成像检测装置，其特征在于所述CCD接收器固定在CCD旋转臂末端，而旋转臂与旋转台台面连接部分为中空部分。
全文摘要
一种定向发射荧光成像检测装置，涉及一种荧光成像检测装置。设有激光扩束、样品和检测系统；激光扩束系统设有激光光源、显微物镜、针孔、平凸透镜、衰减器和矩形光栏；激光光源发出的激发光依次经显微物镜、针孔和平凸透镜扩束准直后成为平行光束，平行光束依次经衰减器和光栏得光斑；样品系统设旋转台、样品架、棱镜和光学石英基底，棱镜置于样品架上并固定在旋转台中心，石英基底表面设有纳米级金属薄膜，薄膜表面设有荧光传感膜；石英基底与棱镜之间涂有溶液；检测系统设有CCD旋转臂、CCD接收器和滤光片，CCD旋转臂固定在旋转台台面，CCD旋转臂连接在旋转台台面，用于采集图像的CCD接收器和滤光片设在CCD旋转臂上。
文档编号G01N21/64GK102539404SQ20121000225
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月5日 优先权日2012年1月5日
发明者刘倩, 曹烁晖, 李耀群, 蔡伟鹏 申请人:厦门大学