专利名称：毛细管气相色谱内标法同时测定酱油中各种防腐剂含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测酱油中各种防腐剂含量的方法，尤其是一种毛细管气相色谱内标法同时测定酱油中各种防腐剂含量的方法。
背景技术：
酱油是一种富含营养、味道鲜美的调味品，受到微生物的污染时可能发生腐败变 质，因此，生产厂家会添加一些食用防腐剂来抑制可能形成的腐败，在酱油中常用的防腐剂有苯甲酸、山梨酸以及对羟基苯甲酸酯类等。国家标准对防腐剂的限量作了明确规定，在安全使用范围内，防腐剂对人体无毒副作用，但过量食用对人体有一定毒性。目前有关的检测标准为GB/T 5009. 29-2003《食品中山梨酸、苯甲酸的测定》和GB/T 5009. 31-2003《食品中对羟基苯甲酸酯类的测定》，如果直接采用标准方法进行酱油中各种防腐剂含量的测定，一份样品要用两种方法分别进行预处理和采用不同的仪器条件，费时费力。而且经实践发现，在直接采用该标准对酱油类产品进行检测时，加标回收率较低，测定结果不稳定，并且在对较为浓稠的老抽类样品进行萃取时还容易因乳化现象的发生而难以分层进行后续操作。因此直接采用该标准中的气相色谱法对酱油类产品特别是老抽类样品进行检测时，精密度与准确度均不够理想，这是由于采用外标法定量，无论是样品处理还是仪器条件都可能导致误差的产生，繁琐的测定步骤增加了操作误差的发生几率，上机测定更是要求必须具有相当高的仪器性能与配置，例如需配置自动进样器来确保准确控制进样量等。
发明内容
为克服了现有技术的不足，本发明提供了一种毛细管气相色谱内标法同时测定酱油中各种防腐剂含量的方法，该方法可同时测定酱油中的苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸以及尼泊金酯类等防腐剂的含量，操作简便易行，能有效减少操作误差、以及仪器条件等因素对测定结果的影响，结果准确可靠。本发明的目的是通过以下技术措施来实现一种毛细管气相色谱内标法同时测定酱油中各种防腐剂含量的方法，其包括以下步骤
(1)称取酱油样品；
(2)在样品中加入内标物溶液，然后依次进行酸化、乙醚提取，净化除水和浓缩处理，得到样品溶液；
(3)取步骤(2)中的样品溶液进行气相色谱分析，获得色谱分析数据；
(4)将步骤(3)的获得的色谱分析数据与各待测防腐剂的校正因子比对，得到酱油中各种防腐剂的含量。本发明步骤⑴中可根据不同酱油类别称取所述的酱油样品的用量。作为本发明中的一个实施例，生抽类酱油推荐称取量在O. 5^2. 5g范围之间，而老抽类酱油推荐称取量在O. 5 I. Og范围之间。
由于老抽类酱油采用乙醚提取时，易出现乳化，导致无法达到有效提取防腐剂的目的，因而在本发明所述的步骤(I)中如样品是老抽类酱油时，需对老抽类酱油进行预处理在老抽类酱油样品中加入氯化钠溶液稀释广2. 5倍。作为本发明的一种实施方式，所述的步骤(2)使用以下具体操作将酱油样品置于具塞容器中，准确加入O. 3^0. 7ml内标溶液，再加入O. 3^0. 7ml盐酸溶液，混匀，用2(T40ml乙醚分2次萃取，合并两次上层溶液，然后在所得的上层溶液中加入3飞ml硫酸氢钠溶液，振荡，进行洗涤净化，静置，移除下层溶液后向上层溶液中加入:T7g无水硫酸钠进行除水，然后4(T45°C水浴上吹氮浓缩至O. f lml，再用Π. 5ml丙酮稀释，即成样品溶液。在酱油样品中加入盐酸酸化后，其中的苯甲酸钠、山梨酸钾等以盐的形式存在的防腐剂转化为有机酸，用乙醚进行萃取，再用硫酸氢钠洗涤净化去除残留的水溶性干扰组分，用无水硫酸钠吸除水，即可上机进行检测，简化了酱油样品预处理的过程，提高了工作效率，同时也减少了有机溶剂的使用。本发明所述的具塞容器可以采用具塞量筒、具塞试管或比色管。本发明所述的步骤(3)推荐的色谱条件为所述的毛细管色谱柱采用极性毛细管色谱柱，要求能对各待测组分与内标物质同时实现良好分离；恒温或适当的程序升温均可；恒流或恒压均可，手动或自动进样O. 5 I. O μ 1，载气为高纯氮气，柱头压O. 05 IMpa，分流比 50 100 I。所述恒温的柱温约20(T220°C。所述的程序升温条件为初温12(T130°C，以5 20°C /min的升温速率升至20(T210°C，再以3 6°C /min的升温速率升至22(T230°C，保持3 5分钟。所述的极性毛细管色谱柱可以采用HP-20M、DB-WAX或者PEG-20M等。在本发明中所述的内标物溶液推荐采用脂肪酸酯的丙酮溶液，要求内标峰位于待测组分峰之间，无覆盖。选用酯类物质的丙酮溶液作内标比用酸类物质更稳定，在冷藏条件下可保存较长时间不变质。所述的脂肪酸酯的丙酮溶液浓度在2 3g/L之间。所述的脂肪酸酯可以是碳数为16 24的脂肪酸甲酯或其它酯类，例如十七烷酸甲酯、二十烷酸甲酯等。本发明所述步骤⑷中各待测防腐剂的校正因子是通过用含O. Γ2. Og/L的内标物溶液的各种待测防腐剂组分的系列标准溶液，在相同的设定的气相色谱条件下测得。本发明所述的乙醚必须经过碘化钾溶液检查，不得含有过氧化物，否则容易造成山梨酸测定结果偏低。本发明的优点在于
(I)检测精度高本发明采用内标法，有效减少了因进样量、溶剂损失、待测样品的浓度等各种因素造成的误差，即使测定条件略有变化也不会对结果产生影响，若采用外标法定量，则对仪器用具和人员操作的要求很高。
(2)操作时间短本发明能同时用于多种防腐剂的检测，只用乙醚作为萃取剂进行一次性萃取获得多种防腐剂的混合液即可，不必按相关国标分别进行预处理和测定，样品预处理时间比标准方法大大缩短，故能大大缩短了检测时间。(3)成本低易于推广本发明操作简便，对操作人员的要求不高，采取手动进样，利用性能配置一般的检测仪器与用具，就能获得较为理想的测定结果，无需高配置高价位的检测仪器，通常来说，一套气相色谱仪价位为数万元，而有些仪器仅仅自动进样器一项就需数万元，因此，本发明大大节约了仪器方面的投资。另外，不必分别进行预处理，节省了试剂的消耗，进一步节约了检测成本。(4)本发明的极性固定相恒温分离的条件还能用于对食用植物油的脂肪酸组成常规分析，可在同一台仪器上实现对两个检测项目的交替测定，提高了仪器的利用率。
图I是本发明实施例一的毛细管气相色谱色谱 图2是本发明实施例二的毛细管气相色谱色谱 图3是本发明实施例三的毛细管气相色谱色谱图； 图4是本发明实施例四的毛细管气相色谱色谱图。
具体实施例方式为了更好地理解发明的实质，下面用实施例来详细说明发明的技术内容，但本发明的内容并不局限于此。实施例一
1.色谱条件
配置FID检测器的气相色谱仪；
毛细管色谱柱为 HP-20M( 25 m X0. 32 mmXO. 30 μ m)
柱温200°C，汽化室与检测室均为220°C 手动进样I. O μ I
载气为高纯氮气，柱头压O. 07Mpa，分流比100 1
2.校正因子测定
配制标准溶液精确称取苯甲酸、山梨酸各O. 2g，用丙酮溶解并定容至IOOml ；
配制内标溶液精确称取十七烷酸甲酯O. 2g，用丙酮溶解并定容至IOOml ；
配制标准使用溶液取适量标准溶液与内标溶液混合，内标浓度为O. 4g/L，标准物质浓度则分别为 O. 2,0. 4,0. 6,0. 8、I. Og/L。在上述色谱条件下，用系列标准溶液进样，以峰面积比和浓度比绘制标准曲线，获得苯甲酸与山梨酸的校正因子，建立相应的内标分析方法。3.样品处理
①称取老抽样品I. 0g，精确至O. OOlg，再加入I. 5g 200g/L的氯化钠溶液，置于25ml具塞试管中，准确加入0. 5ml内标溶液，再加入0. 5ml盐酸溶液(1+1 )，混匀，用30ml乙醚分2次萃取，每次振摇f2min，将两次萃取所得的上层溶液并入另一个50ml具塞试管中。②在所得的上层溶液中加入4ml 20g/L的硫酸氢钠溶液，充分振荡I 2min，静置l(Tl5min，然后用尖嘴吸管吸除下层溶液，再对保留的上层溶液重复此步骤一次。③在步骤②中所得的上层溶液中加入5g无水硫酸钠，充分振荡f2min，将溶液倾入圆底烧瓶中，置于4(T45°C水浴上吹氮浓缩至约0. 5ml，沿壁加入2. Oml丙酮，移入2ml样品瓶中，供上机用。4.样品测定
在与标准使用溶液相同的色谱条件下，选取相应的内标分析方法，进样测定，从色谱工作站读取测定结果，色谱图如图I所示。
实施例二
1.色谱条件
配置FID检测器的气相色谱仪；
毛细管色谱柱为 PEG-20M( 30 m X0. 32 mmXO. 25 μ m)
柱温210°C，汽化室与检测室温为230°C 手动进样O. 5 μ I
载气为高纯氮气，柱头压O. 07Mpa，分流比50 I
2.校正因子测定
配制标准溶液精确称取苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯各O. 2g,用丙酮溶解并定容至IOOml ；
配制内标溶液精确称取二十烧酸甲酯O. 2g,用丙酮溶解并定容至IOOml ；
配制标准使用溶液取适量标准溶液与内标溶液混合，内标浓度为O. 4g/L，苯甲酸与山梨酸的浓度则分别为O. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. Og/L，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯的浓度则分别为O. 05,0. 1,0. 15,0. 2,0. 25g/L。在上述色谱条件下，用系列标准使用溶液进样，以峰面积比和浓度比绘制标准曲线，获得苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯的校正因子，建立相应的内标分析方法。 3.样品处理
①称取生抽样品2. 5g，精确至O. OOlg，置于25ml具塞试管中，准确加入0.5ml内标溶液，再加入O. 5ml盐酸溶液(1+1)，混匀，用25ml乙醚分2次萃取，每次振摇llmin，将两次萃取所得的上层溶液并入另一个50ml具塞试管中。②在所得的上层溶液中加入5ml 20g/L的硫酸氢钠溶液，充分振荡f2min，静置l(Tl5min，然后用尖嘴吸管吸除下层溶液，再对保留的上层溶液重复此步骤一次。③在步骤②中所得的上层溶液中加入5g无水硫酸钠，充分振荡f2min，将溶液倾入圆底烧瓶中，置于4(T45°C水浴上吹氮浓缩至约O. 5ml，沿壁加入2. Oml丙酮，移入2ml样品瓶中，供上机用。4.样品测定
在与标准使用溶液相同的色谱条件下，选取相应的内标分析方法，进样测定，从色谱工作站读取测定结果，色谱图如图2所示。实施例三
1.色谱条件
配置FID检测器的气相色谱仪；
毛细管色谱柱为 PEG-20M ( 30 m X0. 32 mmXO. 25 μ m)
柱温200°C，汽化室与检测室温为230°C 手动进样0. 6 μ I
载气为高纯氮气，柱头压0. 06Mpa，分流比100 I
2.校正因子测定
配制标准溶液精确称取苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸各0. 2g，用丙酮溶解并定容至IOOml ；配制内标溶液精确称取十七烷酸甲酯O. 2g，用丙酮溶解并定容至IOOml ；
配制标准使用溶液取适量标准溶液与内标溶液混合，内标浓度为O. 4g/L，苯甲酸与山梨酸的浓度则分别为O. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. Og/L,脱氢乙酸的浓度则为O. 05,0. 1,0. 15、O.2、0.25g/L0在上述色谱条件下，用系列标准使用溶液进样，以峰面积比和浓度比绘制标准曲线，获得苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸的校正因子，建立相应的内标分析方法。
3.样品处理
①称取生抽样品2. 0g，精确至O. OOlg，置于25ml具塞试管中，准确加入0.5ml内标溶液，再加入O. 3ml盐酸溶液(1+1)，混匀，用20ml乙醚分2次萃取，每次振摇llmin，将两次萃取所得的上层溶液并入另一个50ml具塞试管中。②在所得的上层溶液中加入3ml 20g/L的硫酸氢钠溶液，充分振荡f2min，静置l(Tl5min，用尖嘴吸管吸除下层，再对保留的上层溶液重复此步骤一次。③在步骤②中所得的上层溶液中加入5g无水硫酸钠，充分振荡f2min，将溶液倾入圆底烧瓶中，置于4(T45°C水浴上吹氮浓缩至约O. 5ml，沿壁加入2. Oml丙酮，移入2ml样品瓶中，供上机用。4.样品测定
在与标准使用溶液相同的色谱条件下，选取相应的内标分析方法，取样品溶液进样测定，从色谱工作站读取测定结果，色谱图如图3所示。实施例四
1.色谱条件
配置FID检测器的气相色谱仪；
毛细管色谱柱为 DB-WAX ( 30 m X0. 32 mmXO. 25 μ m)
汽化室与检测室温为240°C
初温130°C，以15°C /min的升温速率升至210°C，再以5°C /min的升温速率升至230°C，保持3分钟。手动进样0·4μ1
载气为高纯氮气，柱头压0. 08Mpa，分流比50 I
2.校正因子测定
配制标准溶液精确称取苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯各0. 2g，用丙酮溶解并定容至IOOml ；
配制内标溶液精确称取十七烷酸甲酯0. 2g，用丙酮溶解并定容至IOOml ；
配制标准使用溶液取适量标准溶液与内标溶液混合，内标浓度为0. 4g/L，苯甲酸与山梨酸的浓度则分别为0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0g/L，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯的浓度则分别为 0. 05,0. 1,0. 15,0. 2,0. 25g/L。在上述色谱条件下，用系列标准使用溶液进样，以峰面积比和浓度比绘制标准曲线，获得苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯的校正因子，建立相应的内标分析方法。3.样品处理
①称取生抽样品2. 5g，精确至O.OOlg，置于25ml具塞试管中，准确加入0.5ml内标溶液，再加入O. 6ml盐酸溶液(1+1)，混匀，用40ml乙醚分2次萃取，每次振摇llmin，将两次萃取所得的上层溶液并入另一个50ml具塞试管中。②在所得的上层溶液中加入5ml 20g/L硫酸氢钠溶液，充分振荡lmin，静置l(Tl5min，然后用尖嘴吸管吸除下层溶液，再对保留的上层溶液重复此步骤一次。③在步骤②中所得的上层溶液中加入5g无水硫酸钠，充分振荡f2min，将溶液倾入圆底烧瓶中，置于4(T45°C水浴上吹氮浓缩至约O. 5ml，沿壁加入2. 5ml丙酮，溶解残渣，移取2ml溶液入样品瓶中，供上机用。4.样品测定
在与标准使用溶液相同的色谱条件下，选取相应的内标分析方法，取样品溶液进样测定，从色谱工作站读取测定结果，色谱图如图4所示。以上对本发明所提供的方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的 原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式
及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
权利要求
1.一种毛细管气相色谱内标法同时测定酱油中各种防腐剂含量的方法，其特征是，其包括以下步骤 (1)称取酱油样品； (2)在样品中加入内标物溶液，然后依次进行酸化、乙醚提取，净化除水和浓缩处理，得到样品溶液； (3)取步骤(2)中的样品溶液进行气相色谱分析，获得色谱分析数据； (4)将步骤(3)的获得的色谱分析数据与预定防腐剂标准数据比对，得到酱油中各种防腐剂的含量。
2.根据权利要求I所述的毛细管气相色谱内标法同时测定酱油中各种防腐剂含量的方法，其特征是，所述的步骤(2)的具体操作将酱油样品置于具塞容器中，准确加入O.3^0. 7ml内标溶液，再加入O. 3^0. 7ml盐酸溶液，混匀，用2(T40mlこ醚分2次萃取，合并两次上层溶液，然后在所得的上层溶液中加入3飞ml硫酸氢钠溶液，振荡，进行洗涤净化，静置，移除下层溶液后向上层溶液中加入:T7g无水硫酸钠进行除水，然后于4(T45°C水浴上吹氮浓缩至O. f lml，再用Π. 5ml丙酮稀释，即成样品溶液。
3.根据权利要求I或2所述的毛细管气相色谱内标法同时测定酱油中各种防腐剂含量的方法，其特征是，所述的步骤(2)中的内标物溶液采用脂肪酸酷的丙酮溶液。
4.根据权利要求3所述的毛细管气相色谱内标法同时测定酱油中各种防腐剂含量的方法，其特征是，所述的脂肪酸酷的丙酮溶液浓度在2 3g/L之间。
5.根据权利要求4所述的毛细管气相色谱内标法同时测定酱油中各种防腐剂含量的方法，其特征是，所述的脂肪酸酯为碳数为16 24的脂肪酸甲酷。
6.根据权利要求5所述的毛细管气相色谱内标法同时测定酱油中各种防腐剂含量的方法，其特征是，所述的步骤(3)的色谱条件为所述的毛细管色谱柱采用极性毛细管色谱柱，要求能对各待测组分与内标物质同时实现良好分离；恒温或适当的程序升温；恒流或恒压,手动或自动进样,载气为高纯氮气。
7.根据权利要求6所述的毛细管气相色谱内标法同时测定酱油中各种防腐剂含量的方法，其特征是，所述的极性毛细管色谱柱采用HP-20M、DB-WAX或者PEG-20M。
8.根据权利要求7所述的毛细管气相色谱内标法同时测定酱油中各种防腐剂含量的方法，其特征是，所述的步骤(I)中根据不同酱油类别称取所述的酱油样品的用量。
9.根据权利要求7所述的毛细管气相色谱内标法同时测定酱油中各种防腐剂含量的方法，其特征是，所述的步骤(I)中的酱油是老抽类酱油时，需对老抽类酱油进行预处理。
10.根据权利要求9所述的毛细管气相色谱内标法同时测定酱油中各种防腐剂含量的方法，其特征是，所述的预处理为在老抽类酱油样品中加入氯化钠溶液稀释f 2. 5倍。
全文摘要
本发明公开了一种毛细管气相色谱内标法同时测定酱油中各种防腐剂含量的方法，其包括以下步骤(1)称取酱油样品；(2)在样品中加入内标物溶液，然后依次进行酸化、乙醚提取，净化除水和浓缩处理，得到样品溶液；(3)取步骤(2)中的样品溶液进行气相色谱分析，获得色谱分析数据；(4)将步骤(3)的获得的色谱分析数据与预定防腐剂标准数据比对，得到酱油中各种防腐剂的含量。该方法可同时测定酱油中的苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸以及尼泊金酯类等防腐剂的含量，操作简便易行，能有效减少操作误差、以及仪器条件等因素对测定结果的影响，结果准确可靠。
文档编号G01N30/88GK102707002SQ20121016541
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月25日 优先权日2011年5月27日
发明者刘占, 张庆宇, 曾亚丽, 李婕, 杨明泉, 樊瑞, 陈穗 申请人:广东美味鲜调味食品有限公司