一种拟核酸碱基为识别位点的罗丹明荧光探针及其制备和在核苷酸影像上的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种荧光探针，属于精细化工【技术领域】。一种拟核酸碱基为识别位点的罗丹明荧光探针及其制备和在核苷酸影像上的应用，它是通过氨基萘啶与核苷酸碱基之间通过类碱基互补氢键作用诱导罗丹明内酯开环实现对核苷酸的荧光响应，利用开环产物生成的亚胺正离子与合适长度的磷酸链阴离子之间静电相互作用强弱实现特定核苷酸的选择性响应。该探针对胞苷二磷酸（CDP）和腺苷三磷酸（ATP）表现出良好的选择性。Hela细胞共聚焦成像实验表明该探针可对细胞内的核苷酸产生灵敏的成像效果，并且成像前后细胞状态良好，说明该探针细胞毒性小。由于该探针具有良好的生物相容性和高灵敏的成像效果，所以在医学荧光成像中得到广泛地应用。
【专利说明】—种拟核酸碱基为识别位点的罗丹明荧光探针及其制备和在核苷酸影像上的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种荧光探针，具体地说，涉及一种拟核酸碱基为识别位点的罗丹明荧光探针及其制备和在核苷酸影像上的应用。
【背景技术】
[0002]核苷酸作为一类重要的生物小分子，在人体DNA合成，细胞信号传输，各种物质跨膜输运，能量传递，基因表达等诸多生命过程中起着极其重要的作用。并且在许多生理过程异常，或机体发生病变时均伴随着某种核苷酸的异常表达。因此实现对细胞内核苷酸的实时、原位、无损伤高分辨率影像为人们研究细胞诸多生理功能提供了直观而有效途径。设计和开发对核苷酸有专属性响应的分子探针是实现高分灵敏影像最有效的途径之一。荧光影像技术由于其操作方便快捷，非入侵性，并且具有高灵敏度，可实现高通量扫描并能获得实时的原位信息越来越多地受到人们的欢迎。因此设计开发对核苷酸具有荧光响应的分子探针显得尤为重要。目前所开发的核苷酸荧光探针分子主要基于三种策略:(1)构筑多臂负载正电荷和大共轭基团长链受体，利用其与核苷酸间的堆积作用和静电作用实现对核苷酸的检测；(2)利用核苷酸中的磷酸链对金属配合物(一般为锌离子配合物)中的金属离子的配位作用实现 对核苷酸的响应识别。该策略实质上是实现的对磷酸链的识别，而不是真正意义上的核苷酸的识别；(3)利用核苷酸对大环包合物中的荧光团的置换作用实现对核苷酸的检测，实际上还是简单的共轭体系间的堆积作用。上述对核苷酸检测的荧光探针的激发波长和发射波长大多处于短波区，荧光影像时背景信号强，且短波激发发射对细胞光损伤较大，很难准确的考察细胞正常的生理功能。同时，真正模拟DNA碱基之间的互补配对作用实现核苷酸的检测的探针将会为人们提供更为真实的生物学信息。因此构建类碱基作用模式长波上激发发射的荧光探针有望解决上述问题，并将在临床医学影像中展现出巨大的应用前景。
【发明内容】
[0003]为了克服现有技术中存在的不足，本发明目的是提供一种拟核酸碱基为识别位点的罗丹明荧光探针及其制备和在核苷酸影像上的应用。它是将核酸碱基有识别功能的2-氨基-1，8-萘啶嫁接到长波激发和发射的开关型罗丹明荧光信号基团，制备出对核苷酸具有特殊响应的强荧光低损伤荧光探针，该探针不但对核苷酸有特异的响应，并且还应用于活体细胞高灵敏突光成像。
[0004]为了实现上述发明目的，解决现有技术中所存在的问题，本发明采取的技术方案是:一种拟核酸碱基为识别位点的罗丹明荧光探针，是将7-甲基-2-氨基-1，8-萘啶的2位氨基与罗丹明酰氯发生取代反应和环合反应而连接到罗丹明五元内酰胺环上，具有如下A分子结构式。
[0005]
【权利要求】
1.一种拟核酸碱基为识别位点的罗丹明荧光探针，其特征在于:将7-甲基-2-氨基-1，8-萘啶的2位氨基与罗丹明酰氯发生取代反应和环合反应而连接到罗丹明五元内酰胺环上，具有如下A分子结构式。
2.一种拟核酸碱基为识别位点的罗丹明荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (a)将2，6-二氨基吡啶溶于盛有适量浓磷酸的第一反应釜中，在氩气氛围中加热到90-95度，称取4，4- 二甲氧基-2- 丁酮置于恒压分液漏斗中并逐滴加入2，6- 二氨基吡啶的磷酸溶液中，升温至110~115度后搅拌反应5~10小时，冷却至室温，用10~15%的氨水中和反应液中的磷酸至pH=8~9，用氯仿萃取5~6次,萃取液用饱和氯化钠溶液洗2~3次，用无水硫酸镁干燥，旋转蒸发氯仿得到黑红色固体物质，用甲苯重结晶制得淡黄色粉末状中间物质2-氨基-甲基-1，8-萘啶AMND，所述2，6- 二氨基吡啶与4，4- 二甲氧基-2- 丁酮的摩尔比为1:1 ; (b)称取罗丹明固体溶于盛有适量无水1，2-二氯乙烷的第二反应釜中，通氩气并用磁力搅拌器搅拌，再向第二反应釜中逐滴加入三氯氧磷，然后加热至回流反应4~5小时，真空干燥除去反应液后溶于盛有适量干燥乙腈的第三反应釜中，称取适量的AMND加入干燥乙腈中溶解并加入适量三乙胺混匀后逐滴加入到第三反应釜中，加热回流5~6小时，冷至室温，真空干燥，以体积 比为1:1~2的乙酸乙酯和二氯甲烷为流动相的二氧化硅层析柱纯化制得淡黄色固体，再用体积比为1:20~25正己烷和二氯甲烷的混合溶液重结晶制得白色固体粉末状的目标产物RBS ;所述罗丹明与三氯氧磷的摩尔比为1:10~20，罗丹明与ANDM的摩尔比为1:1~1.5，罗丹明与三乙胺的摩尔比为1:10~30。
3.一种拟核酸碱基为识别位点的罗丹明荧光探针，其特征是在核苷酸影像上的应用。
【文档编号】G01N33/52GK103540312SQ201310470715
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月9日 优先权日:2013年10月9日
【发明者】段春迎, 孔继川, 何成, 张奉禄 申请人:大连理工大学