专利名称：一种检测肌钙蛋白i的免疫层析检测卡的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程技术领域的检测工具，尤其是一种检测肌钙蛋白I的免疫层析检测卡。
背景技术：
心血管疾病发病率高、致残率高、死亡率高、并发症多，对健康危害极为严重。心血管检验是整个心血管领域中的“瓶颈”学科，只有在尽可能段的时间内正确诊断疾病，才有可能及时有效的将先进治疗手段用于临床，使患者受益。随着对心血管诊断标志物研究的日益深入，更加明确了相关标志物对于临床意义，心脏标志物的检测可直接影响心血管疾病患者的临床诊断、危险分层、治疗方案选择和预后判断。因此缩短心脏标志物检测的周转时间(turn-aroundtime, TAT)对于临床早期诊断和早期治疗心血管疾病具有重要的意义，在心脏疾病的临床诊断与筛查过程中，各种检测技术的应用为及时早发现、诊断和治疗提供了严格的科学依据。目前常用的心脏疾病检测诊断方法，主要包括:非实验室诊断的如家族心脏病史调查、心电图检查、X射线胸透检查、心电图负荷实验、心导管术、心脏超声波检查等和实验室检验的如心脏标志物肌酸激酶(CK)与肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I(cTnl)或肌钙蛋白T(cTnT)、肌红蛋白(Myoglobin)、BNP或NT-proBNP检测等。其中心肌肌钙蛋白(cTn)又是目前心血管疾病临床敏感性和特异性最好的心肌损伤标志物，已成为心肌组织损伤(如心肌梗死)最重要的诊断依据。心脑血管疾病发紧急，预后危重。所以心脏标志物的快速检测技术及产品是发展最快的一部分。目前市场上主要的检测系统包括:美国Biosite的Biosite Triage检测系统、加拿大的Response的RAMP检测系统，美国Abbott的i_SATA检测系统以及日本Mitsubishi Kagaku Iatron 的 Pathfast 检测系统等。荧光层析免疫分析方法是近年来发展起未的一种微量分析方法，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量分析，具有高灵敏度、选择性强、需样量少和操作简便等优点。但目前绝大多数的荧光免疫层析技术产品沿用传统胶体金定性免疫层析技术，使用玻璃纤维作为荧光探针的固定载体，利用样本加入后对玻璃纤维的浸润实现探针的释放，试剂检测均一性稳定性较差。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种检测均一性稳定性的检测肌钙蛋白I的免疫层析检测卡。本发明解决其技术问题所采用的技术方案为:一种检测肌钙蛋白I的免疫层析检测卡，由样品垫、硝酸纤维膜包被膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上，并另外配有样品稀释液和冻干探针保存管构成，所述探针保存管中含有荧光胶乳微粒标记的肌钙蛋白I单克隆抗体，所述硝酸纤维膜包被膜包括检测区和质控区，所述检测区包被有与所述荧光胶乳微粒标记的肌钙蛋白I单克隆抗体处于不同表位的另一种肌钙蛋白I单克隆抗体，所述质控区包被羊抗鼠IgG。本发明的进一步设置为:所述荧光胶乳微粒标记的肌钙蛋白I单克隆抗体的浓度为0.5-1.5mg/ml，按1:20-1:500的稀释度，5u I/管的用量加入到探针保存管(6)中，并冻干。本发明的进一步设置为:所述检测区包被的肌钙蛋白I单克隆抗体的浓度为
0.5 2mg/ml，喷膜用量为 100U l/20_100cm。此项设置中检测区包被就是在检测区上喷膜，因此涉及喷膜用量。本发明的进一步设置为:所述羊抗鼠IgG的浓度为1.0 — 211^/1111，喷膜用量为100ul/20_100cm。此项设置中质控区包被就是在质控区上喷膜，因此涉及喷膜用量。本发明的进一步设置为:所述荧光胶乳微粒的直径为200_500nm。本发明的进一步设置为:所述荧光胶乳微粒受激发后发射的波长为500nm-600nm。上述结构的有益效果为:精密度高、重复性好。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例， 对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本实施例的结构示意具体实施例方式参考图1可知，由样品垫1、硝酸纤维膜包被膜2、吸水纸3顺次搭接粘贴在底板4上，并另外配有样品稀释液和冻干探针保存管构成，硝酸纤维膜包被膜2包括检测区5和质控区6。在本发明实施例中，所采用的肌钙蛋白I抗体为常规单克隆抗体技术制备的单抗，利用双抗体夹心法检测肌钙蛋白I抗原的原理检测标本。本发明检测肌钙蛋白I的免疫层析检测卡，样品垫I含有一个亲水性的孔状隔膜，样品垫I是加样区，用于吸取待检测肌钙蛋白I检测样本。样品垫I依次搭接有硝酸纤维素膜包被膜2和吸水纸3，样品垫1、硝酸纤维素膜包被膜2和吸水纸3都粘贴于底板(4)上。使用特定的激发光(580nm) /发射光(615nm)波长的突光胶乳(直径约300nm)标记I株肌钙蛋白I单克隆抗(0.5-7mg/ml);硝酸纤维素包被膜2的检测区5处采用肌钙蛋白I的另一株单克隆抗体(0.5-7mg/ml)进行包被。在包被膜2的质控区6处使用浓度为lmg/ml的羊抗鼠IgG进行包被，起到过滤的作用，防止血清中的非特异性鼠IgG对质控区、检测区处反应的影响。检测肌钙蛋白I的免疫层析检测卡的制备包括以下步骤:1.荧光胶乳的共价活化超声波处理胶乳微球体30秒后，调节胶乳微球体浓度为1% (w/v), 10000 16000rpm离心10分钟，离心后收集沉淀物用IOOmM pH6.0 Hepes缓冲液溶解，并超声波200W处理30秒；先加入IOOul的100mg/ml EDC,震荡混匀，再加入50ul的50mg/mlN_羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，震荡混匀；室温孵育30分钟后10000 15000rpm离心5 15分钟，沉淀用lOOmM、pH5.0 6.0的MES缓冲液溶解，放置在2 8°C条件下备用；2.荧光胶乳微粒标记蛋白的制备将活化后的荧光胶乳超声波200W处理30秒后，按照50u g标记抗体/IOOul荧光胶乳的比例加入肌钙蛋白I单克隆抗体，混匀后室温搅拌反应2小时，离心洗涤3次，每次10000 15000rpm转速离心10分钟，沉淀用PBS-TBN溶解并超声波200W处理30秒，用PBS-TBN缓冲液恢复离心前体积。按1:20-1:500的稀释度，5ul/管的用量加入到探针保存管6中，并冻干。3.制备硝酸纤维素包被膜分别将与玻璃纤维膜标记垫上的肌钙蛋白I单克隆抗体位于不同表位另一株肌I丐蛋白I单克隆抗体(包被抗体)和羊抗鼠IgG用包被缓冲液分别调节至0.5mg/ml和Img/ml，按膜包被液量为lul/cm.将肌钙蛋白I单克隆抗体和羊抗鼠IgG喷到硝酸纤维素包被膜上对应的检测区5和质控区6进行包被，检测区5和质控区6间隔3-8mm，在湿度〈30%条件下37°C烘干2-3小时，封袋备用；4.在底板4上依次相互搭接地粘贴样品垫1、硝酸纤维素包被膜2和吸水纸3得到试纸板，按照要求切割成适当宽度的检测卡。实施例2该实施例中的检测卡结构均与实施例1相同。所述荧光胶乳微粒标记的肌钙蛋白I单克隆抗体的浓度为0.lmg/ml，所述检测区包被的肌钙蛋白I单克隆抗体的浓度为Img/ml，喷膜用量为1.5ul/cm。所述羊抗鼠IgG的浓度为1.5mg/ml，喷膜用量为1.5ul/cm。[该实施例的制备方法除了步骤2中肌钙蛋白I单克隆抗体:荧光胶乳为l%(w/v)。其余均与实施例1相同，使用方法也与实施例1相同。 在本发明中，在使用时，组装在由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料外壳中，塑料上壳设有加样孔和检测窗，加样孔对应于所述的肌钙蛋白I免疫层析检测卡样品垫1，检测窗对应于所述检测肌钙蛋白I免疫层析试检测卡的检测区5和质控区6。在精密度方面，利用实施例1-2的试剂条对含量分别为高值、低值和中值的样本，连续检测至少10次，计算变异系数(CV)。对于肌钙蛋白I含量高值(21.4ng/ML)，中值(3.39ng/ML)、低值(0.34ng/ML)血液样本各一例分别测定10次，根据其测定数据，利用SPSS统计分析检验结果CV值均小于10%，因此精密度很高。本发明在使用的时候由光源激发包被膜上检测区5及质控区6处聚积的荧光微球，荧光微球受到激发后发射出的荧光信号被相应的检测系统接收，并通过光电变换、光电转化等过程将光电信号转化成电信号，并由系统中设置的自动控制系统将信号输出，显示出最终的定量结果。显然，上述实施例仅仅是为了清楚的说明所做的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种检测肌钙蛋白I的免疫层析检测卡，其特征在于:由样品垫、硝酸纤维膜包被膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上，并另外配有样品稀释液和冻干探针保存管构成，所述探针保存管中含有荧光胶乳微粒标记的肌钙蛋白I单克隆抗体，所述硝酸纤维膜包被膜包括检测区和质控区，所述检测区包被有与所述荧光胶乳微粒标记的肌钙蛋白I单克隆抗体处于不同表位的另一种肌钙蛋白I单克隆抗体，所述质控区包被羊抗鼠IgG。
2.按照权利要求1所述的检测肌钙蛋白I的免疫层析检测卡，其特征在于:所述荧光胶乳微粒标记的肌钙蛋白I单克隆抗体的浓度为0.5-1.5mg/ml，按1:20-1:500的稀释度，5ul/管的用量加入到探针保存管(6)中，并冻干。
3.按照权利要求1所述的检测肌钙蛋白I的免疫层析检测卡，其特征在于:所述检测区包被的肌钙蛋白I单克隆抗体的浓度为0.5 2mg/ml，喷膜用量为100Ul/20-100cm。
4.按照权利要求1所述的检测肌钙蛋白I的免疫层析检测卡，其特征在于:所述羊抗鼠IgG的浓度为1.0 — 2mg/ml，喷膜用量为100ul/20_100cm。
5.按照权利要求1所述的检测肌钙蛋白I的免疫层析检测卡，其特征在于:所述荧光胶乳微粒的直径为200-500nm。
6.按照权利要求1所述的检测肌钙蛋白I的免疫层析检测卡，其特征在于:所述荧光胶乳微粒受激发后发射的波长 为500nm-600nm。
全文摘要
本发明涉及一种生物工程技术领域的检测工具，尤其是一种检测肌钙蛋白I的免疫层析检测卡。由样品垫、硝酸纤维膜包被膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上，并另外配有样品稀释液和冻干探针保存管构成，所述探针保存管中含有荧光胶乳微粒标记的肌钙蛋白I单克隆抗体，所述硝酸纤维膜包被膜包括检测区和质控区，所述检测区包被有与所述荧光胶乳微粒标记的肌钙蛋白I单克隆抗体处于不同表位的另一种肌钙蛋白I单克隆抗体，所述质控区包被羊抗鼠IgG。上述结构的有益效果为精密度高、重复性好。
文档编号G01N33/68GK103217535SQ20131008712
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月18日 优先权日2013年3月18日
发明者张鹏, 林振华, 李士敏 申请人:杭州德安奇生物工程有限公司