一种双光子显微镜的制作方法
【专利摘要】本发明实施例涉及光学【技术领域】，公开了一种双光子显微镜。其中，所述显微镜包括第一分光元件、第二分光元件、反射元件、第一透镜、第二透镜、第三透镜、二向色镜、物镜、载物台和光电倍增管，其中：入射脉冲光束在依次经过所述第一分光元件和第二分光元件后入射到所述反射元件上，并在由所述反射元件反射后依次经过所述第一透镜、第二透镜、二向色镜和物镜入射到所述载物台；所述入射脉冲光束在所述载物台上的样品上激发的荧光由所述物镜收集后射向所述二向色镜，并由所述二向色镜反射后经过所述第三透镜射向所述光电倍增管。通过本发明实施例，能够对样品进行空间和时间同时聚焦的点扫描成像，增加成像探测深度。
【专利说明】—种双光子显微镜【技术领域】
[0001]本发明涉及光学【技术领域】，具体涉及一种双光子显微镜。
【背景技术】
[0002]在生物活体组织荧光成像领域中，双光子显微镜已成为一种必不可少的成像工具。相比单光子技术而言，其最重要的一个优点是能够对组织样品进行高分辨成像。由于双光子显微镜对散射生物样品具有亚细胞的分辨率，使得该种显微镜成为目前最受欢迎的显微成像技术之一，然而，目前该种显微镜的探测深度受限。随着成像深度的增加，由于样品组织对光的吸收和散射作用，入射激光功率会呈现指数的衰减，使得焦点处的信号减弱，非焦点处的噪声增强，从而导致成像的信噪比(即焦点处的信号与焦点外的噪声的比值)变差。经过某一特定深度后，焦点外的背景噪声最终会超过焦点信号，此时无法再分辨信号与噪声，这个深度即为该成像装置的极限探测深度。因此，提高成像信噪比是增加探测深度的关键。
[0003]现有技术之一是利用宽场脉冲场在样品中传播时，其脉冲周期随深度的增加而改变的特性，使脉冲在到达焦平面时具有最短的脉冲周期，从而在焦平面产生较强的信号并同时抑制了焦平面以外的背景噪声。该技术实现了带有光学切片(optical section)能力的宽场双光子显微成像功能，提高了双光子显微成像的速度。但是，由于组织的散射作用，这种宽场成像(面扫描)技术相比普通点扫描的双光子显微镜来说，其空间分辨随着成像深度的恶化程度更严重，所以这种技术并不能真正的增加成像深度。
[0004]现有技术之二是借助双棱镜光栅实现入射光脉冲在X-Z平面进行时间聚焦，而在与之相垂直的Y-Z平面实现空间聚集，从而使光脉冲在成像焦平面处形成经过时间聚焦的线，该种成像方法配合扫描振镜可以实现二维双光子显微成像。这种技术虽然可在一定程度上提高成像深度，但是只能将入射光脉冲聚焦成一条线，然后通过线扫描的方式来获得图像，这样的设计不可避免地 降低了图像的横向分辨率，造成图像的模糊，所以对实际成像深度的提闻非常有限。
【发明内容】
[0005]本发明实施例公开了一种双光子显微镜，能够对样品进行空间和时间同时聚焦的点扫描成像，增加成像探测深度。
[0006]本发明实施例提供一种双光子显微镜，所述显微镜包括第一分光元件、第二分光元件、反射元件、第一透镜、第二透镜、第三透镜、二向色镜、物镜、载物台和光电倍增管，其中:
[0007]入射脉冲光束在依次经过所述第一分光元件和第二分光元件后入射到所述反射元件上，并在由所述反射元件反射后依次经过所述第一透镜、第二透镜、二向色镜和物镜入射到所述载物台；
[0008]所述入射脉冲光束在所述载物台上的样品上激发的荧光由所述物镜收集后射向所述二向色镜，并由所述二向色镜反射后经过所述第三透镜射向所述光电倍增管。
[0009]在上述双光子显微镜中，所述第一分光元件和第二分光元件分别为光栅，所述第一分光元件和第二分光元件相对错开平行设置，以使所述入射脉冲光束在依次经过所述第一分光兀件和第二分光兀件后产生分光，形成衍射平行脉冲光束。
[0010]在上述双光子显微镜中，所述第一分光兀件和第二分光兀件分别为分光棱镜，所述第一分光元件的一边和第二分光元件的一个边相对平行设置，以使所述入射脉冲光束在依次经过所述第一分光兀件和第二分光兀件后产生分光，形成衍射平行脉冲光束。
[0011]在上述双光子显微镜中，所述反射元件为振镜。
[0012]在上述双光子显微镜中，所述物镜为可沿着入射光路移动的移动物镜。
[0013]在上述双光子显微镜中，所述反射元件为固定的反射镜。
[0014]在上述双光子显微镜中，所述载物台为三维平移台。
[0015]在上述双光子显微镜中，所述第一透镜为扫描透镜。
[0016]在上述双光子显微镜中，所述第二物镜为镜筒透镜。
[0017]在上述双光子显微镜中，所述第三物镜为收集透镜。
[0018]本发明实施例中，入射脉冲光束在依次经过所述第一分光兀件和第二分光兀件后入射到所述反射元件上，形成衍射平行光，并在由所述反射元件反射后依次经过所述第一透镜、第二透镜、二向色镜和物镜，最终聚焦入射到所述载物台；所述入射脉冲光束在所述载物台上的样品上激发的荧光由所述物镜收集后射向所述二向色镜，并由所述二向色镜反射后经过所述第三透镜射向所述光电倍增管。由于第一分光元件和第二分光元件的分光作用，入射光脉冲将产生分光，不同波长的光占据光束的不同位置，形成衍射平行光脉冲，使得在到达物镜焦点前，入射脉冲宽度将展宽，只有在物镜焦点处所有波长才重叠聚焦，根据光谱宽度与脉冲长度的傅里叶变换关系，入射脉冲在焦点处具备最短脉冲，从而实现入射光脉冲的时间聚焦。此外，由于物镜对入射脉冲光的空间聚焦作用，继而能够对样品进行空间和时间同时聚焦的点扫描成像，增加成像探测深度。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020]图1是本发明实施例提供的一种双光子显微镜的结构示意图；
[0021]图2是本发明实施例提供的入射光束经过双光子显微镜中的两个分光棱镜时的光路不意图；
[0022]图3是本发明实施例提供的入射脉冲光信号在整个双光子显微镜系统中受脉冲周期调制和脉冲宽度调制的变化情况示意图；
[0023]图4是本发明实施例提供的另一种双光子显微镜的结构示意图。
【具体实施方式】
[0024]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0025]本发明实施例公开了一种双光子显微镜，能够对样品进行空间和时间同时聚焦的点扫描成像，增加成像探测深度。以下实施例分别进行详细说明。
[0026]请参阅图1，图1示出了本发明实施例提供的双光子显微镜的结构示意图。该双光子显微镜包括第一分光兀件1、第二分光兀件2、反射兀件3、第一透镜4、第二透镜5、第三透镜9、二向色镜6、物镜7、载物台8和光电倍增管10，其中:
[0027]在实施方式中,第一分光兀件I和第二分光兀件2为光栅，当然，在其它实施方式中，第一分光兀件I和第二分光兀件2还可以是其它分光兀件,例如，分光棱镜。当第一分光元件I和第二分光元件2为光栅时，如图1所示，第一分光元件I和第二分光元件2可相对错开平行设置，入射平行脉冲光束①入射到第一分光元件I后形成脉冲衍射光束②，光束②进一步入射到第二分光元件2后，由于光路的可逆性，光束②经第二分光元件2反射后将变为衍射平行脉冲光束③，光束③中不同波长的光λ i~λη占据不同的位置；当第一分光兀件I和第二分光兀件2为分光棱镜时,如图2所不,入射平行脉冲光束①透过第一分光元件I后形成脉冲衍射光束②，光束②进一步透过第二分光元件2后形成衍射平行脉冲光束③，光束③中不同波长的光X1~λη占据不同的位置。
[0028]光束③由反射元件3反射后依次经过第一透镜4、第二透镜5、二向色镜6和物镜7入射到载物台8上。具体地,反射元件3为振镜,作为一种优选的实施方式,反射元件3为扫描振镜，光束③由反射元件3反射后转变为光束④，光束④经过第一透镜4后变为光束⑤，光束⑤经过第二透镜5后变为光束⑥，即光束④经过第一透镜4和第二透镜5扩束后形成平行脉冲光束⑥，第一透镜4可以为扫描透镜，第二透镜5可以为镜筒透镜，光束⑥透过二向色镜6和物镜7后转变为光束⑦聚焦到位于物镜7的焦平面处的载物台8上；由于第一分光元件I和第二分光元件2的分光作用，光束③将是一束衍射平行光束，不同波长的光入工~λη将占据不同的位置，根据光`学成像原理，入射到第一分光元件I上的脉冲光将同时到达物镜7的焦平面，形成与入射脉冲光相同脉冲宽度的焦点光，然而在光脉冲到达物镜7的焦平面前的任何一点，由于不同衍射光K~入?经历的路径不同，将形成一个更长周期的脉冲光，同理，在光脉冲经过物镜7的焦平面之后的任何一点，同样会形成一个较长脉冲周期的脉冲光；图3示出了入射光束①在整个系统中脉冲周期调制和脉冲宽度调制的变化情况，其中，①I示出入射光脉冲①I示的时间周期和空间宽度，⑦代表光束⑦的时间周期和空间宽度，其它图样分别代表受第一分光元件1、第二分光元件2、反射元件3、、第一透镜
4、第二透镜5和物镜7作用下入射光脉冲的变化；借助这样的光焦点调制方法，可以有效的降低非焦点处样品组织的荧光辐射概率，增强荧光辐射信号的信噪比。
[0029]光束⑦在载物台8上的样品上激发的荧光由物镜7收集后射向二向色镜6，并由二向色镜6反射后经过第三透镜9射向光电倍增管10，其中，第三透镜9可以为收集透镜。在本实施方式中，整个双光子显微镜可由反射元件3进行栅格扫描形成二维图像，且由于物镜7为可沿着入射光路移动的移动物镜，可进一步通过物镜7形成三维扫描，即物镜7可沿着反射元件3、第一透镜4、第二透镜5、二向色镜6和物镜7顺次排列的方向纵向移动，并配合反射元件3 (振镜)的栅格扫描，从而形成样品的三维扫描图像。
[0030]请参阅图4，图4示出了本发明实施例提供的另一种双光子显微镜的结构示意图。该双光子显微镜包括如图1所不的第一分光兀件1、第二分光兀件2、第一透镜4、第二透镜
5、第三透镜9、二向色镜6、物镜7、载物台8和光电倍增管10，故这些部件在此不再赘述，所不同的是，图4中的发射元件32为反射镜，进一步，反射元件32为静止的反射镜，再者，载物台82为三维平移台，因此，图4所示的实施例与图1所示的实施例的不同之处在于三维成像方式的不同，图4中的实施例采用的是通过载物台82的移动来进行三维成像。
[0031]本发明实施例提供了一种空间和时间相结合的焦点调制扫描成像技术，可用于厚样品组织的成像，本发明实施例提供的双光子显微镜的核心在于，不仅在空间上有聚焦，在时间上也存在一个聚焦过程，可通过引入空间频率分布(不同波长的光占据光束的不用位置)，使得只有在物镜焦点处所有波长才重叠，并根据光谱宽度与脉冲长度的傅里叶变换关系，确保只有在焦点处才具备最短脉冲，从而实现时间和空间的同时聚焦，而且，通过点扫描成像来获得图像，相比宽场扫描以及线扫描来说，减少了同一光学切片面成像时由于组织散射造成的成像模糊作用，在确保图像高分辨率的同时，真正提高成像探测深度。
[0032]以上对本发明实施例所提供的双光子显微镜进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在【具体实施方式】及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
【权利要求】
1.一种双光子显微镜，其特征在于，所述显微镜包括第一分光兀件、第二分光兀件、反射元件、第一透镜、第二透镜、第三透镜、二向色镜、物镜、载物台和光电倍增管，其中: 入射脉冲光束在依次经过所述第一分光元件和第二分光元件后入射到所述反射元件上，并在由所述反射元件反射后依次经过所述第一透镜、第二透镜、二向色镜和物镜入射到所述载物台； 所述入射脉冲光束在所述载物台上的样品上激发的荧光由所述物镜收集后射向所述二向色镜，并由所述二向色镜反射后经过所述第三透镜射向所述光电倍增管。
2.根据权利要求1所述的双光子显微镜，其特征在于，所述第一分光兀件和第二分光元件分别为光栅，所述第一分光元件和第二分光元件相对错开平行设置，以使所述入射脉冲光束在依次经过所述第一分光兀件和第二分光兀件后产生分光，形成衍射平行脉冲光束。
3.根据权利要求1所述的双光子显微镜，其特征在于，所述第一分光兀件和第二分光元件分别为分光棱镜，所述第一分光元件的一边和第二分光元件的一个边相对平行设置，以使所述入射脉冲光束在依次经过所述第一分光兀件和第二分光兀件后产生分光，形成衍射平行脉冲光束。
4.根据权利要求1?3中任一项所述的双光子显微镜，其特征在于，所述反射元件为振镜。
5.根据权利要求4所述的双光子显微镜，其特征在于，所述物镜为可沿着入射光路移动的移动物镜。
6.根据权利要求1?3中任一项所述的双光子显微镜，其特征在于，所述反射元件为固定的反射镜。
7.根据权利要求6所述的双光子显微镜，其特征在于，所述载物台为三维平移台。
8.根据权利要求1?3中任一项所述的双光子显微镜，其特征在于，所述第一透镜为扫描透镜。
9.根据权利要求8所述的双光子显微镜，其特征在于，所述第二物镜为镜筒透镜。
10.根据权利要求9所述的双光子显微镜，其特征在于，所述第三物镜为收集透镜。
【文档编号】G02B21/24GK103558193SQ201310507178
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月24日 优先权日:2013年10月24日
【发明者】郑炜, 许强, 杨守胜 申请人:深圳先进技术研究院