基于多层胶体晶体的生物分子检测方法
【专利摘要】本发明基于多层胶体晶体的生物大分子检测方法是用于生物样品中进行生物大分子检测的一种简单、方便的高通量检测的方法，生物分子检测的过程中，以多层胶体晶体膜作为流动载体的生物大分子检测方法如下：第一步，多层胶体晶体膜与的制备；第二步，核酸或蛋白探针分子在多层胶体晶体膜上的固定；第三步，目标分子的杂交；第四步，目标分子的识别：利用光纤光谱仪确定多层胶体晶体膜的反射谱带以此来识别生物分子的种类，然后根据目标分子上的荧光信号或光吸收度来确定目标分子的存在与否。本发明杂交速度快，成本低廉，是一种简单快速的高通量生物检测方法。
【专利说明】
基于多层胶体晶体的生物分子检测方法
技术领域
[0001 ] 本发明是用于生物样品中进行生物大分子检测的一种简单、方便的高通量检测的方法。可以广泛应用于临床诊断与检测、药物筛选，环境中微生物样品的检测、法医鉴定、海关农产品进出口检验检疫、基因序列以及功能分析、微生物分形、动植物育种等领域。
【背景技术】
[0002]随着基因组时代和后基因组时代的到来，高通量的基因检测和蛋白质的检测技术以日益成为这一生命科学基础研究的基本手段和工具。高通量生物分子的平行检测能够高效率的发现新的功能基因和蛋白质组，广泛的应用于新的功能基因的克隆，表达以及蛋白质组的研究中，而且在开发新的药物、临床检测以及动植物检疫中都有广泛的应用前景。目前在高通量生物大分子的检测中，主要依靠的是以玻璃片等为载体依靠位置编码的生物芯片和以荧光微球为流动载体液相芯片技术，但这两种技术都存在一定的缺陷，生物芯片技术虽然编码量大，大需要昂贵的点样系统，并且杂交速度慢；而液相芯片技术以荧光微球为载体，采用动态杂交技术，但由于技术上的问题，编码量小。建立杂交速度快并且编码量大的高通量生物大分子检测技术的平台从而推动生命科学研究的进步是急待解决地问题。我们提出了以胶体晶体胶体晶体作为流动载体作为生物检测中大分子的身份标识，从而有望使上述问题得到解决。
[0003]胶体晶体是光子晶体的一种。胶体晶体中球形粒子的周期排列会形成光带隙结构从而控制光在其中的传播。在胶体晶体中，具有和光带隙相同频率的光无法被传播。这些入射光将被胶体晶体反射。在反射光谱上，胶体晶体的光带隙表现为一个很强的反射峰。反射峰的位置随光带隙而变化。相对于其它种类的具有三维有序结构的胶体晶体来说，胶体晶体具有制备简便，容易在大面积范围内成膜等优点。我们将利用胶体晶体的这一光学特性实现对流动载体的编码。基本原理如下:首先在不同的胶体晶体载体上修饰不同种类的探针分子，由于光带隙的位置随组成胶体晶体的球形粒子的大小而变化，因此在任何一种胶体晶体载体上固定的生物分子的种类都可以通过测定光带隙位置来确定。在检测时，将探针分子修饰过的胶体晶体载体与含荧光标记过的目标分子的检测液混合，在探针分子和目标分子反应后，探针分子的种类通过胶体晶体小板的反射光谱确定，而目标分子的存在与否则通过荧光光谱确定。在这一阶段的研究中我们还需对现有光学仪器进行改进，使其可同时对反射光谱和荧光进行检测.
【发明内容】
[0004]技术问题:本发明是一种用来进行生物大分子高通量平行检测的方法。采用多层胶体晶体膜代替荧光微球作为流动载体并为固定其上的某种探针编码。杂交之后，根据胶体晶体膜的特征反射谱来确定探针的种类，根据杂交信号的有无来确定目标分子的存在与否。本发明杂交速度快，成本低廉。是一种简单快速的高通量生物检测方法。
[0005]技术方案:本发明的基于多层胶体晶体的生物大分子检测方法在生物分子检测的过程中，以多层胶体晶体膜作为流动载体的生物大分子检测方法如下:
[0006]第一步，多层胶体晶体膜与的制备:底层聚二甲基硅氧烷膜经表面亲水处理后，组装底层胶体晶体膜，底层胶体晶体膜上覆盖中间层聚二甲基硅氧烷膜，中间层聚二甲基硅氧烷膜上又组装有顶层胶体晶体膜，顶层胶体晶体膜上覆盖有顶层聚二甲基硅氧烷膜；顶层胶体晶体膜经亲水处理之后，再组装胶体晶体，然后再覆盖聚二甲基硅氧烷膜，则形成三层的光子晶体膜，依次重复以上的过程，则可形成四层，五层胶体晶体膜，组成每层胶体晶体膜的胶体粒子的粒径不同，每层胶体晶体膜的特征反射谱不同，多层胶体晶体膜中层与层之间采用不同的反射谱的组合作为生物大分子的编码；
[0007]第二步，核酸或蛋白探针分子在多层胶体晶体膜上的固定:核酸或蛋白探针固定在底层聚二甲基硅氧烷膜的下表面与顶层聚二甲基硅氧烷膜的上表面，紫外臭氧或等离子体处理后的PDMS表面产生羟基，然后利用硅烷试剂将探针分子与多层胶体晶体膜偶联在一起，不同反射谱带的多层胶体晶体固定不同的探针分子，从而利用多层胶体晶体膜的特征反射谱带实现对生物大分子的编码；
[0008]第三步，目标分子的杂交:目标分子在生物样品中经过前处理以后标上荧光或者酶，然后与固定在不同多层胶体晶体上的探针分子杂交，目标分子中不同的核酸或蛋白特异在不同探针分子上；
[0009]第四步，目标分子的识别:利用光纤光谱仪确定多层胶体晶体膜的反射谱带以此来识别生物分子的种类，然后根据目标分子上的荧光信号或光吸收度来确定目标分子的存在与否。
[0010]采用多层胶体晶体膜的特征反射谱对生物大分子进行编码的方法为，组成多层胶体晶体的每层胶体晶体都有特征反射峰，利用多层胶体晶体中每层胶体晶体反射峰的不同组合对生物大分子编码，实现编码量的扩大。
[0011]底层聚二甲基硅氧烷膜，中间层聚二甲基硅氧烷膜，顶层聚二甲基硅氧烷膜可由聚苯乙烯，或聚甲丙烯酸甲酯替代。底层胶体晶体膜，顶层胶体晶体膜中的胶体晶体是聚苯乙烯胶体晶体，或聚甲丙烯酸甲酯胶体晶体，或二氧化硅胶体晶体。探针固定在底层聚二甲基硅氧烷膜的下表面与顶层聚二甲基硅氧烷膜的上表面时采用的是紫外臭氧或等离子体后的硅烷化反应作为固定生物大分子的方法。
[0012]本发明用胶体晶体膜作为流动载体，在其上固定生物大分子探针，将靶物质与大分子杂交。洗脱之后，利用反射光纤光谱仪测定胶体晶体膜的特征反射光谱，作为识别生物探针分子的标识。然后检测杂交到生物探针上的信号(例如荧光信号、化学发光的信号，电化学信号等)，根据杂交信号的有无来确定目标分子的存在与否。
[0013]1.胶体晶体膜的制备:具有特征反射谱的胶体晶体膜按结构可分为蛋白石型(由粒子排列构成)和反蛋白石(反蛋白石结构)两种。下面具体说明3种膜的制备。
[0014](I)单层聚合物胶体晶体膜的制备:按10: I: 10的比例将PDMS (聚二甲基硅氧烷)前聚体、固化剂、正己烷混合在一起，灌注在玻璃基底或者硅基底上，高温固化。固化后的PDMS表面进行亲水化处理(紫外臭氧处理，然后利用带不饱和键的硅烷试剂处理，再进行接枝反应；或在紫外光下直接引发接枝反应；氧等离子体处理)。将不同粒径的聚苯乙烯胶体晶体利用溶剂挥发法或者垂直提拉法自组装在PDMS膜上。然后按5: I: 5的比例将PDMS前聚体、固化剂、正己烷混合在一起，灌注在胶体晶体膜上，静致过夜，然后将其固化。
[0015](2)多层聚合物胶体晶体膜(本方法以双层聚合物胶体晶体膜为例)的制备:按10: I: 10的比例将PDMS前聚体、固化剂、正己烷混合在一起，灌注在玻璃基底或者硅基底上，高温固化。固化后的底层PDMS表面进行亲水化处理(紫外臭氧处理，然后利用带不饱和键的硅烷试剂处理，再进行接枝反应；或在紫外光下直接引发接枝反应；氧等离子体处理)。将某一粒径的胶体晶体(PS胶体晶体，PMMA胶体晶体，二氧化硅胶体晶体等)利用溶剂挥发法或者垂直提拉法自组装在PDMS膜上，形成底层胶体晶体膜。然后按5: I: 5的比例将PDMS前聚体、固化剂、正己烷混合在一起，灌注在胶体晶体膜上，静置过夜，然后将其固化，形成中间层PDMS膜。将中间层PDMS膜用同样的方法进行亲水化处理，将另一种粒径的胶体晶体或相同粒径的不同胶体晶体用自组装在中间层PDMS膜上，形成顶层胶体晶体膜。按10:1: 10的比例将PDMS前聚体、固化剂、正己烷混合在一起，灌注在胶体晶体膜上，静置过夜，然后将其固化，形成顶层PDMS膜。
[0016]2.探针的固定=(I)PDMS单层和多层胶体晶体膜的固定方法如下:紫外臭氧处理PDMS膜，APTES与PDMS膜反应，通过戊二醛将氨基修饰的核酸探针或抗原、抗体结合在PDMS膜上。
[0017]3.目标分子的杂交:经提纯、扩增后并有可识别标记的目标分子与固定在不同膜上的不同探针分子混合后，震荡加速杂交。
[0018]4检测.利用反射光谱仪检测胶体晶体膜的反射光谱，来确定探针分子的种类。利用荧光显微镜或者分光光度记分别检测荧光标记或化学发光标记的目标分子，然后根据信号的有无来确定目标分子的存在与否。
[0019]有益效果:本发明利用胶体晶体对生物分子进行编码，从而能够实现目标分子检测时的动态杂交反应，该方法简单易行。
[0020]1、用胶体晶体替代荧光微球进行编码降低了编码物质的制作成本，并且简化了检测仪器，降低了检测成本。
[0021]2.胶体晶体编码相比较于荧光微球编码而言，胶体晶体呈现的颜色是结构色，性质稳定，而荧光微球易发生光漂白，
[0022]3.胶体晶体反射光谱窄，并且可以利用多层胶体晶体膜不同反射谱的组合扩大编码量。理论上可编码上万种生物分子，而荧光微球目前只能编码上百种生物分子。
[0023]4.胶体晶体作为流动载体的一种，与平板芯片相比较，能加快杂交反应速度，从而提闻检测的效率。
【附图说明】
[0024]图1是多层胶体晶体膜的制备以及探针固定与杂交流程图。
[0025]图2是是多层胶体晶体膜(以双层胶体晶体膜为例)的结构以及探针固定与杂交后的不意图。
[0026]以上的图中有底层PDMS膜1、底层胶体晶体膜2、中间层PDMS膜3、顶层胶体晶体膜4、顶层PDMS膜5、探针6、目标分子7。
【具体实施方式】
[0027]图1是多层胶体晶体膜的制备以及探针固定与杂交流程图:第一步是底层PDMSl在玻璃片或者硅片上的灌注，固化后，从玻璃片上剥离下来.第二步为底层PDMS膜的制备与表面改性，第三步为胶体晶体2在底层PDMS膜的自组装，第四步为顶层PDMS3的灌注与固化，重复第二步致第四步，然后形成二层胶体晶体膜，重复二次形成三层胶体晶体膜，依次类推，第五步是探针的固定，第六步是目标分子的杂交。
[0028]图2是是多层胶体晶体膜(以双层胶体晶体膜为例)的结构以及探针固定与杂交后的图:底层PDMS膜I上组装有底层胶体晶体膜2，底层胶体晶体膜2上覆盖中间层PDMS膜3，中间层PDMS膜上又组装有顶层胶体晶体膜4，顶层胶体晶体膜4上覆盖有顶层PDMS膜5，探针6固定在底层PDMS膜I的下表面与顶层PDMS膜5的上表面，杂交后，目标分子7结合在探针分子6上。
[0029]多种反射谱的多层胶体晶体膜的制备(以具有两种反射谱的双层胶体晶体膜为例)以及探针的固定与杂交:
[0030](I)具有多种反射谱的多层胶体晶体膜的制备(以具有两种反射谱的胶体晶体膜为例):按10: I: 10的质量比例将PDMS(聚二甲基硅氧烷)前聚体、固化剂、正己烷混合在一起，灌注在玻璃基底或者硅基底上，高温固化。固化后的底层PDMSl表面进行亲水化处理(紫外臭氧处理，使表面的-CH3转化为-OH ;或者紫外臭氧处理之后产生羟基，然后利用带不饱和键的硅烷试剂与之反应，再用引发剂引发丙稀酸等的接枝反应；或在紫外光下直接引发接枝反应；氧等离子体处理产生羟基，或者硅烷化反应之后再产生亲水化结果。)。将某一粒径的胶体晶体(聚苯乙烯胶体晶体，聚甲基丙稀酸甲酯胶体晶体，二氧化硅胶体晶体等)自组装在PDMS膜上，形成底层胶体晶体膜2。然后按5: I: 5的比例将PDMS前聚体、固化剂、正己烷混合在一起，灌注在胶体晶体膜上，静置过夜，然后将其固化，形成中间层PDMS膜3。将中间层PDMS膜3用同样的方法进行亲水化处理，将另一种粒径的胶体晶体或相同粒径的不同胶体晶体用溶剂挥发法或者垂直提拉法自组装在中间层PDMS膜上，形成顶层胶体晶体膜4。按10:1: 10的比例将PDMS前聚体、固化剂、正己烷混合在一起，灌注在胶体晶体膜上，静置过夜，然后将其固化，形成顶层PDMS膜5。
[0031](II)探针的固定:双层胶体晶体膜的固定方法如下:紫外臭氧或等离子体处理PDMS膜，APTES与PDMS膜反应，通过戊二醛将探针6 (氨基修饰的核酸或抗原、抗体)结合在底层PDMS膜I的小表面和顶层PDMS膜5的上表面上.
[0032](III)目标分子的杂交:经提纯、扩增后并有可识别标记的目标分子7与固定在不同膜上的不同探针分子混合后，震荡加速杂交。
[0033](IV)检测.利用反射光谱仪检测胶体晶体膜的两种反射光谱，来确定探针分子的种类。利用荧光显微镜或者分光光度记分别检测荧光标记或化学发光标记的目标分子，然后根据信号的有无来确定目标分子的存在与否。
【主权项】
1.一种基于多层胶体晶体的生物大分子检测方法，其特征在于生物分子检测的过程中，以多层胶体晶体膜作为流动载体的生物大分子检测方法如下: 第一步，多层胶体晶体膜与的制备:底层聚二甲基硅氧烷膜(I)经表面亲水处理后，组装底层胶体晶体膜(2)，底层胶体晶体膜(2)上覆盖中间层聚二甲基硅氧烷膜(3)，中间层聚二甲基硅氧烷膜上又组装有顶层胶体晶体膜(4)，顶层胶体晶体膜(4)上覆盖有顶层聚二甲基硅氧烷膜(5);顶层胶体晶体膜经亲水处理之后，再组装胶体晶体，然后再覆盖聚二甲基硅氧烷膜，则形成三层的光子晶体膜，依次重复以上的过程，则可形成四层，五层胶体晶体膜，组成每层胶体晶体膜的胶体粒子的粒径不同，每层胶体晶体膜的特征反射谱不同，多层胶体晶体膜中层与层之间采用不同的反射谱的组合作为生物大分子的编码； 第二步，核酸或蛋白探针分子在多层胶体晶体膜上的固定:核酸或蛋白探针￠)固定在底层聚二甲基硅氧烷膜(I)的下表面与顶层聚二甲基硅氧烷膜(5)的上表面，紫外臭氧或等离子体处理后的PDMS表面产生羟基，然后利用硅烷试剂将探针分子与多层胶体晶体膜偶联在一起，不同反射谱带的多层胶体晶体固定不同的探针分子，从而利用多层胶体晶体膜的特征反射谱带实现对生物大分子的编码； 第三步，目标分子的杂交:目标分子(7)在生物样品中经过前处理以后标上荧光或者酶，然后与固定在不同多层胶体晶体上的探针分子(6)杂交，目标分子(7)中不同的核酸或蛋白特异在不同探针分子(6)上； 第四步，目标分子的识别:利用光纤光谱仪确定多层胶体晶体膜的反射谱带以此来识别生物分子的种类，然后根据目标分子(7)上的荧光信号或光吸收度来确定目标分子的存在与否。2.如权利要求1所述的基于多层胶体晶体的生物大分子检测方法，其特征在于采用多层胶体晶体膜的特征反射谱对生物大分子进行编码的方法为，组成多层胶体晶体的每层胶体晶体都有特征反射峰，利用多层胶体晶体中每层胶体晶体反射峰的不同组合对生物大分子编码，实现编码量的扩大。3.如权利要求1所述的基于多层胶体晶体的生物大分子检测方法，其特征在于底层聚二甲基硅氧烷膜(I)，中间层聚二甲基硅氧烷膜(3)，顶层聚二甲基硅氧烷膜(5)可由聚苯乙烯，或聚甲丙烯酸甲酯替代。4.如权利要求1所述的基于多层胶体晶体的生物大分子检测方法，其特征在于底层胶体晶体膜(2)，顶层胶体晶体膜(4)中的胶体晶体是聚苯乙烯胶体晶体，或聚甲丙烯酸甲酯胶体晶体，或二氧化硅胶体晶体。5.如权利要求1所述的基于多层胶体晶体的生物大分子检测方法，其特征在于探针(6)固定在底层聚二甲基硅氧烷膜(I)的下表面与顶层聚二甲基硅氧烷膜(5)的上表面时采用的是紫外臭氧或等离子体后的硅烷化反应作为固定生物大分子的方法。
【文档编号】G01N21/31GK105891166SQ201410666174
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年11月8日
【发明人】何飞, 林向杨
【申请人】重庆市丹青生物技术有限公司