用于真空紫外或更短波长圆二色性光谱学的方法和设备的制作方法

用于真空紫外或更短波长圆二色性光谱学的方法和设备的制作方法
【专利摘要】用于真空紫外（VUV）或更短波长圆二色性光谱学的方法和设备。一种高效真空紫外圆二色性分光计被提供；该分光计适合于实验室使用或用于综合进同步加速器辐射设施的射束线中。在一个实施例中，光谱圆二色性仪器被提供；该仪器被这样配置，以便使圆二色性数据能对光的多种波长同时被获得。该仪器还可以被配置成在至少一部分真空紫外波长区中操作。
【专利说明】用于真空紫外或更短波长圆二色性光谱学的方法和设备
【技术领域】
[0001]本公开涉及偏振光谱学领域。更具体地说，本公开提供一种装置，借助该装置可以在真空紫外(VUV)中进行圆二色性(CD)测量。在一个实施例中，高效实验室规模VUV CD分光计被提供。按本文所使用，真空紫外(VUV)光，一般包含约190nm和更短波长的光的波长。
【背景技术】
[0002]当光通过旋光性(如，手性)分子的溶液时，左旋和右旋圆偏振分量以不同速度穿越溶液，并被该溶液按不同程度吸收。有差别的传播速度导致光学旋转(OR)的效应，该效应能够借助光学旋转色散(0RD)，通过测量偏振平面的旋转而被探测。在吸收频带附近，圆二色性(CD)光谱学测量左旋和右旋圆偏振光被物质的不同吸收。两种方法已经成功地用于表征含有旋光性分子的溶液的性质。除了对固有手性敏感之外，ORD和CD还对复杂分子的不同构造敏感。结果是，CD光谱学的最丰富的应用之一是可溶蛋白质二级结构的研究。
[0003]光学旋转和圆二色性有相同的基本原因，并通过Kramers-Kronig积分彼此相关联。定义圆双折射(CB)为光学旋转的两倍，则复数广义圆延迟能够被定义为:
[0004]C=CB_iCD 方程式 I
[0005]这里CB和⑶是波长的函数。方程式I的形式和它服从的Kramers-Kronig关系，常见于材料的(各向同性)光学色散n-1k，这里n是材料的折射率，而k是消光系数。该n和k服从Kramers-Kronig关系,意味着折射率的波长依赖性可由材料的吸收确定，反之亦然。同样，该CB和⑶通过Kramers-Kronig积分相关联,意味着在所有波长或能量之一上的全部知识，确定在另一个上的全部知识。
[0006]但是，实际的实验，是在有限的波长范围上发生的，而ORD和CD光谱学有不同的优点，与探查的波长范围有关。虽然ORD光谱能够在远离造成ORD效应的吸收频带上被确定，但CD光谱直接探测该频带，因而被认为更灵敏和光谱上“致密”。在ORD光谱学中，与给定吸收频带相关联的信息，一般扩展在大能量范围上。结果是，在给定波长范围中的ORD光谱，含有来自多个吸收频带的重叠贡献。相反，对CD光谱学，由于单个吸收频带被定位在更小能量范围内，导致该信息在被测量特性之间少得多的重叠。如果吸收区在实验上是易接近的，则CD光谱学一般是更可取的技术，因为它更直接地探测待测量物质的旋光性的基本“原因”。
[0007]在可溶蛋白质的情形下，分子的二级结构导致溶液的旋光性，而不同类型的二级结构。诸如a -螺旋、折叠片(beta sheet)、聚脯氨酸_11螺旋等等，在CD光谱中引起性质不同的特性。造成蛋白质CD的电子频带，大多驻留在紫外光中。a-螺旋结构一般涉及的频带，以?222、208、192、175、160和140nm为中心。其间，折叠片结构在?215、198、175和168nm上有较弱的频带。折叠片几何的变化，导致对CD光谱更多的修改。聚脯氨酸-11螺旋已经观察到226nm和206nm附近的频带，并引起类似于那些先前表征为“无序”的蛋白质光谱的光谱。在所有情形下，其他频带可以存在，但仍然有待观察和/或识别。
[0008]紫外波长区可以被认为由两种不同的段组成:从?190_400nm的近UV区，以及190nm以下的“远-UV”或真空紫外(VUV)区。常用的⑶分光计，操作上被限制在向下到约190nm。使CD研究扩展进VUV中的主要动机，是在更短波长上有另外的吸收频带存在。作为这些补充特性的后果，VUV CD光谱相对于它们的更长波长一方，本性上具有增加的信息内容。虽然传统的CD仪器常常被限制用于确定溶液中存在的a-螺旋结构的量，但VUV CD系统能提取大批二级分量成分。此外，这些强大的系统，还能够提供构造变化的深入了解，诸如与二级结构无关的折叠态。重要的是要指出，这种信息增强不简单地是由于“数据越多越好”的辩论；改进的能力是VUV中存在另外的吸收频带的直接后果。
[0009]VUV中的光学研究，由于大多数材料在该区中的本征吸收，是难以进行的。这种现象，排除了传统的更长波长光学仪器的简单延伸或修改，以促进在这些能量上的操作。为在VUV中达到高效的光学性能，一种仪器必须明确地被设计成这样做。具体地说，常用光学系统被设计成操作在大气条件中，并除别的外，通常缺乏在这些更短波长上操作所要求的受控环境。VUV辐射被氧和潮气二者强烈吸收；因此，这些物质必须维持在足够低的水平，以便许可VUV光子通过仪器的光路透射。试图借助无吸收气体的简单冲洗，以到达更短波长，一般得到不良的结果。此外，否则适合于近UV或可见光波长操作的透射式光学部件，照惯例在VUV中强烈吸收。所以，必须代之以采用反射式元件，极大地限制设计选项。结果是，要在VUV光学仪器中达到高的光学通过量，是比较困难的。
[0010]除了早期 Johnson 的工作(Johnson W.C.(1971), “A circular dichroismspectrometer for the vacuum ultraviolet，，。Rev.Sc1.1nstrum.42 (9): 1283-1286),向着研发专用的、高效的VUV CD仪器的进展已经受到限制。今天市场上的台式系统(benchtop system),被设计成操作在近UV或更长波长上。若干种这些系统,在把能力扩展进VUV的努力中，提供过分简单化的冲洗功能。但是实际上不良的数据质量，限制这些仪器在近似185nm以上的波长上操作。
[0011]大多数已有的有能力的VUV⑶系统,是被集成进同步加速器福射(synchrotronradiation (SR))射束线中的那些系统。这种仪器在1980年代和1990年代的出现，给⑶数据质量和信息内容带来极大增强。然而这些改进，大部分是SR源惊人的强度的成果，而不是仪器设计中的基本进展。作为这些研发的后果，对VUV-⑶光谱学的兴趣显著增长，导致该技术的若干新射束线的试运转，以及应用的数不清的确认。SR-CD系统是强大的，但缺点也是显然的:同步加速器设施庞大且格外昂贵，以致使进入严重受限。
[0012]由此可见，研发不要求同步加速器辐射，但高效、高通过量的实验室规模VUV CD分光计，具有巨大好处。这样的仪器将使蛋白质的高通过量结构研究，变得广泛可用，从而为加速在结构蛋白质组学(structural proteomics)中的发现,仓Il造新的机会。

【发明内容】

[0013]本文的公开内容涉及光谱学领域。在一个实施例中，一种高效的台式VUV⑶分光计被提供；该分光计适合于实验室使用，或在同步加速器辐射设施上集成进射束线中。
[0014]在一个实施例中，光谱圆二色性仪器被提供。该仪器可以包括:光源，它产生由多种波长的光组成的多波长光束；光谱圆二色性仪器的区，用于放置样本，通过使样本对多波长光束曝光，从该区获得圆二色性测量；补偿器，与该多波长光束光学耦合，该补偿器向多波长光束提供圆偏振分量；光学兀件，与该多波长光束稱合，该光学兀件选择该多波长光束的线偏振分量；以及检测器，与该多波长光束耦合，用于提供该样本的圆二色性测量，该仪器能同时为多种波长提供圆二色性测量。在又一个实施例中，该光谱圆二色性仪器可以有该仪器的光路，该光路被配置成在样本对多波长光束曝光之后，允许该多波长光束通过该补偿器和该第一光学元件。在另一个实施例中，该光谱圆二色性仪器可以有该仪器的光路，该光路被配置成在样本对多波长光束曝光之前，允许该多波长光束通过该补偿器和该第一光学兀件。
[0015]在另一个实施例中，一种光谱⑶仪器被提供；该仪器被这样配置，以便使⑶数据能对多种波长同时获得。该仪器还可以被配置成在至少一部分VUV波长区中操作。
[0016]在又一个实施例中，一种⑶仪器被提供；该仪器被如此配置，以致从线或圆各向异性样本测量的数据，能够用数学表达式分析，以确定CD信号。
[0017]在又另一个实施例中，一种CD仪器被提供；该仪器被配置成仅仅采用单个线偏振器/检偏器和单个补偿器；至少一个所述偏振器/检偏器或补偿器还被配置成旋转的。
[0018]在再另一个实施例中，一种CD仪器被提供；该仪器被配置成采用偏振器/检偏器和补偿器。该仪器还被这样配置，以便当缺乏线各向异性效应的圆各向异性样本被测量时，不要求所述偏振器/检偏器和补偿器彼此相对对准和/或与样本对准。
[0019]在再另一个实施例中，一种光学仪器被提供；该仪器被配置成，提供对样本中存在的所有三种类型的光学各向异性(圆的、线的xy、以及线的±45° )的灵敏性。该仪器还被配置成仅仅采用单个偏振器/检偏器。
【专利附图】

【附图说明】
[0020]本概念及其优点更全面的理解，可以通过参考结合附图的下面的描述获取，附图中，相同参考数字表示相同特征。然而，应当指出，附图出示的只是本发明的示例性实施例，并因此不应认为是对本发明范围的限制，因为本发明可以许可其他同样效果的实施例。
[0021]图1-(现有技术)-常用⑶分光计的示意表示。
[0022]图2- —实施例的示意表示，该实施例被如此配置，以致光在补偿器和检偏器之前遇到样本。
[0023]图3- —实施例的示意表示，该实施例有分光计的进一步细节-检测器。该实施例被如此配置，以致光在补偿器和检偏器之前遇到样本。
[0024]图4-另一个实施例的示意表示，该实施例被如此配置，以致光在偏振器和补偿器之后遇到样本。
[0025]图5-—通用实施例的不意表不,该实施例有偏振器、检偏器和补偿器,它们可如此配置，以致它们能够被插入光束路径或从光束路径移出。
[0026]图6-图2实施例的详细表示。
[0027]图7-图5实施例的详细表示。
【具体实施方式】
[0028]典型现有技术的圆二色性(⑶)分光计100在图1中给出。源102的光被单色仪104波长调谐，然后通过相对于图平面45°取向的线偏振器106。线偏振光然后通过光-弹性调制器(photo-elastic modulator (PEM)) 108。该 PEM 实质上是应变板(strain-plate)补偿器，其中应变条件是在+/-四分之一波条件之间振荡(如，按50kHz)，为的是把线偏振光变换成交替的左旋和右旋圆偏振光。该圆偏振光然后通过样本盒110，并被光电倍增(PM)管112检测。该PM检测器常常与锁定放大器(未画出)组合使用。从检测器/放大器的输出，通常用近似表达式分析，以推断样本的圆二色性。
[0029]图1现有技术配置的一个值得注意的缺点是，它本性上是扫描仪器。由此可见，因为单色仪按定义是单一频率装置，PM是对强度敏感而不管能量的单个元件检测器，而PEM的四分之一条件必须为每一波长被调整。结果是，个别波长的数据必须依次地，而不是同时地被收集。
[0030]走向光谱⑶仪器设计的一步，已经由Lewis提出(Lewis, J.ff., Tilton, R.F., Einterz, C.M., Milder, S.J., Kuntz, 1.D., Kliger, D.S., (1985)。 “New techniquefor measuring circular dichroism changes on a nanosecond time scale.Application to (Cabonmonoxy) myoglobin and (Carbonmonoxy) hemoglobin.”J.Phys.Chem.89:289-294.)该仪器采用偏振器-补偿器-检偏器(PCA)透射椭圆计配置与宽带源结合。操作时，初始偏振器轴沿水平方向按0°被取向。该仪器进行两次测量，一次以快补偿器轴在45°上，而一次以快补偿器轴在-45°上，导致右旋和左旋椭圆偏振光。产生的信号与样本CD以及补偿器相移相关联。只要补偿器相移已知，近似的CD信号能够被提取。该设计的好处是，补偿器相移条件无需为每一波长被调整。
[0031]然而遗憾的是，Lewis的仪器也引入单色仪和PM检测器，从而仍然要求波长扫描。此外，考虑到系统的光学配置只能提供近似的样本CD而不解决也可以存在的CB效应，系统的光学配置显得十分复杂。由Che提供的该设计的延伸(Che, D., Goldbeck, R.A., McCauley, S.ff., Kliger, D.S., (1994).“Optical analysis of an ellipsometrictechnique for time-resolved magnetic circular dichroism spectroscopy.^J.Phys.Chem.98:3601-3611),添加抵消样本的圆双折射的光学旋转器。然而，为达到该目的，该旋转器位置也必须为每一波长被调整。
[0032]虽然Che的系统能计及圆双折射对⑶信号的贡献，但由于至少四个透射式元件(即，偏振器、检偏器、补偿器和旋转器)被采用，本性上它使操作复杂化。事实上，在这些现有技术设计的每一个中，都有若干光学部件，它们的轴必须彼此相对对准，以便进行哪怕是最简单的测量。透射式元件过多，还引起样本/系统耦合问题，使数据分析的努力变得模糊不清。
[0033]现有技术CD系统的再一个缺点，与它们的光学上低效有关，尤其在短波长上。在与真空紫外(VUV)中的操作有关的场合，光学通过量常常受透射式系统元件中的吸收限制。例如，常用的VUV偏振器/检偏器，作为这些元件相当厚的后果，是出了名低效的。因此，采用大量透射式部件的系统，一般在短波长上呈现不良的效率。
[0034]除了 CB和⑶外，一般的各向异性样本，还可以相对于光学平面呈现线双折射和/或二色性(LB1和LD1)，和/或相对于45°平面的线双折射和/或二色性(LB2和LD2X该线双折射对，各服从类似于圆各向异性遵从的Kramers-Kronig关系。在样本中只有线效应的情形下，测量线二色性和/或双折射可以是希望的。一般说来，样本能够呈现所有三种双折射/ 二色性对的效应，特别是涉及时间相关的过程。在这些情形下，确定除圆效应之外的线效应是希望的。在其他情形下，以线各向异性效应的存在引起的最小误差，测量圆二色性，是希望的。
[0035]图1所示现有技术系统的又一个缺点，是它的缺乏对线±45°各向异性效应的灵敏性。基本上，该系统只对⑶和/或线各向异性分量(X/Y LD)之一灵敏。此外，⑶和LD必须从信号提取，该信号依赖于以多个调制器频率表示的无穷级数展开。该仪器不得不提取相关的最低频率而不受更高谐波的过分影响。否则，更高频率不得不被忽略，这样做意味着⑶和/或LD的提取是近似的，即使对纯⑶或LD各向异性样本。
[0036]总而言之，现有技术⑶仪器有大量缺陷，包含但不限于:单一波长操作、引入众多透射式元件的复杂的设计、没完没了的对准要求、不良的VUV光学效率、样本/系统耦合的复杂性、不精确的分析能力、以及对光学各向异性的某些形式缺乏灵敏性。
[0037]由此可见，研发可以克服如果不是全部，也是一些这些限制的仪器，将会有极大好处。如果所述仪器真正地是光谱式的，则提供比常用扫描系统更短的扫描时间、更快的测量、以及更高的通过量，将是有好处的。如果所述系统引入更少透射式元件，使它更容易操作、校准、以及对准，同时仍然提供对所有形式的光学各向异性的灵敏性，那么进一步希望的。如果所述系统在VUV中光学上高效，并可用于收集高质量VUV CD光谱而不用同步加速器辐射源，将进一步更为有利。
[0038]体现这些需要品质的仪器200的示意表示，在图2和3给出。该系统包含:宽带源202 ;接着是样本204 ;补偿器206，它在一个实施例中是在测量期间被不断旋转；检偏器208 (它可以是机械的，能够改变光的偏振)；以及最后的分光计检测器210。补偿器把圆偏振分量施加到光束中。分光计-检测器(图3中更详细画出)组成包括色散/衍射元件302和多元件阵列检测器304 二者，后者如光电二极管阵列(PDA)或电荷耦合器件(CCD)。来自光学系统的宽带光，空间上被色散/衍射元件分开，使不同波长的光照射不同位置上的检测器阵列。电子装置306向计算机报告电信号、强度、或光子计数与阵列位置关系。与图1的现有技术配置相反，图3的CD系统真正是光谱式的且是不要求波长扫描的。
[0039]操作期间，补偿器可以按固定频率被旋转。检测的信号将由作为补偿器旋转角的函数的强度组成，该信号能够被傅里叶分析，以提取样本参数。确定检测信号的内容的优选手段，应当用Mueller计算法(Mueller Calculus)进行光学系统的分析。每一光学元件，包含样本，由4X4矩阵表示，该4X4矩阵对输入Stokes矢量进行变换，该输入Stokes矢量由代表入射光偏振态的四个元素构成。Stokes矢量的元素由:总光强度Stl，沿水平(图2和3中的X-轴)和竖直轴偏振的强度之差S1,沿相对于水平平面+/-45°偏振的强度之差S2,以及右旋和左旋圆偏振光的强度之差S3组成。水平方向偏振光的Stokes矢量，是(S。、SpSySpkmO)'而左旋圆偏振光的Stokes矢量是(1、0、0、-1)τ，余类推。
[0040]光学兀件Mueller矩阵，把输入Stokes矢量变换成由输出Stokes矢量表不的另一种状态。初始输入矢量常常被假定由完全非偏振光，或(1、0、0、0)τ组成。每一 Mueller矩阵按它被遇到的顺序应用于输入光，该Mueller矩阵有引起附加偏振分量的作用，以及在光学参数中，诸如偏振器效率和补偿器相移角中进行耦合的作用。检测器上(归一化)的输出，是最后Stokes矢量的元素S。。
[0041]标准光学元件的Mueller矩阵，能够在椭圆计量课本中找到(如，Fujiwara, H.(2007) , “Spectroscopic ElIipsometry: Principles and Applications，，。Johnffiley&Sons Ltd.)。对呈现多种类型各向异性的样本的Mueller矩阵，能够在文献(Cheet al.1994, Schellman, J., Jensen, H.P., (1987) “Optical spectroscopy of orientedmolecules.” Chem.Rev.87:1359-1399)中找到。注意，如上面定义的Stokes矢量的元素，与 Fujiwara (Fujiwara2007)和 Che (Che et al.1994)的一致。Schellman (Schellmanet al.1987)使用不同的排序，那里S3对应于x/y偏振(相对于光学装置平面)，S1对应于+/-45°偏振，以及S2对应于圆偏振。两种定义的任一种都没问题，但Mueller矩阵的元素必须与Stokes排序的那些元素一致。本公开使用与Fujiwara和Che —致的排序,且任何对Schellman的Mueller矩阵元素的参考被重新排序，以便与本约定一致。
[0042]虽然一般样本可能很好地呈现所有六种各向异性效应，但一些普通情形包含这些参数的更小的子集。在样本由良好松弛的、均匀的溶液组成，且对该样本溶液的外部干扰没有被引进的情形下，线各向异性往往消失，只留下圆各向异性效应CB和CD。该样本Mueller矩阵于是由下式给出
【权利要求】
1.一种光谱圆二色性仪器，包括: 光源，它产生由多种波长的光组成的多波长光束； 该光谱圆二色性仪器用于放置样本的区，通过使样本曝光于多波长光束，圆二色性测量将被从该区获得； 补偿器，光学上与该多波长光束稱合，该补偿器在多波长光束的两个正交偏振分量之间引进相位差； 光学兀件，与该多波长光束稱合，该光学兀件选择该多波长光束的线偏振分量；和检测器，与该多波长光束耦合，用于提供该样本的圆二色性测量，该仪器能同时为多种波长提供圆二色性测量。
2.权利要求1的光谱圆二色性仪器，其中该仪器的光路被配置成在样本对多波长光束曝光之后，允许该多波长光束通过该补偿器和该光学元件。
3.权利要求1的光谱圆二色性仪器，其中该仪器的光路被配置成在样本对多波长光束曝光之前，允许该多波长光束通过该补偿器和该光学元件。
4.权利要求1的光谱圆二色性仪器，其中该补偿器向多波长光束提供圆偏振分量。
5.权利要求4的 光谱圆二色性仪器，其中补偿器或光学元件中的至少之一是可旋转的。
6.权利要求5的光谱圆二色性仪器，其中圆二色性光谱和线二色性光谱是从被检测强度信号中提取的。
7.权利要求5的光谱圆二色性仪器，其中该补偿器是可旋转的。
8.权利要求7的光谱圆二色性仪器，其中圆二色性光谱是从被检测强度信号的dc和2?分量提取的，而线二色性光谱是从被检测强度信号的dc和4?分量提取的，其中《是补偿器旋转的角频率。
9.权利要求1的光谱圆二色性仪器，其中补偿器或光学元件中的至少之一是可旋转的。
10.权利要求9的光谱圆二色性仪器，其中圆二色性光谱和线二色性光谱是从旋转相关强度信号中提取的。
11.权利要求9的光谱圆二色性仪器，其中该补偿器是可旋转的。
12.权利要求11的光谱圆二色性仪器，其中圆二色性光谱是从被检测强度信号的dc和2?分量提取的，而线二色性光谱是从被检测强度信号的dc和4?分量提取的，其中《是补偿器旋转的角频率。
13.权利要求1的光谱圆二色性仪器，其中该样本是蛋白质溶液。
14.权利要求13的光谱圆二色性仪器，其中该系统被配置成测量蛋白质溶液的光谱的圆二色性，该系统还被配置成分析该圆二色性光谱，以获得蛋白质二级结构。
15.权利要求1的光谱圆二色性仪器，还包括与多波长光束耦合的消偏振器。
16.权利要求1的光谱圆二色性仪器，还包括第二补偿器和第二光学元件，该第二光学兀件选择该多波长光束的线偏振分量。
17.一种用于进行二色性测量的方法，该二色性测量是圆二色性测量、线二色性测量、或者圆二色性测量和线二色性测量二者，该方法包括: 产生由多种波长组成的光束；用所述光束使测量样本曝光，并使该光束通过该样本； 在从样本出射的出射光束的正交偏振分量之间引起相位差； 选择出射光束的偏振分量； 检测在多种波长上的偏振分量输出光束的强度；和 为多种波长的每一波长，从偏振分量输出光束的强度提取二色性测量结果。
18.权利要求17的方法，其中该二色性测量是圆二色性测量。
19.权利要求17的方法，其中该二色性测量是线二色性测量。
20.权利要求17的方法，其中该二色性测量是圆二色性测量和线二色性测量二者。
21.权利要求17的方法，其中正交偏振分量之间的相位差是由光学补偿器的使用引起的。
22.权利要求21的方法，其中该光学补偿器在测量期间被旋转，产生时间-和波长-相关强度数据。
23.权利要求22的方法，其中圆二色性光谱是从被检测强度信号的dc和2ω分量提取的，而线二色性光谱是从被检测强度信号的dc和4ω分量提取的，其中ω是补偿器旋转的角频率。
24.权利要求17的方法，其中该样本是蛋白质溶液。
25.权利要求24的方法，还包括分析圆二色性光谱，以获得关于蛋白质二级结构的数据。
26.权利要求17的方法，其中该偏振 分量是通过使用检偏器/偏振器选出的。
【文档编号】G01N21/19GK103688154SQ201280035435
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年7月13日 优先权日:2011年7月18日
【发明者】P·沃尔什, A·T·海依士, D·A.·哈瑞森 申请人:Vuv分析股份有限公司