活体动物双光子激发延时检测荧光成像分析方法及设备的制造方法

活体动物双光子激发延时检测荧光成像分析方法及设备的制造方法
【专利摘要】本发明公开了一种活体动物双光子激发延时检测荧光成像分析方法及设备，用于分析动物体内组织和器官中荧光纳米探针(或荧光纳米载药体模拟探针)的分布、荧光强度或探针浓度随时间变化动力学性质，以红光或近红外脉冲激光双光子激发体内荧光纳米探针发光，以延时检测荧光成像方式探测体内特定部位荧光强度及其随时间变化动力学性质，具有成像分析深度大、可靠性高、检测灵敏度高等优点。
【专利说明】
活体动物双光子激发延时检测荧光成像分析方法及设备
技术领域
[0001] 本发明涉及动物在体荧光影像分析技术，特别涉及一种活体动物体内纳米载药体 模拟探针或荧光纳米探针的分布及输运动力学性质的荧光成像分析方法，实施所述分析的 设备，以及该方法和设备在纳米载药体肿瘤靶向动力学性质表征中的应用。
【背景技术】
[0002] 动物在体荧光影像技术具有灵敏度高、损伤小等特点，已发展成为活体动物成像 的一种常用方法，被广泛用于生命科学、生物医学和药物研发等领域[V. Wagner， A.DuIlaartjA.BockjA.ZweckjThe emerging nanomedicine landscape.Nature Biotechnology. 2006,24,1211-1217.]。活体荧光成像系统在生物医学、生理分析及药物研 发等领域的许多研究中有广阔的应用前景。然而，活体动物荧光成像技术也面临着许多难 题有待解决，例如，在可见光/紫外激发光源照射下，活体动物的皮肤、毛发等组织会产生较 强的自发荧光，它们与常用的标记探针的荧光光谱重叠，导致信噪比大幅降低，严重影响检 测的灵敏度和准确性;另一方面，不同类型的细胞和组织对光的吸收和散射能力不同，活体 动物组织结构及体液运动情况复杂，导致了特异荧光信号的衰减、信号失真等问题。此外， 一些有毒性的探针不宜在活体中使用，而小分子荧光探针发光强度较低，发光性质受环境 影响显著，光稳定性和化学稳定性不够高等问题也是制约活体荧光成像技术发展的重要因 素。如何克服活体动物自发荧光的干扰，增加探测深度，提高所采集生化信息的准确性，是 活体荧光影像技术发展中具有挑战性的科学技术难题。
[0003] 传统荧光成像技术利用连续或调制光源激发活体组织或细胞中的特异性荧光探 针发光实现荧光成像。组织、细胞和体液对激发光的散射和自发荧光等背景荧光与探针发 光混在一起，对特异性靶标的影像产生较大的干扰。一般通过与探针荧光匹配的窄带滤光 片压制激发光散射和背景荧光来提高活体荧光影像分析的灵敏度。但是，在活体动物体内 大深度标记下需要使用较高激发光强时，背景荧光的干扰难以克服。背景荧光干扰导致图 像信噪比下降，严重时将湮没特异性荧光信号，大大制约了活体动物荧光成像技术的应用。 利用激发光散射和生物自发荧光等背景荧光与荧光探针发光之间的发光寿命差异，实现时 间分辨荧光成像是一个很好的解决方案。由于激发光散射的持续时间与激发光脉冲宽度大 致相当，可以通过延时检测技术将其避开。但是，背景荧光寿命和绝大多数荧光探针分子寿 命均在纳秒量级，如，蛋白质、色素和大多数荧光祀标的荧光寿命一般不超过20ns，寿命差 异较小，相应的延时检测技术仅适合于显微寿命成像，难以应用于活体动物的快速、大视场 成像。
[0004] 近年来，基于染料分子独特的荧光光谱，通过比较标准荧光光谱去除本底荧光干 扰，发展了光谱拆分活体成像技术，在一定程度上提高了成像的准确度和灵敏度[X.H.Gao， Y.Y.Cui,R-M-LevensonjL-W.K-ChungjS-M-NiejIn vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots，Nature Biotechnology，2004,22,969_976.]D但由于 光谱成像或光谱拆分成像是由多帧含有光谱信息的图像拼合而成，高度依赖于图像的计算 解析技术，在背景光较强时，难以保证探针特征光谱拆分的可靠性。生物分子和普通荧光染 料的发射光谱都很宽，彼此严重交叠，在准确获取目标物的特征光谱方面仍有相当难度。由 于动物种属、不同个体间以及不同组织的差异等原因，光谱拆分技术在实际应用中也会产 生一些假象。因此，采用新的背景光抑制原理与技术是进一步提高检测灵敏度与可靠性的 关键所在。
[0005] 动物组织和细胞中存在与激发光波长四次方成反比的瑞利散射，以及其它形式的 散射，强烈的散射和吸收使激发光难以有效到达深层靶标，给实现其荧光成像带来很大困 难。生物组织、细胞和体液对610-900nm波段的光散射和吸收相对较小，因而该波段被称为 生物组织激发和检测的光学窗口。双光子激发荧光一般使用波长为750-1000nm的飞秒近红 外激光作为激发光源，荧光标记探针同时吸收两个光子达到激发态。由于双光子激发几率 与激发光强两次方成正比，焦点以外的发光物质被激发的几率大为降低。然而，动物体内的 某些物质也会因双光子效应而产生很强的背景荧光，导致信噪比下降，而本发明人的研究 表明，动物表皮在飞秒激光激发下会产生很强的背景荧光或磷光，其寿命也长于普通荧光 染料的荧光寿命，采用普通双光子激发成像方式难以获得体内发光标记物的准确信息。
[0006] 另一方面，现有双光子共焦成像技术是在单光子共焦成像技术和飞秒激光光源基 础上，针对可见光谱区的双光子荧光染料开发的。该技术采用逐点扫描成像，因而不适用于 大视场下的活体动物成像。同时由于逐点扫描的工作模式，在成像时间的限制下，每点的工 作时间必须是纳秒量级的，这使此类技术难以应用于活体动物高效双光子激发成像分析。
[0007] 纳米载药体已成为一种有效的新型给药方式，在肿瘤治疗中发挥了积极作用。然 而纳米载药体的性能取决于其组成、尺寸、表面祀向分子结构，进一步优化纳米载药体的性 能，需要定量理解其在活体动物体内的肿瘤靶向动力学性质及在主要器官中的分布与上述 结构特征之间的关系。为高效、准确地获得上述信息，本发明人提出采用双光子激发延时检 测荧光成像的方法对注入活体动物体内的、具有长发光寿命且双光子激发和荧光发射波长 均处于生物透光窗口（600-1000nm)的纳米载药体模拟探针（下称荧光纳米载药体模拟探 针）的分布和动力学性质进行定量分析的方法。由于动物表皮血管或体内组织中距光源更 近的纳米载药体模拟探针将首先被激发，而在普通照射模式下，随着探测深度的增加，激光 功率密度会显著减小，双光子激发发光强度下降，因此在大视场(例如一维尺寸为1mm-IO厘 米)下要对活体动物体内肿瘤或某些特定器官中的纳米载药体模拟探针进行无损或非介入 式荧光分析，需要减小或消除处于皮肤或待测组织、器官周围的上述探针产生的荧光干扰。

【发明内容】

[0008] 为解决上述难题，本发明提供一种双光子激发延时检测荧光动物成像分析技术、 设备与应用，以实现在大视场下，增大动物体内荧光纳米载药体模拟探针成像分析深度，消 除自发荧光与背景光的干扰，同时减小来自动物表皮和目标探测部位周围组织中荧光纳米 载药体模拟探针荧光的干扰，提高所述成像分析的可靠性。
[0009] 本发明的技术方案如下：
[0010] -种活体动物体内组织和器官中荧光纳米探针的分布、荧光强度或探针浓度随时 间变化动力学性质的荧光成像分析方法，其特征在于，以红光或近红外脉冲激光双光子激 发体内荧光纳米探针发光，以延时检测的方式探测体内受激发部位的荧光，进行成像。
[0011] 上述荧光成像分析方法中，所述荧光纳米探针可为动物体内的组织或器官中的荧 光纳米载药体模拟探针。通过该方法可以对荧光纳米探针在动物体内的分布、荧光强度或 探针浓度随时间变化动力学性质进行检测分析。
[0012] 本发明的荧光成像分析方法的成像视场至少有一维尺寸在1毫米至10厘米范围 内。通过电动平移台驱动检测设备对成像部位进行激发光斑的可控扫描，实现大的成像视 场。
[0013] 本发明的荧光成像分析方法中，优选的，通过红光或近红外飞秒脉冲激光激发荧 光纳米探针中的双光子敏化稀土发光配合物发光，所述红光或近红外飞秒脉冲激光的波长 在610-1100纳米范围内，更优选为700-1000纳米范围。所述飞秒脉冲激光的输出总功率为 10-1 OOOOmW，优选为 300-1 OOOmW，脉冲激发频率为 IOHz-I OOOOHz，优选为 100Hz-400Hz。
[0014] 本发明的荧光成像分析方法中，激发光脉冲激发后，利用荧光探测器延时检测体 内受激发成像部位的荧光，所述延时为激发光脉冲激发后到荧光探测器开启之前的时差， 该时差为IOns至500ys;延时检测焚光的时间窗口为IOns至IOOms，优选为IOOns至20ms。
[0015] 上述荧光纳米探针可具有双光子敏化稀土发光性能，所述稀土发光的波长位于红 光或近红外区，优选波长范围为600-1050纳米。所述荧光纳米探针的发光体基本上由基质 材料和具有双光子敏化稀土发光性能的稀土配合物组成，所述基质材料是由主链为碳氢 链、侧基为羧基和疏水基团构成的高分子化合物;所述稀土配合物为近红外光激发下发射 可见光或近红外光的稀土配合物。
[0016] 优选的，所述稀土配合物选自式I、式II和式III结构通式所示化合物中的一种或 多种；
[0017]
[0018] 式I、式II和式III中，La代表铕、镱或钕离子A1和R2各自独立为Cl~C4烷基;R 3、 R4、R5、R6、R7和R8各自独立为甲基或H。
[0019]所述基质材料与所述稀土配合物的质量比为1~10,000:1;组成所述基质材料的 高分子化合物的数均分子量为1，500~150，000;所述高分子化合物中，羧基基团占所述高 分子化合物总质量的〇.01 %~40%。由基质材料和稀土配合物组成的发光体为发光纳米粒 子，其粒径为5~200纳米。
[0020] 本发明荧光成像分析方法中的激发光脉冲激发、延时荧光信号采集、信号多次累 积、样品移动是在时序控制器控制下自动进行。
[0021] 本发明的荧光成像分析方法可以做到无损分析，即为用于激发荧光纳米探针的激 发光源位于体外，荧光探测器也位于体外的无创伤检测。另一种情况是，所述荧光纳米探针 的光激发和荧光收集是以将导光管插入体内并接近探测部位的方式进行，所述导光管的前 端位置和探测部位的距离为0.1至3厘米;所述导光管可以是空芯光纤、液芯光纤和覆膜光 纤等。
[0022]在很多情况下，激发、检测目标部位位于动物皮肤以下，需要使激发光的焦点位于 动物皮肤以下，使激发光焦点处的光功率密度远大于其它部位的光功率密度;优选的，使皮 肤以下激发光焦点处的光功率密度是皮肤处的光功率密度的2至1000倍，更优选的，是皮肤 处的光功率密度10至1000倍。
[0023] 本发明的荧光成像分析方法可以以功率密度均匀的平场线形飞秒脉冲激光束对 活体动物(注射荧光纳米探针)进行扫描激发荧光成像分析;利用时序控制器控制荧光探测 器(如ICCD)延时采集动物体内被上述激发方式激发的荧光纳米探针的荧光信号。
[0024] -种方法是，以两条功率密度均匀的平场线形飞秒脉冲激光束在活体动物皮下聚 焦成一条平场线形脉冲激光束，并以此激光束扫描的方式激发荧光纳米探针，利用时序控 制器控制荧光探测器(如ICCD)延时采集动物体内被上述激发方式激发的荧光纳米探针的 焚光信号。
[0025] 还可以是，以环形带状飞秒脉冲激光束射入动物皮下待测部位聚焦的方式激发荧 光纳米探针，利用时序控制器控制荧光探测器(如ICCD)延时采集动物体内被上述激发方式 激发的荧光纳米探针的荧光信号。
[0026] 本发明的荧光成像分析方法中，除了采集受激发部位的荧光信号，还可以对受激 发部位的光致发光进行光谱采集，所述光谱采集的波长位于600纳米至1000纳米范围。
[0027] 进一步的，在时序控制器下，利用平场线形聚焦激光束对动物体内进行扫描激发， 以光谱仪和ICCD以延时探测的方式采集各受激发位置的光致发光光谱;或者，在时序控制 器下，利用环形带状激光束在动物体内进行聚焦激发，以光谱仪和ICCD以延时探测的方式 采集各受激发位置的光致发光光谱。
[0028] 本发明的荧光成像分析方法可应用于研究纳米载药体在动物体内分布、输运或肿 瘤靶向动力学性质方面，在荷瘤动物或正常动物的静脉注射荧光纳米载药体模拟探针(简 称荧光纳米探针)的前后，分别对待测部位进行双光子激发延时光谱采集检测，以注射所述 荧光纳米探针之前的光谱为背景，利用光谱差减方法，获得注射所述荧光纳米探针后动物 体内受测部位荧光纳米探针的光谱信号，以及该信号随时间变化的动力学性质。
[0029]利用本发明的荧光成像分析方法还可以通过以下步骤实现对药物靶向性的研究： [0030] 1)对动物静脉注射荧光纳米载药体模拟探针；
[0031 ] 2)以飞秒脉冲激光激发动物体内一个正常非脏器部位血管中的所述探针发光，以 延时信号采集的方式记录该部位荧光强度随时间的变化；
[0032] 3)以飞秒脉冲激光激发动物体内载药体靶向目标部位中的具有载药体靶向性的 所述探针发光，以延时信号采集的方式记录该目标部位荧光强度随时间的变化；
[0033] 4)以方程Y=AieTtAl+C拟合步骤2)中探针发光强度随时间衰减的数据；
[0034] 5)以方程Y = AaeTtAl+AbertA2+B拟合步骤3)中探针发光强度随时间衰减的数据，以 Ab/(Aa+Ab)表征所述探针的载药体靶向性，以1Λ1表征因免疫系统清除或非特异性吸附导 致所述探针在探测部位的浓度下降速率，以τ2表征所述探针在靶向部位平均滞留时间；其 中C和B为常数或时间的函数。
[0035] 本发明还提供了一种用于实施上述荧光成像分析方法的荧光成像分析设备，主要 部件包括飞秒激光器、荧光探测器、时序控制器、光路控制系统、和用于空间光功率密度分 布调控的光场分布器，其中，飞秒激光器发出的红光或近红外脉冲激光经光场分布器的调 节和聚焦后，在时序控制器和光路控制系统的控制下投射到动物体内的待测部位上，激发 待测部位的荧光纳米探针发光，然后在时序控制器和光路控制系统的控制下通过荧光探测 器进行延时检测，所述激发可为双光子或多光子激发，所述延时的时长为10纳秒至500微 秒。
[0036] 进一步的，上述荧光成像分析设备还包括用于实现光源、样品和/或荧光探测器移 动的运动平台。
[0037] 所述荧光探测器通常采用KXD探测器，进一步的还可以包括成像光谱仪。
[0038]本发明的焚光成像分析设备利用光场分布器将飞秒激光以空间光场能量分布可 控方式将点或线形激发光束式投射到动物体内的待测部位上。
[0039]所述光场分布器基本上由三个部分构成，以完成所需光场分布调节功能：对激发 光进行扩束的扩束部分，进行光束形状控制的光场控制光阑，以及将经过调整的激光光束 聚焦的聚焦部分。
[0040] 其中，扩束部分为扩束透镜组或扩束反射镜组中的至少一种;光场控制光阑的位 置可位于扩束透镜组或反射镜组的镜片之间，或位于扩束部分和聚焦部分之间，或位于光 束聚焦部分之后的一侧;聚焦部分为透镜、透镜组、反射聚焦镜或反射聚焦镜组中的至少一 种。
[0041] 优选的，所述光场分布器的部件的组合方式如图1所示，其中凹透镜1-1和凸透镜 1-2共同组成扩束透镜组，光场控制光阑1-3位于扩束透镜组两片透镜之间，经过调整的激 光光束被柱面凸透镜1-4聚焦后形成线形激发光斑。光场分布器的光学部件集合体(包括扩 束透镜组、光场控制光阑和聚焦用的柱面凸透镜)被置于电控平移台1-5上，可在所述电动 平移台1-5的驱动下对待测成像部位进行激发光斑的可控扫描。
[0042] 所述光场控制光阑可以为曲线形光阑、带状光阑中的至少一种，所述带状光阑包 括条带形光阑和环带形光阑。
[0043] 所述光场控制光阑结构示意图如图2所示，其中：a为曲线形光阑；b为条带形光阑； c为环带形光阑。所述曲线形光阑的光透过或光反射区域为两条曲线型和两条直线型边框 围成的区域，所述曲线的形状可根据将光功率密度呈高斯分布的飞秒激光束变化为线形平 场飞秒激光束的需要计算获得。所述条带形光阑由一个具有两条直边的阻止(或减弱)光透 过或光反射的区域将上述曲线形光阑分隔成两个具有光透过或光反射性能的条带区域;所 述环带形光阑的光透过或光反射区域呈环形带状，内环中的区域为阻止或削弱光透过或光 反射的区域。所述设备可以控制激发激光在样品内部形成点状或线状聚焦。在环带形光场 控制光阑（图2c)的作用下，提高激光在聚焦点处和远离聚焦点处的功率密度差异。在曲线 形光场控制光阑的作用下，将能量密度呈高斯函数形式分布的激光光束变换成能量密度均 匀的（平场)线形聚焦光束，该光阑的透光区域具有曲线形和直线形边框（图2a)，其中曲线 形的形状可以通过对高斯函数的线聚焦光场分布强度关系进行反向计算获得。在条带形光 场控制光阑的作用下，将能量呈高斯函数形式分布的激光光束变换形成平场的线形聚焦光 束;并且在中间条带形遮挡物对光束的遮挡作用下，提高激光在聚焦线处和远离聚焦线处 的功率密度差异(图2b)。
[0044] 可以通过允许和阻隔光的通过来实现对光场的控制，即为透射光阑；也可以通过 允许和阻隔光的反射方式来实现对光场的控制，即为反射光阑。
[0045] 所述光场控制光阑当以透射模式工作时(透射光阑），阻隔光的部分可以是不透光 的材质制成，以独立自支撑形式存在，透光的部分用中空的形式实现;透光和阻隔光的边缘 处厚度为500纳米到1毫米;也可以通过在透光基质表面上涂布，镀或粘贴不透光或透光性 差的物质对光进行遮挡形成。
[0046] 所述光场控制光阑的不透光或透光性差的物质为金属、高分子和含有染料的高分 子中的至少一种，所述透光性基质包括石英、玻璃、高分子树脂中的一种。
[0047] 所述光场控制光阑以反射模式工作时(反射光阑），允许光的反射可以通过在透明 基底上镀具有特定反射能力的镀层来实现，未镀反射层的部分可以用镀增透膜、涂黑防止 反射或附加遮挡部件等方式来阻隔光的反射。
[0048] 本发明的荧光成像分析设备，优选的，其各光学和机械功能部件间连接方式和结 构示意图如图3、图4或图5所示;其各机械、电子控制功能部件间连接方式和结构示意图如 图6所示。
[0049] 其中，图3所示的设备包括用于放置待测动物的样品平移台3-3,其光路控制系统 包括二向色镜3-4、物镜组3-5、转向反射镜3-6、第一成像透镜组3-7和第二成像透镜组3-10,荧光探测器包括成像光谱仪3-8、第一ICXD 3-9和第二ICXD 3-11，其光场分布器3-2含 有电控平移台；来自飞秒激光器的激光3-1经本发明提供的光场分布器3-2的调节和聚焦控 制后经过二向色镜3-4的反射后形成所述飞秒激发光束并照在样品平移台3-3上待测动物 的待测部位上。所述激发光束可以在光场分布器3-2的电控平移台驱动下扫描激发待测部 位的不同位置;拍摄像场与样品之间的位置改变通过三维电控的样品平移台3-3驱动样品 移动来实现;产生的信号光透过二向色镜3-4被物镜组3-5收集。转向反射镜3-6用于控制信 号光通向影像分析端（图中右侧)或是光谱成像分析端（图中左侧）。影像分析端包括第二成 像透镜组3-10和第二KXD探测器3-11;光谱成像分析端则包括第一成像透镜组3-7、成像光 谱仪3-8和第一 ICCD探测器3-9。
[0050] 图4和图5分别给出了图3所示设备在仅使用影像分析端或光谱成像分析端工作模 式下的光学和机械部分及其连接结构，在图4中，产生的信号光透过二向色镜3-4被物镜组 3-5收集，经过转向反射镜3-6和成像透镜组3-10后成像在KXD探测器3-11的像平面上;在 图5中，产生的信号光透过二向色镜3-4被物镜组3-5收集，经过转向反射镜3-6和成像透镜 组3-7后成像在成像光谱仪3-8的入口狭缝处，经过光栅分光形成光谱像而被KXD探测器3-9检测。
[0051] 图6描述本发明设备（图3、4、5)的机械电子控制部件的连接结构，飞秒激光器输出 的激光同步信号输送至延时发生器，延时发生器控制飞秒激光脉冲与ICCD采集荧光信号时 间之间的精确延时关系。通过计算机给延时发生器和平移台控制器设定的参数，可以控制 成像采集的空间位置和飞秒激光照射的具体位置;通过计算机设定的参数，快门的通断决 定在设备工作中激光脉冲在探测器进行采集工作之前的恰当时间激发样品，并在设定的时 间窗口内收集特定部位的荧光信号。
[0052] 本发明设备利用可编程控制的延时发生器，控制脉冲激发、延时荧光信号采集、信 号多次累积、样品移动按预定程序自动进行；所述延时为IOns至IOms，优选为IOOns至 500ns。本发明的分析方法和设备可应用在测定荧光纳米探针或荧光纳米载药体模拟探针 在动物体内分布、输运或肿瘤靶向动力学性质方面。
[0053] 上述用于空间光功率密度分布调控的光场分布器和光场控制光阑也属于本发明 的保护范围。本发明提供的成像分析方法和设备在测定荧光纳米探针或荧光纳米载药体模 拟探针在动物体内分布、输运或肿瘤靶向动力学性质方面的应用也属于本发明的保护范 围。
[0054]本发明提供的活体动物体内荧光纳米探针分析方法和设备，克服了传统活体动物 荧光成像分析方法中穿透深度小、背景荧光干扰大，易产生伪像、难以对体内荧光纳米探针 输运动力学性质进行准确的无创定量分析等缺点，具有成像分析深度大、可靠性高、检测灵 敏度高等优点，利用该技术可以无创伤的方式定量分析注入动物体内的所述荧光纳米探针 的输运动力学性质，肿瘤靶向动力学性质及所述荧光纳米探针在体内的分布等方面的准确 信息(见实施例1)，在纳米医药研制、新型疾病诊断技术开发等方面具有重要应用价值。如 实施例6所示，本发明的方法和设备可对活体动物表皮以下100个荧光标记肿瘤细胞进行清 楚地成像分析，并可对动物体内所标记的细胞进行定量分析。
[0055] 本发明借助所提供的配有特殊曲线形光场控制光阑的光场分布器，在不引入额外 色散(透镜组导致的色散除外）的情况下，将能量密度呈高斯形分布的圆形飞秒脉冲激光束 整形为平场线形飞秒脉冲激光束，这是传统干涉型整形器件所不能实现的。本发明使平场 线形飞秒激光光束在活体动物表皮以下待测部位聚焦，对待测部位进行扫描双光子激发， 有效地减小的表皮组织在飞秒激光激发下产生的背景荧光，同时解决了因飞秒激光高斯形 光场分布导致激发光功率密度不均，不能用于大视场下准确的双光子激发延时检测荧光成 像定量分析的难题，提高的所述双光子激发成像分析的效率和可靠性。本发明借助所提供 的配有环形带状光场控制光阑的光场分布器，使飞秒激光光束在活体动物表皮以下待测部 位聚焦，减小了动物表皮及待测部位周围荧光纳米探针对分析效果的干扰，提高的分析结 果的可靠性。
[0056] 本发明利用双光子激发高效稀土长寿命发光探针、延时检测荧光强度分布、延时 光谱采集解析等多项技术的协同耦合效果，实现了体内荧光纳米探针或荧光纳米载药体输 运动力学性质和肿瘤组织靶向结合动力学性质的准确定量分析(参见实施例1)，这一效果 是无法从以往报道的结果中预期而知的。本发明人的研究表明，使用现有商购活体动物荧 光成像分析设备无法获得准确的上述信息。
【附图说明】
[0057] 图1是光场分布器的一种典型结构的示意图，其中：1-1为凹透镜，1-2为凸透镜，1-3为光场控制光阑，1-4为柱面凸透镜，1-5为电动平移台。
[0058]图2显示了光场控制光阑的三种实施形式:a，曲线形光阑；b，条带形光阑；c，环带 形光阑。
[0059]图3是双光子激发延时荧光检测活体动物成像分析设备示意图，其中：3_1为飞秒 激光，3-2为光场分布器，3-3为样品平移台，3-4为二向色镜，3-5为物镜组，3-6为转向反射 镜，3-7为第一成像透镜组，3-8为成像光谱仪，3-9为第一 ICXD，3-10为第二成像透镜组，3-11 为第二 ICCD。
[0060]图4是双光子激发成像模式下的结构模式图，其中：3-1为飞秒激光，3-2为光场分 布器，3-3为样品平移台，3-4为二向色镜，3-5为物镜组，3-6为转向反射镜，3-10为第二成像 透镜组，3-11为第二ICXD。
[0061]图5是双光子激发光谱成像模式下的结构模式图，其中：3-1为飞秒激光，3-2为光 场分布器，3-3为样品平移台，3-4为二向色镜，3-5为物镜组，3-6为转向反射镜，3-7为第一 成像透镜组，3-8为成像光谱仪，3-9为第一 KXD。
[0062] 图6是双光子激发延时荧光检测活体动物成像设备整体控制结构示意图，其中3-5 为物镜组，3-3为样品平移台，3-7为第一成像透镜组，。
[0063] 图7是实施例1中，体内不同荧光纳米探针荧光强度随时间变化曲线，其中：a，EuO SMA-mPEG-RGD探针，插图为放大图；b，EuOSMA-Tf探针。
[0064] 图8是实施例2中，活体动物成像分析中双光子激发延时荧光检测成像与普通双光 子激发荧光成像效果比较，其中：a，腿部荷瘤小鼠明场图；b、c分别为注射荧光纳米探针前 后普通双光子激发荧光成像结果;d、e分别为注射荧光纳米探针前后双光子激发延时荧光 检测成像结果;标尺为2mm。
[0065] 图9显示了实施例2中成像分析方法探测深度实验结果，其中：a，脂肪组织模拟液 (1%)荧光成像;b，置于5_厚的脂肪组织模拟液(1%)之下的荧光纳米探针的荧光成像;C， 置于7_厚的脂肪组织模拟液(1 % )之下的荧光纳米探针的荧光成像。
[0066]图10显示了实施例4中，飞秒激光光场分布调控效果，其中a，在垂直于光束方向上 入射飞秒脉冲激光光功率密度分布图；b,光场分布器整形后的飞秒脉冲线形激光光功率密 度分布图，虚线为直接使用柱透镜进行线聚焦的光场分布图，实线为经曲线形光场控制光 阑后再进行柱透镜线聚焦之后的光场分布图。
[0067]图11显示了实施例5中双光子激发延时荧光检测成像分析中的热效应。
【具体实施方式】
[0068] 为了更加清楚地说明本发明的效果，提供以下实施例，但本发明的内容并不限于 这些实施例，所使用的材料如无特别说明，均可通过商购获得。
[0069] 实施例1、荷瘤小鼠体内荧光纳米探针肿瘤靶向动力学分析
[0070] 在裸鼠的右后腿上建立用于双光子激发时间分辨成像的HepG-2肝癌模型。实验中 分别使用转铁蛋白（Tf)和RGD修饰的含10%Eu(tta) 3bpt的苯乙烯-马来酸酐共聚合物 (SMA)纳米粒子(16nm)，获得两种表面上分别接有不同肿瘤识别分子的双光子敏化Eu 3+发光 的荧光纳米探针。通过尾静脉注射300微升含有1.5mg荧光纳米探针的胶体溶液，然后，采用 吸入式呼吸麻醉系统将老鼠麻醉，以保证在成像过程中老鼠不会产生明显的位移。在本发 明双光子激发时间分辨成像设备上，采用波长为SOOnm的飞秒脉冲激光激发所需分析部位 体内荧光纳米探针，在每个激光脉冲过后经500ns延时，再收集500ns到3ms之间的荧光信 号，然后累计收集5000次上述激发-延时检测得到的信号用于成像分析。该实验中激光输出 功率为500mW，脉宽为100飞秒，重复速率为250Hz。
[0071] 实验中我们分别对荷瘤鼠的肿瘤部位和另一条腿部的无肿瘤相应部位进行了成 像分析。以方程Y=AieTtAl+C拟合腿部无肿瘤相应部位探针发光强度随时间（t)衰减的数 据，以方程Y = AaeTtAl+AbertA2+B拟合肿瘤部位探针发光强度随时间衰减的数据，以A b/(Aa+ Ab)表征所述荧光纳米探针的肿瘤靶向性，以1Λ1表征因免疫系统清除或非特异性吸附导 致荧光纳米探针在探测部位的浓度下降速率，以τ2表征所述纳米粒子在肿瘤组织上的结合 或受陷强度(平均滞留时间）；其中C和B为常数。实验测得的荧光强度随时间变化的曲线如 图7所示，数据拟合分析结果列于表1。由表1中实验结果可知，表面接枝RGD分子获得的纳米 载药体(Eu@SMA-RGD-mPEG)(荧光纳米探针）的肿瘤靶向效率(94 % )远高于表面接枝Tf获得 的纳米载药体(EuOSMA-Tf)(焚光纳米探针）的肿瘤靶向效率(44%)，前者的肿瘤组织结合 效果（134)也优于后者(93)。
[0072]表1、荧光纳米探针肿瘤靶向动力学分析结果 [nn7^!i
[0074] 实施例2、活体动物成像分析中双光子激发延时荧光检测成像与普通双光子激发 荧光成像效果比较
[0075] 该实施例中，双光子激发延时检测成像实验条件与实施例1相同，在普通双光子激 发荧光成像实验中激发条件相同，延时为零纳秒。我们对荧光探针注射前后荷瘤小鼠肿瘤 区域分别进行了双光子激发延时荧光检测成像和普通双光子激发荧光成像。结果如图8所 示。该实验结果表明，使用本发明提供的方法和设备可以有效消除双光子激发活体动物成 像分析中的背景荧光对成像分析的影响，获得可靠的荧光纳米探针肿瘤靶向性质分析结 果。
[0076] 实施例3、本发明成像分析方法探测深度实验
[0077] 将荧光纳米探针固定于容器底部，在容器中注入脂肪组织模拟液，调节底部探针 上覆盖的脂肪组织模拟液的厚度，采用本发明延时荧光检测方法和设备使激发光从顶部穿 过组织模拟液激发探针，在液面上方进行成像分析，激发与检测条件如实施例1。如图9所 示，结果表明，该实验中荧光成像探测深度大于7mm，较以往的可靠荧光成像探测深度有了 显著提高。研究表明通过改变激发光功率和荧光纳米探针种类可以进一步大幅度提高探测 深度。
[0078] 实施例4、本发明设备对飞秒激光光场分布的调控
[0079] 使一束波长为700-900纳米(脉宽lOOfs)，在垂直于激光传播方向的平面上的光场 强度或功率密度分布为高斯函数形状的飞秒脉冲光束（图l〇a)，通过配有图2a所示曲线形 光场控制光阑的本发明设备（图3)，实验测得出射的飞秒脉冲激光光束为平场的线形聚焦 光束，其能量分布如图IOb所示。该实验表明经本发明设备光场分布器整形可使飞秒激光线 形聚焦光束的能量分布均匀化，这使本发明设备可以线扫描的方式对活体动物进行双光子 激发延时检测荧光成像定量分析，从而实现在大视场下对活体动物体内荧光纳米探针输运 及肿瘤靶向动力学性质进行定量分析。
[0080] 实施例5、体内荧光纳米探针动力学测试方式与温度控制
[0081] 双光子激发活体动物成像中需要考虑温度控制问题以防止对动物的热损伤及发 热对分析结果产生显著干扰，本发明的研究表明，采用飞秒激发-延时荧光检测的成像方式 可有效控制照射部位的温度升高。该实验中，我们以输出功率为480mW，脉宽为100飞秒，重 复速率为250Hz的激光连续工作24秒后，以红外成像仪探测照射部位的温度随时间的变化 (图11)，实验结果表明，在该工作条件下成像部位的温度升高小于2度，该温度变化不会对 本发明成像分析方法的结果产生显著影响。
[0082]本发明的研究表明，通过改变飞秒激光输出功率和重复速率可以进一步显著减小 本发明双光子激发-延时荧光检测成像分析方法中的温度变化。
[0083]实施例6、体内肿瘤细胞双光子激发延时荧光检测成像分析 [0084]以包埋有Eu(tta)3bpt表面接枝转铁蛋白（Tf)的稀土发光荧光纳米探针EuOPM/ SMA-Tf探针(33纳米)标记HepG-2肿瘤细胞。利用无血清DMEM培养基调节细胞浓度为I X IO5 个/ml，I X IO4个/ml、I X IO3个/ml，各取100μΙ不同细胞浓度经纳米探针标记的HepG-2细胞 接种于雄性裸鼠右后腿部皮下。于裸鼠右后腿部皮下接种100μΙ细胞浓度为IX IO5个/ml的 无标记的HepG-2细胞作为对照组。
[0085]采用本发明提供的设备(如图3和图6所示），在飞秒脉冲激光输出总功率为500mw， 激发波长为800nm，激光脉冲频率250HZ，延时为550ns条件下对上述4组动物肿瘤细胞接种 部位样品进行了所述双光子激发延时荧光检测成像分析。结果表明该成像分析对裸鼠皮下 接种肿瘤细胞的检测限好于100个细胞，接种1000个细胞部位的探针荧光信号强度为接种 100个细胞部位的3.5倍;接种10000个细胞部位的探针荧光信号强度为接种100个细胞部位 的23倍。对对照组样品进行的5次平行分析表明，仪器自身灵敏度(检测限)好于0.3%。 [0086]该实验结果表明本发明提供的分析方法和设备可以实现对活体动物体内标记肿 瘤细胞及其浓度变化进行高精度成像分析。
【主权项】
1. 一种荧光成像分析方法，用于分析活体动物体内组织和器官中荧光纳米探针的荧光 强度和分布，其特征在于，以红光或近红外脉冲激光双光子激发体内荧光纳米探针发光，以 延时检测的方式探测体内受激发部位的荧光，进行成像。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，成像的视场至少有一维尺寸在1毫米至10 厘米范围内。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用荧光探测器延时检测体内受激发成像 部位的荧光，所述延时为激发光脉冲激发后到荧光探测器开启之前的时差，该时差为IOns 至500ys;延时检测焚光的时间窗口为IOns至100ms。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过红光或近红外飞秒脉冲激光激发荧光 纳米探针中的双光子敏化稀土发光配合物发光，所述红光或近红外飞秒脉冲激光的波长在 610-1100纳米范围内；所述稀土发光的波长位于600至1050纳米范围内。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述荧光纳米探针的发光体基本上由基质 材料和具有双光子敏化稀土发光性能的稀土配合物组成，所述基质材料是由主链为碳氢 链、侧基为羧基和疏水基团构成的高分子化合物;所述稀土配合物为近红外光激发下发射 可见光或近红外光的稀土配合物。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述稀土配合物选自如下式I、式II和式 III结构通式所示化合物中的一种或多种；式I、式II和式III中，La代表铕、镱或钕离子也和R2各自独立为Cl~C4烷基;R3、R4、R 5、 R6、R7和R8各自独立为甲基或Η。7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基质材料与所述稀土配合物的质量比 为1~10，000:1;组成所述基质材料的高分子化合物的数均分子量为1，500~150，000;所述 高分子化合物中，羧基基团占所述高分子化合物总质量的0.01 %~40 % ;由基质材料和稀 土配合物组成的发光体为发光纳米粒子，其粒径为5~200纳米。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，激发荧光纳米探针的激发光源位于动物体 外，采集体内受激发成像部位荧光的荧光探测器也位于体外;或者，所述荧光纳米探针的光 激发和荧光信号采集是以将导光管插入体内并接近探测部位的方式进行，所述导光管的前 端位置和探测部位的距离为0.1至3厘米。9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，激发、检测目标部位位于动物皮肤以下，使 激发光的焦点位于动物皮肤以下，且激发光焦点处的光功率密度是皮肤处的光功率密度的 2至1000倍，优选为10至1000倍。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，以两条功率密度均匀的平场线形飞秒脉 冲激光束在活动物皮下聚焦成一条平场线形脉冲激光束，并以此激光束扫描的方式激发荧 光纳米探针;或者，以环形带状飞秒脉冲激光束射入动物皮下待测部位聚焦的方式激发荧 光纳米探针;然后，利用时序控制器控制荧光探测器延时采集动物体内被激发的荧光纳米 探针的荧光信号。11. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对受激发成像部位的光致发光进行光谱 采集，所述光谱采集的波长范围在600~1000纳米范围内。12. 根据权利要求11所述的方法，其特征在于，在时序控制器下，利用平场线形聚焦激 光束对动物体内进行扫描激发，以光谱仪和ICCD以延时探测的方式采集各受激发部位的光 致发光光谱;或者，在时序控制器下，利用环形带状激光束在动物体内进行聚焦激发，以光 谱仪和ICCD以延时探测的方式采集各受激发位置的光致发光光谱。13. -种研究纳米载药体在动物体内分布、输运或肿瘤靶向动力学性质的方法，对荷瘤 动物或正常动物静脉注射荧光纳米载药体模拟探针，在注射前后分别对待测部位利用权利 要求1~12任一所述的方法进行双光子激发延时光谱采集检测，以注射所述探针之前的光 谱为背景，利用光谱差减方法，获得注射所述探针后动物体内受测部位探针的光谱信号，以 及该信号随时间变化的动力学性质。14. 一种研究纳米载药体在动物体内分布、输运或肿瘤靶向动力学性质的方法，利用权 利要求1~12任一所述的荧光成像分析方法进行，包括以下步骤： 1) 对动物静脉注射荧光纳米载药体模拟探针； 2) 以飞秒脉冲激光激发动物体内一个正常非脏器部位血管中的所述探针发光，以延时 信号采集的方式记录该部位荧光强度随时间的变化； 3) 以飞秒脉冲激光激发动物体内载药体靶向目标部位中的具有载药体靶向性的所述 探针发光，以延时信号采集的方式记录该目标部位荧光强度随时间的变化； 4) 以方程Y=AieTtAl+C拟合步骤2)中探针发光强度随时间衰减的数据； 5) 以方程Y = AaeTtAl+AbertA2+B拟合步骤3)中探针发光强度随时间衰减的数据，以A b/ (Aa+Ab)表征所述探针的载药体靶向性，以1Λ1和1Λ2表征因免疫系统清除或非特异性吸附 导致所述探针在探测部位的浓度下降速率，以τ3表征所述探针在靶向部位平均滞留时间； 其中C和B为常数或时间的函数。15. -种荧光成像分析设备，用于分析活体动物体内组织和器官中荧光纳米探针的分 布和荧光强度，所述设备包括飞秒激光器、荧光探测器、时序控制器、光路控制系统和用于 空间光功率密度分布调控的光场分布器，其中，飞秒激光器发出的红光或近红外脉冲激光 经光场分布器的调节和聚焦后，在时序控制器和光路控制系统的控制下投射到动物体内的 待测部位上，激发待测部位的荧光纳米探针发光，然后在时序控制器和光路控制系统的控 制下通过荧光探测器进行延时检测。16. 根据权利要求15所述的设备，其特征在于，所述设备还包括用于实现光源、样品和/ 或荧光探测器移动的运动平台。17. 根据权利要求15所述的设备，其特征在于，所述荧光探测器是ICCD探测器和/或成 像光谱仪。18. 根据权利要求15所述的设备，其特征在于，所述光场分布器基本上由三个部分构 成:对激发光进行扩束的扩束部分，进行光束形状控制的光场控制光阑，以及将经过调整的 激光光束聚焦的聚焦部分。19. 根据权利要求18所述的设备，其特征在于，所述光场分布器的扩束部分为扩束透镜 组或扩束反射镜组中的至少一种;所述光场控制光阑的位置位于扩束透镜组或反射镜组的 镜片之间，或位于扩束部分和聚焦部分之间，或位于聚焦部分之后的一侧;所述聚焦部分为 透镜、透镜组、反射聚焦镜或反射聚焦镜组中的至少一种。20. 根据权利要求19所述的设备，其特征在于，所述光场分布器中，由凹透镜和凸透镜 组成扩束透镜组，光场控制光阑位于扩束透镜组的两片透镜之间，经过调整的激光光束被 柱面凸透镜聚焦后形成线形激发光斑;所述扩束透镜组、光场控制光阑和柱面凸透镜置于 电控平移台上，在所述电动平移台的驱动下对待测成像部位进行激发光斑的可控扫描。21. 根据权利要求18所述的设备，其特征在于，所述光场控制光阑为曲线形光阑和带状 光阑中的至少一种，所述带状光阑包括条带形光阑和环带形光阑。22. 根据权利要求21所述的设备，其特征在于，所述曲线形光阑的光透过或光反射区域 为两条曲线型和两条直线型边框围成的区域，所述曲线的形状根据将光功率密度呈高斯分 布的飞秒激光束变化为线形平场飞秒激光束的需要计算获得;所述条带形光阑由一个具有 两条直边的阻止或减弱光透过或光反射的区域将所述曲线形光阑分隔成两个具有光透过 或光反射性能的条带区域;所述环带形光阑的光透过或光反射区域呈环形带状，内环中的 区域为阻止或削弱光透过或光反射的区域。23. 根据权利要求18所述的设备，其特征在于，所述光场控制光阑为透射光阑或反射光 阑。24. 根据权利要求15所述的设备，其特征在于，所述设备还包括用于放置待测动物的样 品平移台，所述光路控制系统包括二向色镜、物镜组、转向反射镜和成像透镜组，所述荧光 探测器包括ICCD和/或成像光谱仪，所述光场分布器带有电控平移台；飞秒激光器发出的激 光经光场分布器的调节和聚焦控制后经过二向色镜的反射，形成飞秒激发光束照在样品平 移台上的待测动物的待测部位上;所述飞秒激发光束在光场分布器的电控平移台驱动下扫 描激发待测部位的不同位置;拍摄像场与样品之间的位置改变通过样品平移台驱动样品移 动来实现;产生的信号光透过二向色镜被物镜组收集，然后经过转向反射镜和成像透镜组 后由KXD探测，和/或，经过转向反射镜和另一成像透镜组后由成像光谱仪和另一KXD探 测 。25. 根据权利要求15所述的设备，其特征在于，所述时序控制器为可编程控制的延时发 生器，飞秒激光器输出的激光同步信号输出至延时发生器，延时发生器控制飞秒激光脉冲 与荧光探测器采集时间之间的精确延时关系;所述设备还包括样品平移台，所述光场分布 器带有电控平移台，样品平移台和光场分布器的电控平移台由平移台控制器控制;通过计 算机给延时发生器和平移台控制器设定的参数，控制成像采集的空间位置和飞秒激光照射 的具体位置;通过计算机设定参数，经快门控制器控制快门的通断，决定激光脉冲在荧光探 测器进行采集工作之前的恰当时间激发样品，并在设定的时间窗口内收集特定部位的荧光 信号。26. -种光场分布器，包括扩束部分、光场控制光阑和聚焦部分，其中：所述扩束部分为 扩束透镜组或扩束反射镜组中的至少一种;所述光场控制光阑的位置位于扩束透镜组或反 射镜组的镜片之间，或位于扩束部分和聚焦部分之间，或位于聚焦部分之后的一侧;所述聚 焦部分为透镜、透镜组、反射聚焦镜或反射聚焦镜组中的至少一种。27. 根据权利要求26所述的光场分布器，其特征在于，所述扩束部分为由凹透镜和凸透 镜组成的扩束透镜组;光场控制光阑位于扩束透镜组的两片透镜之间；所述聚焦部分为柱 面凸透镜，位于所述扩束透镜组的凸透镜之后;所述扩束透镜组、光场控制光阑和柱面凸透 镜置于电控平移台上。28. 根据权利要求26所述的光场分布器，其特征在于，所述光场控制光阑为曲线形光阑 和带状光阑中的至少一种，所述带状光阑包括条带形光阑和环带形光阑。29. 根据权利要求28所述的光场分布器，其特征在于，所述曲线形光阑的光透过或光反 射区域为两条曲线和两条直线围成的区域，所述曲线的形状根据将光功率密度呈高斯分布 的飞秒激光束变化为线形平场飞秒激光束的需要计算获得;所述条带形光阑由一个具有两 条直边的阻止或减弱光透过或光反射的区域将所述曲线形光阑分隔成两个具有光透过或 光反射性能的条带区域;所述环带形光阑的光透过或光反射区域呈环形带状，内环中的区 域为阻止或削弱光透过或光反射的区域。
【文档编号】A61B5/00GK105891170SQ201610078236
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年2月4日
【发明人】王远, 付利民, 张建平, 杨文云, 文学, 刘禹辰
【申请人】北京大学, 中国人民大学