专利名称：一种激光扫描位相显微成像方法及系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种光学成像方法及系统，特别是关于一种适用于透明生物组织成像的激光扫描位相显微成像方法及系统。
背景技术：
激光扫描共聚焦显微技术是利用置于探测器前的针孔，有效屏蔽非焦面光对样品成像质量的影响，实现点扫描、点探测的成像过程，但是由于其并不具有将样品位相信息转变为强度信息的能力，因此不能对透明生物样品进行非荧光标记的结构成像，需要与其它显微成像方法融合才能对透明生物样品实现逐点扫描/探测方法。现有技术中生物组织显微成像方法主要包括1、微分干涉相差显微成像方法利用两块渥拉斯顿棱镜(Wollaston Prism),起偏器(Polarizer)和检偏器(Analyzer),基 于宽场偏振光对透明生物组织进行成像，成像结果可以呈现生物组织的浮雕状结构，但是上述显微成像方法需要在光路中额外添加偏振元件产生偏振光，并利用两束偏振光形成的剪切角进行位相差分探测，所使用的元件价格昂贵且不能对具有双折射特性的样品进行探测。同时，宽场成像需要使用CCD相机进行数据采集，因此不利于与采用点探测器的激光扫描共聚焦显微技术融合。2、斜射照明显微成像方法是利用霍夫曼光学调制器(HoffmanModulator)和狭缝光阑(Slit Stop)，基于宽场斜入射的光源对透明生物组织进行成像，成像结果可以呈现生物组织的浮雕状结构，但是由于上述显微成像方法的光路中需要插入光学调制器和狭缝光阑，因此在实验过程中不利于不同模态间的切换，同时也因为宽场成像需要使用CCD相机进行数据采集，所以不利于与采用点探测器的激光扫描共聚焦显微技术融合。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种可以实现对透明生物样品的无标记成像，不仅能够方便不同模态之间切换，而且成像对比度和信噪比均比较高的激光扫描位相显微成像方法及系统。为实现上述目的，本发明采取以下技术方案一种激光扫描位相显微成像方法，包括以下步骤1)设置一包括有荧光显微镜、激光共聚焦扫描系统和光电探测系统的激光扫描位相显微成像系统；其中，所述荧光显微镜包括有物镜、管镜和扫描镜；所述激光共聚焦扫描系统包括有激光器、二向色镜、X方向扫描振镜、Y方向扫描振镜、滤波片、会聚透镜和针孔；2)将激光共聚焦扫描系统放置在荧光显微镜的入光孔处，将光电探测系统放置在激光共聚焦扫描系统的出光方向，使激光器出射激发光的高度与荧光显微镜入光孔中轴线的高度相当；3)调节各光学元件之间的角度，使成像系统满足光学显微系统的物象共轭关系；4)将一样品切片放置在荧光显微镜的试验台上，所述样品切片包括盖玻片、生物样品以及载玻片；5)在载玻片上添加突光介质；6)激光器发射激发光经二向色镜进行分光，出射的激发光依次经X方向扫描振镜和Y方向扫描振镜扫描成光栅面，并将其经扫描镜和管镜聚焦扩束后发射到物镜，并经盖玻片聚焦在生物样品上；7)聚焦在生物样品的激发光透过生物样品照射荧光介质，荧光介质被激发光激发发射荧光；8)荧光照射并透过生物样品沿着原光路返回，即依次经物镜、管镜、扫描镜、Y方向扫描振镜、X方向扫描振镜发射到二向色镜进行分光，出射的荧光发射到滤波片并经会聚透镜聚焦进入针孔，经针孔出射的荧光由光电探测系统接收处理得到生物样品的浮雕状结构。所述步骤3)中调节各光学元件之间的角度具体操作为调节X方向扫描振镜与物镜之间的角度，使进入物镜前的激发光光轴方向与物镜中轴线之间的角度为θ，α ! ( Θ〈Ci2，其中，\为激发光扫描视场角，％为物镜的数值孔径角。所述步骤3)中调节各光学元件之间的角度具体操作为调节X方向扫描振镜与物镜之间的角度，使进入物镜前的激发光光轴方向与物镜的中轴线重合，并调节会聚透镜与针孔之间的位置，使经会聚透镜聚焦的荧光与针孔中轴线之间的角度为β，αι· Y (β〈α 2 · Y，其中，Y为角放大率，α 为激发光扫描视场角，α 2为物镜的数值孔径角。所述步骤3)中调节各光学元件之间的角度具体操作为调节X方向扫描振镜与物 镜之间的角度，使进入物镜前的激发光光轴方向与物镜的中轴线之间的角度为S 17同时调节会聚透镜与针孔之间的位置，使经会聚透镜聚焦的荧光与针孔中轴线之间的角度为δ 2，其中，δ J 0，δ 2〉0，α ( δ j+ δ 2/ y ( α 2, γ为角放大率，α ι为激发光扫描视场角，α 2为物镜的数值孔径角。实现所述方法的一种激光扫描位相显微成像系统，其特征在于它包括突光显微镜、激光共聚焦扫描系统和光电探测系统，所述荧光显微镜包括物镜、管镜和扫描镜；所述激光共聚焦扫描系统包括激光器、二向色镜、X方向扫描振镜、Y方向扫描振镜、滤波片、会聚透镜和针孔；所述激光共聚焦扫描系统设置在所述荧光显微镜的入光孔处，所述光电探测系统设置在所述针孔的出光方向，所述激光器发射激发光到所述二向色镜进行分光，经所述二向色镜出射的激发光依次经所述X方向扫描振镜和Y方向扫描振镜沿X方向和Y方向扫描成光栅面，光栅面经所述扫描镜聚焦进入所述荧光显微镜，并依次经所述管镜和物镜聚焦于生物样品并照射荧光介质，经激发光激发的荧光照射并透过生物样品，沿着所述物镜、管镜和扫描镜射出，并依次通过所述Y方向扫描振镜和X方向扫描镜发射到所述二向色镜进行分光，经所述二向色镜出射的荧光经所述滤波片和会聚透镜聚焦进入所述针孔，并经所述针孔出射到所述光电探测系统上完成生物样品的荧光成像。进入所述物镜前的激发光光轴方向与所述物镜中轴线之间的角度为θ，且α丨θ〈α2，其中，\为激发光扫描视场角，％为物镜的数值孔径角。进入所述物镜前的激发光光轴方向与所述物镜中轴线重合，且经所述会聚透镜聚焦的荧光光轴与所述针孔中轴线之间的角度为( β〈α2· Y,其中，Y为角放大率，\为激发光扫描视场角，Ci2S物镜的数值孔径角。进入所述物镜前的激发光光轴方向与所述物镜的中轴线之间的角度为S1，且经所述会聚透镜聚焦的荧光与所述针孔中轴线之间的角度为S2，其中，S1) 0，δ2)0, Q1(δ 1+ δ 2/ Y (α2, Y为角放大率，a i为激发光扫描视场角，α 2为物镜的数值孔径角。本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点1、本发明由于设置有荧光显微镜、激光共聚焦扫描系统和光电探测系统，且在载玻片上(样品后方)设置有荧光介质，对待测的生物样品进行激光扫描位相显微成像时，激发光激发荧光照射生物样品并通过调节各光学元件之间的角度，可以完成透明生物样品结构的浮雕状成像，实现了对透明生物样品的无标记成像。2、本发明由于利用设置在样品后方的荧光介质激发的荧光照射生物样品，实现透明样品的结构浮雕状成像，且也可以利用生物样品本身标记的荧光，实现传统荧光成像，因此可以在扫描光学成像中完成对生物样品结构成像或荧光成像，切换过程简单易行，极大方便了不同模态之间切换。3、本发明由于采用激光共聚焦扫描/探测方式，因此只接收位于物镜焦面上的样品信息，有效地屏蔽了非焦面光对成像质量的影响，成像对比度高，信噪比高，使得逐点扫描/探测方法能够适用于透明生物样品的成像。4、本发明与现有技术相比，由于不需要微分干涉相差显微成像技术和斜射照明显微成像技术中特有的光学元件，因此大大降低了显微成像系统的复杂性，避免了光路中插入的光学元件使实验系统以及实验过程复杂化。本发明可以广泛应用于生物样品 的成像过程中。
图I是本发明的激光扫描位相显微成像系统结构示意图；图2是本发明在激光斜入射时的角度放大剖面示意图；图3是本发明的针孔斜接收时角度放大剖面示意图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。如图I所不,本发明的激光扫描位相显微成像系统包括一突光显微镜I、一激光共聚焦扫描系统2和一光电探测系统3 ;突光显微镜I包括物镜11、管镜12和扫描镜13 ;激光共聚焦扫描系统2包括激光器21、二向色镜22、X方向扫描振镜23、Y方向扫描振镜24、滤波片25、会聚透镜26和针孔27 ;激光共聚焦扫描系统2位于突光显微镜I的入光孔处，光电探测系统3位于针孔27的出光方向，用于接收经生物样品透射的荧光。激光器21发射激发光到二向色镜22发生反射或透射(分光)，经二向色镜22反射的激发光发射到X方向扫描振镜23将激发光扫描成光栅线(线光源),并将其发射到Y方向扫描振镜24将光栅线扫描成光栅面(面光源)，光栅面经扫描镜13聚焦进入荧光显微镜1，并依次经管镜12和物镜11聚焦于生物样品，经激发光激发的荧光沿着物镜11、管镜12和扫描镜13射出荧光显微镜1，并依次通过Y方向扫描振镜24和X方向扫描镜23发射到二向色镜22发生透射或反射，透射的荧光经滤波片25和会聚透镜26聚焦进入针孔27，并经针孔27出射到光电探测系统3上完成生物样品的荧光成像。上述实施例中，光电探测系统3可以根据实际需要选择具有光电探测功能的光学元件，在此不作限定。上述各实施例中，滤波片25根据所采用的荧光介质所激发的荧光的波长对应进行选择。上述各实施例中，二向色镜22的作用是分光，可以采用反射激发光透射荧光，也可以采用透射激发光反射荧光，在具体实验中可以根据实际需要进行设定。如图I所示，实际对生物样品进行荧光成像时，荧光显微镜I可以采用正置荧光显微镜或倒置荧光显微镜的方式完成成像，两者的区别仅是将光路进行上下翻转，本发明以倒置式荧光显微镜I为具体实施例详细说明激光扫描位相显微成像系统对待测的生物样品进行激光扫描位相显微成像方法，包括以下步骤I)将激光共聚焦扫描系统2放置在荧光显微镜I的入光孔处，将光电探测系统3放置在激光共聚焦扫描系统2的出光方向，且保证激光器21的出射激光的高度与突光显微镜I入光孔中轴线的高度相当(近似相等)，使激发光能够通过入光孔进入荧光显微镜I对生物样品进行照射。2)根据实际需要，调节各光学元件之间的角度，使成像系统满足光学显微系统的物象共轭关系。3)将样品切片4放置在荧光显微镜I的试验台上，样品切片4自下而上依次为盖玻片41、生物样品42以及载玻片43。4)在载玻片43的顶部添加突光介质5,该突光介质5是可以被入射激发光有效激发的荧光材料。
5)激光器21发出激发光经二向色镜22进行分光，经二向色镜22出射的激发光依次经X方向扫描振镜23和Y方向扫描振镜24沿X方向和Y方向扫描成光栅面,并将其经扫描镜13和管镜12聚焦扩束后发射到物镜11，并经盖玻片41聚焦在生物样品42上，完成对生物样品的激光扫描。6)由于生物样品本身是接近透明状，因此聚焦在生物样品42的激发光大部分透过生物样品42照射在荧光介质5上，荧光介质5被激发光激发发射荧光，为生物样品42提供照明。7)荧光照射并透过生物样品42沿着原光路返回，即依次经物镜11、管镜12、扫描镜13、Y方向扫描振镜24、X方向扫描振镜23发射到二向色镜22进行分光，由于突光的波长与激发光的波长不同，因此荧光经二向色镜22出射到滤波片25并经会聚透镜26聚焦进入针孔27，经针孔27出射的荧光由光电探测系统3接收并经现有的图像处理方法进行处理形成生物样品的浮雕状结构。如图2所示，上述实施例中，为了使生物样品的成像结果可以呈现生物组织的浮雕状结构，因此可以采用荧光为生物样品提供宽场斜射光源，步骤2)中调节各光学元件之间的角度具体操作为调节X方向扫描振镜23与物镜11之间的角度，使进入物镜11前的激发光光轴方向与物镜11的中轴线之间的角度为Θ，且α 〈 θ〈 α 2，a i为激发光扫描视场角(与样品扫描范围对应的激发光偏转角度)，α2为物镜11的数值孔径角，其中，Sina2=ΝΑ/η，NA为物镜的数值孔径，η为介质折射率。 如图3所示，上述实施例中，根据光学成像的物象共轭关系可知，步骤2 )中调节各光学元件之间的角度具体操作为调节X方向扫描振镜23与物镜11之间的角度，使进入物镜11前的激发光光轴方向与物镜11的中轴线重合时(激发光的光轴方向与物镜11的中轴线之间的角度为0)，调节会聚透镜26与针孔27之间的位置，使经会聚透镜26聚焦的荧光光轴与针孔中轴线之间的角度为β，变化范围为a i · γ〈 β ( α 2 · y ,根据光学系统的放大率关系，角放大率Y = f/f2, f为物镜11的焦距，f2为会聚透镜26的焦距，因此，当激光正入射时，通过设置经会聚透镜聚焦26的荧光光轴与针孔27中轴线之间的角度，也可以使生物样品的成像结果呈现生物组织的浮雕状结构。上述实施例中，步骤2)中调节各光学元件之间的角度具体操作也可以为调节X方向扫描振镜23与物镜11之间的角度，使进入物镜11前的激发光光轴方向与物镜11的中轴线之间的角度为S1 (S1)O),同时调节会聚透镜26与针孔27之间的位置，使经会聚透镜26聚焦的荧光光轴与针孔27中轴线之间的角度为δ 2 ( δ 2〉0)，当满足α 〈 δ 1+ δ 2/Y〈 α 2时，也可以使得生物样品的成像结果呈现生物组织的浮雕状结构。上述各实施例中，针孔27的直径可以采用微米量级，目的为了更好的避免来自非焦面光进入光电探测系统3。上述各实施例中，本发明的所有光学器件在使用过程中均可以采用相应的外部支架进行定位，本发明对每一光学元件的具体位置不作限定，可以根据具体实验要求进行调整，但是所有的光学元件组合形成的光路传播必须与本发明的光路传播一致，满足本发明对生物样品的照射和检测要求。
上述各实施例仅用于说明本发明，其中各光学元件的位置、实施方法的步骤等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。
权利要求
1.一种激光扫描位相显微成像方法，包括以下步骤 1)设置一包括有突光显微镜、激光共聚焦扫描系统和光电探测系统的激光扫描位相显微成像系统；其中，所述荧光显微镜包括有物镜、管镜和扫描镜；所述激光共聚焦扫描系统包括有激光器、二向色镜、X方向扫描振镜、Y方向扫描振镜、滤波片、会聚透镜和针孔； 2)将激光共聚焦扫描系统放置在荧光显微镜的入光孔处，将光电探测系统放置在激光共聚焦扫描系统的出光方向，使激光器出射激发光的高度与荧光显微镜入光孔中轴线的高度相当； 3)调节各光学元件之间的角度，使成像系统满足光学显微系统的物象共轭关系； 4)将一样品切片放置在荧光显微镜的试验台上，所述样品切片包括盖玻片、生物样品以及载玻片； 5)在载玻片上添加突光介质； 6)激光器发射激发光经二向色镜进行分光，出射的激发光依次经X方向扫描振镜和Y方向扫描振镜扫描成光栅面，并将其经扫描镜和管镜聚焦扩束后发射到物镜，并经盖玻片聚焦在生物样品上； 7)聚焦在生物样品的激发光透过生物样品照射荧光介质，荧光介质被激发光激发发射荧光； 8)荧光照射并透过生物样品沿着原光路返回，即依次经物镜、管镜、扫描镜、Y方向扫描振镜、X方向扫描振镜发射到二向色镜进行分光，出射的荧光发射到滤波片并经会聚透镜聚焦进入针孔，经针孔出射的荧光由光电探测系统接收处理得到生物样品的浮雕状结构。
2.如权利要求I所述的一种激光扫描位相显微成像方法，其特征在于所述步骤3)中调节各光学元件之间的角度具体操作为调节X方向扫描振镜与物镜之间的角度，使进入物镜前的激发光光轴方向与物镜中轴线之间的角度为θ，α I〈 Θ (a 2，其中，α 为激发光扫描视场角，％为物镜的数值孔径角。
3.如权利要求I所述的一种激光扫描位相显微成像方法，其特征在于所述步骤3)中调节各光学元件之间的角度具体操作为调节X方向扫描振镜与物镜之间的角度，使进入物镜前的激发光光轴方向与物镜的中轴线重合，并调节会聚透镜与针孔之间的位置，使经会聚透镜聚焦的荧光与针孔中轴线之间的角度为( β〈α2· Y,其中，Y为角放大率，^为激发光扫描视场角，％为物镜的数值孔径角。
4.如权利要求I所述的一种激光扫描位相显微成像方法，其特征在于所述步骤3)中调节各光学元件之间的角度具体操作为调节X方向扫描振镜与物镜之间的角度，使进入物镜前的激发光光轴方向与物镜的中轴线之间的角度为S 17同时调节会聚透镜与针孔之间的位置，使经会聚透镜聚焦的荧光与针孔中轴线之间的角度为S2，其中，S1) O，δ2)0,Q1 ( δ 1+ δ 2/ y (α2, y为角放大率，α 为激发光扫描视场角，α 2为物镜的数值孔径角。
5.实现如权利要求I或2或3或4所述方法的一种激光扫描位相显微成像系统，其特征在于它包括突光显微镜、激光共聚焦扫描系统和光电探测系统，所述突光显微镜包括物镜、管镜和扫描镜；所述激光共聚焦扫描系统包括激光器、二向色镜、X方向扫描振镜、Y方向扫描振镜、滤波片、会聚透镜和针孔；所述激光共聚焦扫描系统设置在所述荧光显微镜的入光孔处，所述光电探测系统设置在所述针孔的出光方向，所述激光器发射激发光到所述二向色镜进行分光，经所述二向色镜出射的激发光依次经所述X方向扫描振镜和Y方向扫描振镜沿X方向和Y方向扫描成光栅面，光栅面经所述扫描镜聚焦进入所述突光显微镜，并依次经所述管镜和物镜聚焦于生物样品并照射荧光介质，经激发光激发的荧光照射并透过生物样品，沿着所述物镜、管镜和扫描镜射出，并依次通过所述Y方向扫描振镜和X方向扫描镜发射到所述二向色镜进行分光，经所述二向色镜出射的荧光经所述滤波片和会聚透镜聚焦进入所述针孔，并经所述针孔出射到所述光电探测系统上完成生物样品的荧光成像。
6.如权利要求5所述的一种激光扫描位相显微成像系统,其特征在于进入所述物镜前的激发光光轴方向与所述物镜中轴线之间的角度为Θ，且a i〈 Θ ( α 2，其中，α 为激发光扫描视场角，％为物镜的数值孔径角。
7.如权利要求5所述的一种激光扫描位相显微成像系统，其特征在于进入所述物镜前的激发光光轴方向与所述物镜中轴线重合，且经所述会聚透镜聚焦的荧光光轴与所述针孔中轴线之间的角度为β，α工· Y ( β〈 α 2 · γ，其中，γ为角放大率，a i为激发光扫描视场角，％为物镜的数值孔径角。
8.如权利要求5所述的一种激光扫描位相显微成像系统，其特征在于进入所述物镜前的激发光光轴方向与所述物镜的中轴线之间的角度为S i，且经所述会聚透镜聚焦的荧光与所述针孔中轴线之间的角度为S2，其中，δ^Ο, δ2)0, Q1 (δ1+δ2/γ〈α2，Υ为角放大率，^为激发光扫描视场角，％为物镜的数值孔径角。
全文摘要
本发明涉及一种激光扫描位相显微成像方法及系统，它包括有荧光显微镜、激光共聚焦扫描系统和光电探测系统；将激光共聚焦扫描系统放置在荧光显微镜入光孔，将光电探测系统放置在激光共聚焦扫描系统的出光方向；调节各光学元件之间的角度；将样品切片放置在试验台上；在载玻片的顶部添加荧光介质；激光器发出激发光经二向色镜、X方向扫描振镜、Y方向扫描振镜、扫描镜和管镜聚焦扩束后发射到物镜，并聚焦在生物样品上；聚焦在生物样品的激发光透过生物样品照射在荧光介质上，荧光介质被激发光激发发射荧光；荧光照射并透过生物样品沿着原光路返回，出射的荧光发射到滤波片并经会聚透镜聚焦进入针孔，经针孔出射的荧光由光电探测系统接收处理得到生物样品的浮雕状结构。本发明可以广泛应用于生物样品成像过程中。
文档编号G01N21/64GK102841083SQ20121033870
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年6月11日
发明者丁翼晨, 谢浩, 席鹏 申请人:北京大学