专利名称：Egfr外显子19多态性检测试验用寡核苷酸及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸及其用途。
背景技术：
表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor EGFR)被认为在肺癌中起重要的作用，并且在肺癌治疗领域中使用着以抑制EGFR的功能为目的的药剂。作为这样的药剂，已知非小细胞肺癌患者的治疗中使用的吉非替尼或厄洛替尼等EGFR酪氨酸激酶抑制剂，除肺癌之外正尝试将这些药剂应用于腺癌。但是，在某些范围的患者中，有时不能充分获得EGFR酪氨酸激酶抑制剂的效果。另外，在另一范围的患者中，有时虽然对EGFR酪氨酸激酶抑制剂初期具有反应，但是随后药剂不能达到所期待的或者更好的效果。
因此，在使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂时，为了预测其效果而尝试探索了预测因素，并发现了 EGFR基因突变是重要的因素(非专利文献1、2)。作为与药剂的感受性相关的突变，例如，已知EGFR的第790位和第858位的取代突变、EGFR基因的外显子19中的缺失突变等(非专利文献1、2)。尤其是，所述EGFR基因的外显子19中的缺失突变已知有在所述外显子19中缺失连续数个碱基 十几个碱基的多个突变型。另一方面，近年来，作为检测基因多态性的检测试验，进行着利用熔解曲线分析(Tm分析)的检测。在该方法中，在通过PCR法扩增含有突变的区域之后，使用被荧光染料标记了的核酸探针进行熔解曲线分析，并基于熔解曲线分析的结果来分析碱基序列的突变(例如，参见专利文献I)。另外，作为简便且灵敏度和可靠性优良的多态性检测方法，已知一种多态性检测方法，包括在同一反应体系中使用突变型引物和野生型(正常型)引物来优先扩增含有突变型碱基的核酸序列(参见专利文献2)。现有技术文献专利文献专利文献I :日本专利特开2002-119291号公报专利文献2 :国际公开第2010/001969号小册子非专利文献非专利文献I PLoS Medicine，2005 年，Vol. 2，No. 3，ρ· 225-235非专利文献2 :Journal of Clinical Oncology, 2005 年，Vol. 23, No. 11，p. 2513-2520
发明内容
发明要解决的问题但是，EGFR外显子19的突变中如上所述存在各种突变。因此，在使用针对每个突变的引物的检测试验中，需要在反应液中含有许多对突变型特异的引物。制作许多弓I物存在设计变复杂的可能性，另外，同时使用多个引物有可能导致PCR反应本身不能进行。另夕卜，在存在多个突变的情况下，若没有含有充分比率的突变则有时无法检测。因此，本发明的目的在于提供一种为了在检测EGFR外显子19的多态性的检测试验中简便且灵敏度良好地检测相应多态性而有用的多态性检测试验用寡核苷酸及其用途。解决问题的手段本发明为如下所述。[I] 一种EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸，其为从包括下述(Pl)和(P’ )的组中选择的至少一种寡核苷酸 (PD寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且其相对于含有序列编号I所示的碱基序列的至少第115位 第123位碱基的碱基长9 80的碱基序列具有至少80%以上的同一'丨生；以及(ΡΓ )寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且其与含有序列编号I所示的碱基序列的至少第115位 第123位碱基的碱基长9 80的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交。[2]根据[I]所述的多态性检测试验用寡核苷酸，所述多态性检测试验用寡核苷酸为从包括能够与EGFR外显子19的碱基序列杂交的下述(P2)和(P2’ )的组中选择的至少一种寡核苷酸(P2)寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且其相对于含有序列编号I所不的喊基序列的至少第104 123位喊基的喊基长20 80的喊基序列具有至少80%以上的同一性；以及(P2’ )寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且其与含有序列编号I所示的碱基序列的至少第104位 第123位碱基的碱基长20 80的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交。[3]根据[2]所述的多态性检测试验用寡核苷酸，其中，所述(P2)或(P2’ )的寡核苷酸在从5’末端起数第I 3位的位置具有与所述第104位的碱基对应的碱基。[4]根据[2]所述的多态性检测试验用寡核苷酸，其中，所述(P2)或(P2’ )寡核苷酸在5’末端具有与所述第104位的碱基对应的碱基。[5]根据[I] [4]中任一项所述的多态性检测试验用寡核苷酸，其中，所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基长为25 50。[6]根据[I] [4]中任一项所述的多态性检测试验用寡核苷酸，其中，所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基长为26 42。[7]根据[I] [6]中任一项所述的多态性检测试验用寡核苷酸，其中，所述3’末端侧的延长抑制处理为磷酸基的添加。[8]根据[I] [7]中任一项所述的寡核苷酸，其中，所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基序列上的碱基用荧光染料标记。[9] 一种多态性检测方法，用于检测EGFR外显子基因的多态性，包括使用至少一种[I] [8]中任一项所述的多态性检测试验用寡核苷酸来检测EGFR外显子19的多态性。[10]根据[9]所述的多态性检测方法，包括准备可含有具有序列编号I所示的碱基序列的单链核酸的核酸试样；使所述多态性检测试验用寡核苷酸和所述单链核酸接触，来获得含有该多态性检测试验用寡核苷酸和该单链核酸并且该单链核酸的核酸扩增被抑制的杂交体；以及对该多态性检测试验用寡核苷酸和该单链核酸接触时或者接触后的所述核酸试样进行核酸扩增。[11]根据[10]所述的多态性检测方法，其中，在能够与含有作为靶标的EGFR外显子19的多态性位点的核酸杂交的探针的存在下进行所述核酸扩增。[12]根据[11]所述的多态性检测方法，其中，所述探针相对于所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基序列具有45%以上的同一性。[13]根据[11]或12所述的多态性检测方法，其中，所述探针是在未与靶标序列杂交时发出荧光而与该靶标序列杂交时荧光强度减少的探针。[14] 一种EGFR酪氨酸激酶抑制剂的药效判定方法，包括通过[9] [13]中任一项所述的多态性检测方法来检测EGFR外显子19中的多态性；以及基于所述检测结果来判定对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的耐受性或EGFR酪氨酸激酶抑制剂的药效。 [15] 一种EGFR多态性检测试验用试剂盒，包含至少一种[I] [8]中任一项所述的多态性检测试验用寡核苷酸。[16]根据[15]所述的EGFR多态性检测试验用试剂盒，还包含能够与含有作为靶标的EGFR外显子19的多态性位点的核酸序列杂交的探针。[17]根据[16]所述的EGFR多态性检测试验用试剂盒，其中，所述探针相对于所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基序列具有45%以上的同一性。[18]根据[15] [17]中任一项所述的EGFR多态性检测试验用试剂盒，还包含能够扩增含有作为所述靶标的EGFR外显子19多态性位点的核酸序列的引物对。发明效果通过本发明，能够提供为了在检测EGFR外显子19的多态性的检测试验中简便且灵敏度良好地检测相应多态性而有用的多态性检测试验用寡核苷酸及其用途。
图I的(A)为核酸混合物的熔解曲线的示例，图I的(B)为微分熔解曲线的示例；图2的⑷ ⑶为本发明实施例I涉及的试样的熔解曲线；图3的(A) ⑶为本发明实施例2涉及的试样的熔解曲线；图4的⑷ ⑶为本发明实施例3涉及的试样的熔解曲线；图5的㈧ ⑶为本发明比较例I涉及的试样的熔解曲线；图6的㈧和⑶为本发明比较例2涉及的试样的熔解曲线；图7的⑷ ⑶为本发明比较例3涉及的试样的熔解曲线；图8的㈧和⑶为本发明比较例4涉及的试样的熔解曲线；图9的⑷ (E)为本发明实施例4涉及的试样A E的熔解曲线；图10的(A) (E)为本发明实施例4涉及的试样F J的熔解曲线；图11的(A) (E)为本发明的实施例5和比较例5涉及的试样5_1 5_5的熔解曲线。
具体实施方式
本发明涉及的EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸(以下有时仅称为“多态性检测试验用寡核苷酸”)是一种寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且是相对于含有序列编号I所不的喊基序列的至少第115位 第123位喊基的喊基长9 80的碱基序列具有相同的碱基长并且同源的序列，即是从包括下述(PD和(P’ )的组中选择的至少一种EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸。(Pl)寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且相对于含有序列编号I所不的喊基序列的至少第115位 第123位喊基的喊基长9 80的喊基序列具有至少80 %以上的同一'I"生; (ΡΓ )寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且与含有序列编号I所示的碱基序列的至少第115位 第123位碱基的碱基长9 80的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交。本发明涉及的多态性检测试验用试剂盒包含所述EGFR外显子19多态性检测试验
用寡核苷酸。本发明涉及的EGFR基因多态性检测方法包括使用至少一种所述EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸来检测EGFR外显子19的多态性。本发明涉及的EGFR酪氨酸激酶抑制剂的药效判定方法包括通过所述EGFR外显子19多态性检测方法来检测EGFR基因中的多态性；以及基于所述检测结果来判定对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的耐受性或EGFR酪氨酸激酶抑制剂的药效。通过本发明，具有相对于序列编号I所示的EGFR基因的特定的一部分具有相同的碱基长并且同源的碱基序列、即具有至少80%以上的同一性和/或可与该特定的一部分碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的序列、并且3’末端侧被进行了延长抑制处理的寡核苷酸，由于与可含有多态性的野生型EGFR外显子19的碱基序列的该一部分具有高亲和性，因此比突变型EGFR外显子19的核酸更优先并且牢固地与野生型EGFR外显子19的核酸杂交。另外，所述多态性检测试验用寡核苷酸由于3’末端侧进行了延长抑制处理，因此在与野生型EGFR基因的核酸杂交之后，即使应用DNA聚合酶也不延长。所述多态性检测试验用寡核苷酸为优选用于EGFR外显子19多态性检测试验的寡核苷酸。在将所述多态性检测试验用寡核苷酸用于EGFR基因多态性检测试验的情况下，所述多态性检测试验用寡核苷酸由于与其类似性高而与野生型EGFR基因核酸杂交。当在杂交了的野生型EGFR基因核酸和与该杂交了的区域对应的区域内含有缺失或单核苷酸多态性的突变型(多态性)EGFR基因核酸混合存在的环境下进行了核酸扩增等处理时，野生型基因的核酸序列的扩增由于多态性检测试验用寡核苷酸的存在而被抑制。另一方面，由于多态性检测试验用寡核苷酸不与突变型EGFR基因的核酸序列杂交，因此突变型EGFR基因的核酸扩增不被抑制，突变型EGFR基因的核酸序列优先扩增。结果，试样中比起野生型EGFR基因的核酸序列存在更多的突变型EGFR基因的核酸序列，从而能够高灵敏度地检测EGFR外显子19的多态性。可与所述多态性检测试验用寡核苷酸杂交的野生型EGFR基因核酸是具有序列编号I所示的碱基序列的互补序列的核酸。另外，通过本发明，由于如此能够简便且高灵敏度地检测EGFR外显子19的多态性，因此能够简便且高灵敏度地判定基于EGFR外显子19多态性的、对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的耐受性或EGFR酪氨酸激酶抑制剂的药效。
本发明的“EGFR基因”具体是指EGFR外显子19。本发明中的EGFR外显子19是已公知的，其碱基序列是指NCBI登录号No. NT_033968 (版本NT_033968. 6)的4831717 4832003的序列。序列编号I的碱基序列相应于EGFR外显子19的核酸的碱基序列的一部分。在本说明书中，特别将可与所述多态性检测试验用寡核苷酸杂交的野生型EGFR基因的碱基序列的区域称为“扩增抑制靶标区域”。在本说明书中，作为检测对象的EGFR基因的多态性中，包括在野生型EGFR基因的对应序列中缺失了由多个连续的碱基构成的区域的多态性，只要可以检测，也可以包括缺失一个碱基的多态性、碱基连续一个或者两个以上被其他的碱基取代的多态性。此外，本发明中的作为检测对象的EGFR基因的多态性只要其一部分中含有扩增抑制靶标区域，也可以同时含有两个以上的多态性。在本发明中，“多态性检测试验”是指为了检测特定的基因多态性而被使用的试验，不拘泥于试验、测定、检测方法、评价方法、判定方法等表述，意指判定核酸试样中的核 酸中是否含有具有多态性的突变型的一切行为。在本发明中，关于作为检测对象的试样中的试样核酸、多态性检测试验用寡核苷酸、引物或者探针的每个的序列，基于它们的相互互补的关系所描述的事项，只要不特别指出，也适用于各个序列和相对于各序列互补的序列。在将本发明的事项适用于相对于各序列互补的该序列时，在本领域技术人员的技术常识的范围内，由该互补的序列识别的序列，视为将说明书全体替换为与对应的本说明书中记载的序列互补的序列。在本说明书中，“模板核酸序列”意指在进行核酸扩增时被弓I物识别为模板并退火的碱基序列。在本发明中，“Tm值”是指双链核酸解离的温度(解离温度Tm)，一般定义为260nm处的吸光度达到吸光度总上升量的50%时的温度。即，当加热含有双链核酸(例如双链核酸DNA)的溶液时，260nm处的吸光度上升。这是因为双链核酸DNA中的两条双链之间的氢键由于加热而断裂，解离成单链DNA (DNA的熔解)。并且，全部双链核酸DNA解离成单链DNA时，其吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅双链核酸DNA的吸光度)的约I. 5倍左右，由此可以判断熔解完成。Tm值基于该现象而设定。本发明中的Tm值只要不特别指出，均是指吸光度达到吸光度总上升量的50%时的温度。在本发明中，关于寡核苷酸的序列，当称为“从3’末端起数第I 3位”时是以寡核苷酸链的3’末端为第I位起数的。同样地，当称为“从5’末端起数第I 3位”时是以寡核苷酸链的5’末端为第I位数的。本说明书中“步骤” 一词，不仅包含独立的步骤，而且例如在不能与其他的步骤明确区别的情况下，只要达到了本步骤预期的效果，则包含在本术语之内。另外，在本说明书中，使用“ ”表示的数值范围表示分别包含“ ”的前后记载的数值作为最小值和最大值的范围。另外，在本发明中，组成物中的各成分的量，在所述组成物中存在多种相当于各成分的物质的情况下，只要不特别指出，是指组成物中存在的该多种物质的合计量。下面说明本发明。〈多态性检测试验用寡核苷酸〉
所述多态性检测试验用寡核苷酸是一种EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸，其为从包括下述(Pl)和(P’ )的组中选择的至少一种寡核苷酸(PD寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且其相对于含有序列编号I所示的碱基序列的至少第115位 第123位碱基的碱基长9 80的碱基序列具有至少80%以上的同一性；(ΡΓ )寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且其与含有序列编号I所示的碱基序列的至少第115位 第123位碱基的碱基长9 80的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交。所述多态性检测试验用寡核苷酸需要是与含有序列编号I所示的碱基序列的至少第115 123位碱基的预定区域的碱基序列具有至少80%以上的同一性、或者与该预定区域的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的序列。通过含有第115位 第123位的碱基，例如能够高灵敏度地检测具有在序列编号I所示的碱基序列的第115位或其之后缺失一个或多个碱基的多态性。此外，序列编号I所示的第115位的碱基对应于EGFR外显子19的 第744位的密码子的3’侧的碱基。所述Pl寡核苷酸的相对于所述预定区域的碱基序列的同一性需要是至少80%以上。另外，从检测灵敏度的观点来说，可以为85%以上、可以为90%以上、可以为95%以上、另外可以为96%以上、可以为97%以上、可以为98%以上、可以为99%以上。所述ΡΓ寡核苷酸为与所述序列编号I所示的碱基序列中的所述预定区域的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的序列。杂交可以根据公知的方法或者基于公知方法的方法，例如Molecular Cloning3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中记载的方法等来进行。该文献通过参考被并入本说明书中。严谨条件是指形成特异性杂交体但不形成非特异性杂交体的条件。典型的严谨条件例如可以举出在钾浓度约25mM 约50mM以及镁浓度约I. OmM 约5. OmM中进行杂交的条件。作为本发明的条件的示例，可以举出在Tris-HCl (pH8. 6)、25mM的KCl以及I. 5mM的MgCl2下进行杂交的条件,但不限于此。此外，严谨条件被记载在Molecular Cloning3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中。该文献通过参考被并入本说明书中。本领域技术人员可以通过改变杂交反应、杂交反应液的盐浓度等来容易地选择上述条件。另外，本发明中的所述Pl或所述ΡΓ寡核苷酸还包括在所述Pi或所述ΡΓ寡核苷酸被插入、缺失或者取代了 I个或2个以上的碱基的寡核苷酸。所述被插入、缺失或者取代了碱基的多态性检测试验用寡核苷酸只要显示出与所述Pl或所述ΡΓ寡核苷酸同等程度的作用即可，在插入、缺失或取代了 I个或2个以上的碱基的情况下，该插入、缺失或取代的位置无特别限定。作为插入、缺失或者取代的碱基的数量可以举出I个碱基或2个碱基以上，所述碱基的数量根据多态性检测试验用寡核苷酸总体的长度而不同，例如可以为I个碱基 10个碱基、或者I个碱基 5个碱基、或者I个碱基 3个碱基。所述多态性检测试验用寡核苷酸所具有的碱基序列的第I位碱基的位置不限于序列编号I的第115位的位置，例如既可以是序列编号I所示的碱基序列的第60位 第115位的任何碱基，也可以是第100位 第110位的任何碱基，也可以是第102位 第106位的任何碱基。所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基长需要为与含有所述序列编号I所示的碱基序列的至少第115位 第123位碱基的碱基长9mer 80mer的碱基序列相同的9mer 80mer。在所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基长为8mer以下或81mer以上时，不能期待目标的检测灵敏度。多态性检测试验用寡核苷酸的碱基长可以设为20mer 80mer,也可以设为IOmer 70mer,也可设为25mer 50mer,也可以设为26mer 42mer。碱基长较短的多态性检测试验用寡核苷酸例如具有更可靠地抑制野生型核酸的核酸扩增从而检测灵敏度变高的倾向。作为这样的多态性检测试验 用寡核苷酸，例如可以为以序列编号I所示的碱基序列的第60 115位的任一碱基为第I位碱基的IOmer 80mer的寡核苷酸,也可以为以第100 第110位的任一碱基为第I位碱基的25mer 50mer的寡核苷酸,也可以为以第102 第106位的任一碱基为第I位碱基的26mer 42mer的寡核苷酸。这种寡核苷酸例如具有更可靠地抑制野生型核酸的核酸扩增从而检测灵敏度变高的倾向。作为这种多态性检测试验用寡核苷酸，例如可以举出从包括下述(P2)和(P2’)的组中选择的至少一种寡核苷酸。(P2)寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且其相对于含有序列编号I所不的喊基序列的至少第104 123位喊基的喊基长20 80的喊基序列具有至少80%以上的同一'I"生;(P2’ )寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且其与含有序列编号I所示的碱基序列的至少第104位 第123位碱基的碱基长20 80的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交。如果所述P2或P2’寡核苷酸为含有序列编号I所示的碱基序列的第104位 第123位碱基的碱基长20mer 80mer的碱基序列，则P2或P2’寡核苷酸的第I位的碱基可以是与序列编号I所示的碱基序列的任何碱基对应的碱基。例如，P2或P2’寡核苷酸可以在从P2或P2’寡核苷酸的5’末端起数第I 3位的位置具有所述第104位的碱基，也可以是5’末端侧、即P2或P2’寡核苷酸的第I位的碱基为所述第104位的碱基。在从3’末端起第I 3位、尤其是在3’末端侧具有所述第104位碱基的寡核苷酸例如具有能够更可靠地抑制野生型核酸的核酸扩增的倾向。所述P2’寡核苷酸中的严谨条件与所述ΡΓ寡核苷酸中的严谨条件相同。另外，本发明中的所述P2或所述P2’寡核苷酸中还包含所述P2或所述P2’寡核苷酸被插入、缺失或者取代了 I个或多个碱基的寡核苷酸。所述P2或所述P2’寡核苷酸的碱基序列中插入、缺失或取代的I个或2个以上的碱基与所述Pl和P I’寡核苷酸的碱基序列中插入、缺失或取代的I个或2个以上的碱基相同。所述多态性检测试验用寡核苷酸还可以以检测多态性检测试验用寡核苷酸或其互补链等为目的而被标记。作为多态性检测试验用寡核苷酸上附加的标记物质一般可以举出荧光染料和荧光团等。标记物质一般被附加在寡核苷酸的碱基上，但不限于此。附加了所述标记物质的碱基只要是多态性检测试验用寡核苷酸的任意碱基即可，可以是任何位置。通过将多态性检测试验用寡核苷酸的任何位置的碱基作为用荧光染料标记的碱基，具有可以有效地检测有没有与多态性检测试验用寡核苷酸杂交的核酸等的优点。所述多态性检测试验用寡核苷酸的3’末端侧需要被进行延长抑制处理。这里，“延长”是指由使用了 DNA聚合酶或RNA聚合酶等酶的核酸扩增处理引起的核苷酸链的延长。延长抑制处理只要是抑制了从寡核苷酸链的5’末端向3’末端的延长的处理则无特别限制，例如可以举出对寡核苷酸链的3’末端侧的核酸添加取代基或化合物。作为这种为抑制延长而添加的取代基的例子，可以举出磷酸基、ddNTP基等，作为为抑制延长而添加的化合物的例子，可以举出荧光染料、2’，3’ ddA、2’，3’ ddC、2’，3’ ddG、2’，3’ddT等。作为寡核苷酸链的延长抑制处理，例如从可靠地抑制延长等观点来说，可以是对3’末端侧的核酸添加磷酸基的处理。被添加所述取代基或化合物的核酸的位置根据核酸的延长中所用的手段而不同，在使用DNA聚合酶或RNA聚合酶的情况下，可以为(脱氧)核糖的3位，但不限于此。 另外，所述多态性检测试验用寡核苷酸也可以含有用荧光染料标记的碱基作为碱基序列上的喊基。作为所述荧光染料无特别限制，例如可以举出荧光素、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等，作为市售的荧光染料例如可举出Pacific Blue、BODIPY FL、FluorePrime、Fluoredite、FAM> Cy3 和 Cy5、TAMRA 等。本发明涉及的多态性检测试验用寡核苷酸的示例如下所示。表中的“(P)”表示磷酸基。在序列编号I所示的碱基序列中，Cmp-I为从第104位碱基起40mer的寡核苷酸，Cmp-2为从第104位碱基起29mer的寡核苷酸，Cmp_3为从第115位碱基起28mer的寡核苷酸,Cmp-4为第89位碱基起49mer的寡核苷酸,Cmp-5为第79位碱基起47mer的寡核苷酸，Cmp-6为从第107位碱基起36mer的寡核苷酸,Cmp-7为第104位碱基起20mer的寡核苷酸，Cmp-8为从第104位碱基起80mer的寡核苷酸，Cmp-9为从第63位碱基起80mer的寡核苷酸，Cmp-IO为从第105位碱基起39mer的寡核苷酸，Cmp-Il为从第106位碱基起38mer长的寡核苷酸，Cmp-12为从第111位碱基起33mer的寡核苷酸，Cmp-13为从第115位碱基起29mer的寡核苷酸，Cmp-14第115位碱基起IOmer的寡核苷酸，Cmp-15为第106位碱基起78mer长的寡核苷酸。表I
权利要求
1.一种EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸，其为从包括下述(Pl)和(P’)的组中选择的至少一种寡核苷酸 (PD寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且其相对于含有序列编号I所不的喊基序列的至少第115位 第123位喊基的喊基长9 80的喊基序列具有至少80%以上的同一性；以及 (Pr )寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且其与含有序列编号I所示的碱基序列的至少第115位 第123位碱基的碱基长9 80的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交。
2.根据权利要求I所述的多态性检测试验用寡核苷酸，所述多态性检测试验用寡核苷酸为从包括下述(P2)和(P2’ )的组中选择的至少一种寡核苷酸 (P2)寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且其相对于含有序列编号I所不的喊基序列的至少第104 123位喊基的喊基长20 80的喊基序列具有至少80%以上的同一性；以及 (P2’ )寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且其与含有序列编号I所示的碱基序列的至少第104位 第123位碱基的碱基长20 80的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交。
3.根据权利要求2所述的多态性检测试验用寡核苷酸，其中，所述(P2)或(P2’)的寡核苷酸在从5’末端起数第I 3位的位置具有与所述第104位的碱基对应的碱基。
4.根据权利要求2所述的多态性检测试验用寡核苷酸，其中，所述(P2)或(P2’)寡核苷酸在5’末端具有与所述第104位的碱基对应的碱基。
5.根据权利要求I至4中任一项所述的多态性检测试验用寡核苷酸，其中，所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基长为25 50。
6.根据权利要求I至4中任一项所述的多态性检测试验用寡核苷酸，其中，所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基长为26 42。
7.根据权利要求I至6中任一项所述的多态性检测试验用寡核苷酸，其中，所述3’末端侧的延长抑制处理为磷酸基的添加。
8.根据权利要求I至7中任一项所述的多态性检测试验用寡核苷酸，其中，所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基序列上的碱基用荧光染料标记。
9.一种多态性检测方法，用于检测EGFR外显子基因的多态性，包括使用至少一种权利要求I至8中任一项所述的多态性检测试验用寡核苷酸来检测EGFR外显子19的多态性。
10.根据权利要求9所述的多态性检测方法，包括 准备可能包含具有序列编号I所示的碱基序列的单链核酸的核酸试样； 使所述多态性检测试验用寡核苷酸和所述单链核酸接触，来获得含有该多态性检测试验用寡核苷酸和该单链核酸并且该单链核酸的核酸扩增被抑制的杂交体；以及 对该多态性检测试验用寡核苷酸和该单链核酸接触时或者接触后的所述核酸试样进行核酸扩增。
11.根据权利要求10所述的多态性检测方法，其中，在能够与含有作为靶标的EGFR外显子19的多态性位点的核酸杂交的探针的存在下进行所述核酸扩增。
12.根据权利要求11所述的多态性检测方法，其中，所述探针相对于所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基序列具有45%以上的同一性。
13.根据权利要求11或12所述的多态性检测方法，其中，所述探针是在未与靶标序列杂交时发出荧光而与该靶标序列杂交时荧光强度减少的探针。
14.一种EGFR酪氨酸激酶抑制剂的药效判定方法，包括 通过权利要求9至13中任一项所述的多态性检测方法来检测EGFR外显子19中的多态性；以及 基于所述检测结果来判定对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的耐受性或EGFR酪氨酸激酶抑制剂的药效。
15.一种EGFR多态性检测试验用试剂盒，包含至少一种权利要求I至8中任一项所述的多态性检测试验用寡核苷酸。
16.根据权利要求15所述的EGFR多态性检测试验用试剂盒，还包含能够与含有作为靶标的EGFR外显子19的多态性位点的核酸序列杂交的探针。
17.根据权利要求16所述的EGFR多态性检测试验用试剂盒，其中，所述探针相对于所述多态性检测试验用寡核苷酸的碱基序列具有45%以上的同一性。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的EGFR多态性检测试验用试剂盒，还包含能够扩增含有作为所述靶标的EGFR外显子19多态性位点的核酸序列的引物对。
全文摘要
本发明提供EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸及其用途，所述EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸能够简便且高灵敏度地检测EGFR外显子19的多态性。一种作为下述(P1)或(P1’)的EGFR外显子19多态性检测试验用寡核苷酸及其用途(P1)寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且其相对于含有序列编号1所示的碱基序列的至少第115位～第123位碱基的碱基长9～80的碱基序列具有至少80％以上的同一性；(P1’)寡核苷酸，其3’末端侧被进行了延长抑制处理，并且其与含有序列编号1所示的碱基序列的至少第115位～第123位碱基的碱基长9～80的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交。
文档编号G01N21/64GK102776276SQ20121013700
公开日2012年11月14日 申请日期2012年5月2日 优先权日2011年5月6日
发明者井口亚希 申请人:爱科来株式会社