一种含通用碱基寡核苷酸序列及其在dna杂交分析中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种含通用碱基寡核苷酸序列及其在DNA杂交分析中的应用。所述含通用碱基寡核苷酸序列包括基本碱基和通用碱基，所述基本碱基与目标序列完全互补，其中包括与目标序列SNV位点对应的基本碱基；所述通用碱基不能对应目标序列SNV位点，位于与目标序列SNV位点对应的基本碱基的一侧或两侧；所述基本碱基为A、G、C、T，所述通用碱基是与A、G、C、T都能形成氢键配对的核苷。本发明的最大优点是实现了DNA序列中单碱基错配的有效分析。
【专利说明】—种含通用碱基寡核苷酸序列及其在DNA杂交分析中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及寡核苷酸领域，具体涉及一种含通用碱基寡核苷酸序列及其在DNA杂交分析中的应用。
【背景技术】
[0002]随着人类基因组进化的完成，对人类基因组的研究从测定DNA序列、解释所有遗传信息的研究层面转移到从分子整体水平对生物学功能进行研究的层面上来，从而更好利用基因信息进行疾病诊断、治疗和预防，达到认识生命、保护生命的目的。研究与遗传表型相关的DNA序列变异是遗传学研究的主题之一，人类基因组序列的变异大多数是单核苷酸的改变(single nucleotide variation, SNV)(包括单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism, SNP)和点突变(Mutation)),而且在不同的人群中，SNV的频率分布有差异，这些差异可以代表某一种族或人群间的遗传差异。因此，研究SNV有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病的易感性，以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。SNV自身的特性决定了它比其他多态性标记更适合于对复杂性状与疾病关系的遗传解剖和基于群体的基因识别等方面的研究。SNV可以被用作遗传标记进行连锁分析，定位疾病易感基因，而且其定位的精度比微卫星标记精细得多，可以直接用于指导易感基因克隆。正像许多研究者认为:对于这些分子标记的认识将会使哮喘、糖尿病、精神分裂症和癌症等疾病相关基因的发现变得简单，同时SNV也可以被用作疾病的关联分析。目前应用于SNV位点的分型方法主要基于四种基本原理:即内切酶酶切技术、等位基因特异性杂交、引物延伸和寡核苷酸连接技术。基于酶切技术检测方法的前提是待检测的SNV位点的两侧需含有限制性内切酶识别序列，因此SNV位点不导致酶切位点的改变的序列则无法分析。而其余三种技术在原理上对分析序列则无任何限制，并且可以结合基因芯片技术进行高通量分析。
[0003]基因芯片(gene chip),也叫DNA芯片、DNA微阵列(DNA microarray)、寡核昔酸阵列(Oligonucleotide array),是在玻片等载体上有序地、高密度地固定不同的祀序列或寡核苷酸片段。目前，基因芯片已广泛用于发现疾病相关基因、建立疾病诊断指标和基础生物学及医学研究领域。基因芯片一个最重要的应用是分析和检测不同有机体基因组之间的序列差异，这些差异主要包括突变和单核苷酸多态性。尽管基因芯片结合其它技术衍生出诸多不同的SNV分析技术:如基于DNA芯片的杂交分型技术；基于DNA芯片的单碱基延伸-标签分型技术；基于DNA芯片的寡核苷酸连接分型技术；基于DNA芯片和多重PCR扩增的分型方法等。但这些技术的核心本质实际上就是以大规模集成的固相杂交技术为前提的，每个分析序列都需要与探针序列有特异性的杂交，因此特异性探针序列的杂交是这些分析方法准确性的一个十分重要的指标。
[0004]现有基因芯片中特异性探针序列的是由喊基A、G、C、T组成，根据目标对象的序列、按照特定的Tm值来设计的。探针序列设计可以调变的方式包括序列的长度和种类，即通过选定目标序列一段或者几段序列，设计出与目标序列匹配的一条或者多条探针序列，最后通过以杂交为本质的分析技术实施对样品的信号检测，得出目标样品的遗传信息(基因序列及基因表达的信息)。很明显，这种通过选定某个特定片段作为杂交区域，只能依靠改变碱基数目这一个条件来确定Tm值的探针序列设计方式无疑受到了很大的限制。一方面，对于数目较多的DNA芯片而言，要将所有序列尽可能设计成相近的Tm值本身就是一个困难；另一方面，即使DNA芯片上所有序列设计的Tm值相近，但能否有效区分单碱基错配也存在问题，因为单碱基错配的区分往往需要更苛刻的条件才能实现，如在优化杂交温度降低非特异性序列杂交的前提下，还需要通过强化清洗的强度(如在特定温度下进行洗涤)、或者采用电场电泳等手段，来清除非特异性杂交的探针序列。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种含通用碱基寡核苷酸序列，通过在寡核苷酸序列中引入通用碱基，利用其能够和四个基本碱基形成弱氢键配对的特点，有效区分单碱基错配序列，解决了现有技术中不能有效区分单碱基错配的问题。本发明还提供了该含通用碱基寡核苷酸序列在DNA杂交分析中的应用。
[0006]为解决上述问题，本发明采用以下技术方案:
[0007]一种含通用碱基寡核苷酸序列，所述含通用碱基寡核苷酸序列包括基本碱基和通用碱基，所述基本碱基与目标序列完全互补，其中包括与目标序列SNV位点对应的基本碱基；所述通用喊基不能对应目标序列SNV位点，位于与目标序列SNV位点对应的基本喊基的一侧或两侧；所述基本碱基为A、G、C、T，所述通用碱基是与A、G、C、T都能形成氢键配对的核苷。
[0008]所述基本碱基为11-50个；所述通用碱基为1-8个。
[0009]所述基本碱基为13-18个；所述通用碱基为2-4个。
[0010]所述通用碱基为次黄嘌呤脱氧核苷、2’脱氧核糖-3’硝基吡咯或2’脱氧核糖-5’硝基吲哚。
[0011]所述含通用碱基寡核苷酸序列包含标记物或不包含标记物。
[0012]上述含通用碱基寡核苷酸序列在DNA杂交分析中的应用。
[0013]上述含通用碱基寡核苷酸序列在DNA杂交芯片分析中的应用。
[0014]本发明的原理:在核酸中有一类通用核苷能够和A、G、C、T四个基本碱基通过形成氢键而实现配对，这类核苷被称为通用碱基，其种类众多，如次黄嘌呤脱氧核苷(脱氧肌苷)、2’脱氧核糖-3’硝基吡咯等。本发明就是通过在序列中引入通用碱基，利用其能够和四个基本碱基形成弱氢键配对的特点，有效区分单碱基错配序列。在序列中引入一个或者若干个通用碱基，该序列的浓度动力学因素会得到加强，而热力学因素会得到减弱。一方面，对于完全匹配的序列而言，虽然含通用碱基序列与完全匹配序列杂交形成双螺旋结构的稳定性相对于以前由正常碱基序列与完全匹配序列杂交形成双螺旋结构的稳定性要低，但仍然能够保障杂交的有效实施，维持其正常的生物化学功能；而对于单碱基错配序列而言，除了错配碱基外，又增加了形成双螺旋结构稳定性更低的通用碱基，那么这种稳定性就比原来正常碱基序列要低更多，因此，在一个容易操作的条件下，含通用碱基序列与单碱基错配序列这种双螺旋结构就可能不能形成，或者遭到破坏，这样就能够有效区分单碱基错配序列。
[0015]本发明的有益效果:
[0016]1.本发明的最大优点是实现了 DNA序列中单碱基错配的有效分析。在保障序列与完全匹配序列维持有效杂交和正常生物化学功能条件下，大幅度降低单碱基错配序列的杂交稳定性，提高单碱基错配的区分能力，增加核酸序列中SNV分析的准确性，为分析核酸序列中SNV提供一种准确，重复性好，快速和便宜的分型技术。
[0017]2.本发明含通用碱基寡核苷酸序列可以采用传统的DNA化学合成法制备得到，其使用方法和操作步骤均按照流行的分子生物学方法进行，容易在现有的技术上实施。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是传统探针和含通用碱基探针分别与固定的DNA序列的杂交模式
[0019]a、DNA序列与完全互补传统探针序列的杂交；b、DNA序列与单碱基错配传统探针序列的杂交；c、DNA序列与完全互补含通用碱基次黄嘌呤脱氧核苷探针序列的杂交；d、DNA序列与单碱基错配含通用碱基次黄嘌呤脱氧核苷探针序列的杂交。
[0020]图2是固定的传统探针和含通用碱基探针分别与标记DNA序列的杂交模式
[0021]a、传统探针序列与标记DNA序列的完全互补杂交；b、传统探针序列与标记DNA序列有一个单碱基错配的杂交；c、含通用碱基次黄嘌呤脱氧核苷探针序列与标记DNA序列的完全互补杂交；d、含通用碱基次黄嘌呤脱氧核苷探针序列与标记DNA序列有一个单碱基错配的杂交。
[0022]图3是80个样本线粒体突变位点C3206T的DNA芯片分析结果Cy3扫描图。
[0023]图4是80个样本线粒体突变位点C3206T的DNA芯片分析结果Cy5扫描图。
[0024]图5是人类rs988748位点的DNA芯片分析结果Cy3扫描图
[0025]a、野生型纯合子Cy3扫描图；b、杂合子Cy3扫描图；c、突变型纯合子Cy3扫描图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合实施例和附图对本发明做更进一步的解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
[0027]一种含通用碱基寡核苷酸序列，所述含通用碱基寡核苷酸序列包括基本碱基和通用碱基，所述基本碱基与目标序列完全互补，其中包括与目标序列SNV位点对应的基本碱基；所述通用喊基不能对应目标序列SNV位点，位于与目标序列SNV位点对应的基本喊基的一侧或两侧，这样可以确保序列杂交的特异性；所述基本碱基为A、G、C、T ;所述通用碱基是与A、G、C、T都能形成氢键配对的核苷，包括但不局限于次黄嘌呤脱氧核苷、2’脱氧核糖-3’硝基吡咯、2’脱氧核糖_5’硝基吲哚等。
[0028]所述含通用碱基寡核苷酸序列中的基本碱基和通用碱基的序列和数目是根据具体的分析目标序列来设计，并最终通过实验确定的。含通用碱基寡核苷酸序列的Tm值与实验的杂交温度相关，一般高于杂交温度I~5°C。基本碱基和通用碱基的数目应尽可能小，一般为11-50个,其中通用碱基的数目为1-8个；优选地为13-18个,其中通用碱基的数目为2-4个。该含通用碱基寡核苷酸序列能够与目标互补序列完成正常的杂交反应，并维持杂交序列的延伸(合成)，连接等生物化学功能，用于DNA芯片中对核酸序列的分析；但对单碱基错配序列不能形成双螺旋杂交结构，或者虽然能够形成不稳定的双螺旋结构，但这种双螺旋结构能够在温和条件下被破坏。
[0029]所述含通用碱基寡核苷酸可以包含标记物，也可以不包含标记物。包含标记物的含通用碱基寡核苷酸序列直接用于DNA杂交检测，尤其是DNA芯片杂交及检测；不含标记物的含通用碱基寡核苷酸先与目标序列杂交，然后杂交的寡核苷酸序列通过延伸、连接等生化反应实现对目标序列的检测。
[0030]如图1所示，图中检测序列I为DNA (如PCR产物)序列的局部；探针2和3是由碱基A、G、C、T构成的传统杂交探针，其中探针2与检测序列I完全互补，而探针3与检测序列I有一个单碱基错配；探针4和5是引入通用碱基次黄嘌呤脱氧核苷(I)的本发明的杂交探针，其中探针4与检测序列I完全互补，而探针5与检测序列I有一个单碱基错配；颜料6和7为标记不同的的荧光分子。在传统杂交探针中，由于探针3和检测序列I之间只有一个碱基错配，而其余碱基均正配，因此需要严格的杂交和杂交后处理条件，才能保障探针3和检测序列I之间不发生杂交；而在含通用碱基次黄嘌呤脱氧核苷的本发明的杂交探针5而言，对于与检测序列I之间的杂交，除了单个错配碱基外，又增加了形成双螺旋结构稳定性更低的通用碱基，因此在一个容易操作的条件下，这种双螺旋结构就可能不能形成，而只有探针4能够与检测序列形成杂交，而探针5则不能与检测序列形成杂交。
[0031]如图2所示，图中检测序列8为标记DNA(如PCR产物)序列的局部；探针9和10是由碱基A、G、C、T构成的传统杂交探针，其中探针9与检测序列8完全互补，而探针10与检测序列8有一个单碱基错配；探针11和12是引入通用碱基次黄嘌呤脱氧核苷(I)的本发明的杂交探针，其中探针11与检测序列8完全互补，而探针12与检测序列8有一个单碱基错配；颜料6为标记的的荧光分子。在传统杂交探针中，由于探针10和检测序列8之间只有一个碱基错配，而其余碱基均正配，因此需要严格的杂交和杂交后处理条件，才能保障探针10和检测序列8之间不发生杂交；而在含通用碱基次黄嘌呤脱氧核苷的本发明的杂交探针11和12而言，而只有探针11能够与检测序列形成杂交，而探针12则不能与检测序列形成杂交。
[0032]实施例1人类线粒体突变位点C3206T分析
[0033](I)、DNA 提取
[0034]80个外周血样品采用传统的蛋白激酶K与苯酚/氯仿抽提法提取外周血中的基因组 DNA。
[0035](2)、PCR 反应
[0036]正向引物SEQ ID N0:1所示(5,氨基修饰(NH2)):
[0037]5' -NH2-TTTTTTTTTTGCAGCCGCTATTAAAGGTTCG-3'
[0038]反向引物SEQ ID NO:2所示:
[0039]5' -GGGCTCTGCCATCTTAACAAA-3'
[0040]采用上述正向引物和反向引物对不同的DNA样本中含线粒体突变位点C3206T的片段进行了 PCR扩增。25 μ I的PCR扩增体系包含:200ng基因组DNA，0.2mM dNTP, 0.8 μ M的正向引物和0.8 μ M反向引物，IU Taq DNA聚合酶，I X扩增缓冲液，1.5mMMgCl2。扩增条件:94°C预变性5分钟，35个热循环:94°C变性30秒~55°C退火45秒~72°C延伸45秒，最后72°C延伸7分钟，得到PCR产物。[0041](3)、PCR产物的处理
[0042]加4倍PCR产物量的_20°C的95%乙醇于PCR产物中，在_20°C冷冻状态下放置3小时，10000转速下离心4分钟，将上层清液移出，并在50°C干燥30分钟，得到PCR乙醇纯化沉淀物。
[0043](4)、DNA芯片的制备
[0044]用含I~2%的1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的水溶液溶解PCR乙醇纯化沉淀物,并将溶解物转移到384孔板中，用DNA芯片点样仪点样，每个样本重复4次，制备PCR产物DNA芯片。点样完成后，DNA芯片在37°C，湿度80%的条件下水化3h，然后分别用2XSSC/0.5%SDS、0.1XSSC/0.5%SDS、双蒸水洗涤DNA芯片，其中SSC表示柠檬酸钠缓冲液，SDS表示十二烷基磺酸钠。
[0045](5)、DNA芯片的杂交
[0046]用含有通用碱基次黄嘌呤脱氧核苷(I)的探针杂交PCR产物DNA芯片，I μ M的探针混合杂交液(0.5 μ M探针一检测野生型，0.5 μ M探针二检测突变型)均匀分布到PCR产物DNA芯片上，然后用盖玻片覆盖反应区域，并且减少反应液的蒸发，在37°C反应0.5h。
[0047]探针一 SEQ ID NO: 3所示(5' Cy3荧光染料标记(Cy3 )):
[0048]5' -Cy3 - GGIIGTGGGIITA-3'
[0049]探针二 SEQ ID NO:4所示(5' Cy5荧光染料标记(Cy5)):
[0050]5' -Cy5-GGIIGTAGGIITA-3;
[0051](6)、杂交信号的获取与分析
[0052]杂交反应完成后，分别用2 X SSC/0.5%SDS, 0.1 X SSC/0.5%SDS洗涤液洗涤DNA芯片，最后用用双蒸水清洗玻片上的洗涤液，然后将DNA芯片用扫描仪扫描Cy3和Cy5的荧光信号。如图3和图4所示，80个样本的分析结果表明，按照样本在384孔板中的顺序，除第
4、34、35、36、38、39、79为突变型外，其余样本均为野生型。
[0053]实施例2人类rs988748位点的SNP检测
[0054](1)、DNA芯片的制备
[0055]将2个检测人类rs988748位点的探针三和探针四，分别用含I~2%的1- (3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的水溶液配制成4μ M的探针浓度，并转移到384孔板中，用DNA芯片点样仪点样，每个样本重复2次，制备2 X 2阵点的DNA芯片。点样完成后，DNA芯片在37°C，湿度80%的条件下水化3h，然后分别用2XSSC/0.5%SDS、0.1 X SSC/0.5%SDS、双蒸水洗涤DNA芯片。
[0056]探针三SEQ ID NO: 5所示(5'氨基修饰(NH2 )):
[0057]5' -NH2-TTTTTTTTTTAGGnCTCTGI IGTA-3'
[0058]探针四SEQ ID N0:6所示(5'氨基修饰(NH2)):
[0059]5' -NH2-TTTTTTTTTTAGGnCTGTGI IGTA-3'
[0060](2)、PCR 反应
[0061]正向引物SEQ ID NO:7所示:
[0062]5' -TAGGGTTCCTCCAGTCCTTT-3'
[0063]反向引物SEQ ID NO:8所示:
[0064]5' -CAGCACAGATGGCAGAGTTTA-3'[0065]采用上述正向引物和反向引物对DNA样本进行非对称PCR扩增。25 μ I的PCR扩增体系包含:200ng从人血液样本中提取的基因组DNA，0.2mM dNTP (其中Cy3_dCTP/dCTP=4/6)，0.2μΜ的正向引物和2.4μΜ反向引物，IU Taq DNA聚合酶，I X扩增缓冲液，1.5mM MgCl20扩增条件:94°C预变性5分钟，40个热循环:95°C变性20秒~57°C退火30秒~72°C延伸30秒，最后72°C延伸5分钟。
[0066](3)、DNA芯片的杂交
[0067]将PCR反应液加热至95°C，然后在冰上快速冷却，并将冷却后的PCR反应液均匀分布到DNA芯片上，然后用盖玻片覆盖反应区域，并且减少反应液的蒸发，在37°C反应0.5h。
[0068](4)、杂交信号的获取与分析
[0069]杂交反应完成后，分别用2 X SSC/0.5%SDS, 0.1 X SSC/0.5%SDS洗涤液洗涤DNA芯片，然后用双蒸水清洗DNA芯片上的洗涤液，最后将DNA芯片用扫描仪扫描Cy3的荧光信号。按照2个探针在DNA芯片上的位置分布，如果DNA芯片只有探针三具有明显的Cy3的荧光信号，则可以判断样本的rs988748位点为野生型纯合子如图5a所示；如果DNA芯片只有探针四具有明显的Cy3的荧光信号，则可以判断样本的rs988748位点为突变型纯合子，如图5c所示；如果DNA芯片探针三和探针四均具有明显的Cy3的荧光信号，则可以判断样本的rs988748位点为杂合子图5b所示。
【权利要求】
1.一种含通用碱基寡核苷酸序列，其特征在于，所述含通用碱基寡核苷酸序列包括基本碱基和通用碱基，所述基本碱基与目标序列完全互补，其中包括与目标序列SNV位点对应的基本碱基；所述通用碱基不能对应目标序列SNV位点,位于与目标序列SNV位点对应的基本碱基的一侧或两侧；所述基本碱基为A、G、C、T，所述通用碱基是与A、G、C、T都能形成氢键配对的核苷。
2.根据权利要求1所述的含通用碱基寡核苷酸序列，其特征在于，所述基本碱基为11-50个；所述通用碱基为1-8个。
3.根据权利要求2所述的含通用碱基寡核苷酸序列，其特征在于，所述基本碱基为13-18个；所述通用碱基为2-4个。
4.根据权利要求1或2或3所述的含通用碱基寡核苷酸序列，其特征在于，所述通用碱基为次黄嘌呤脱氧核苷、2’脱氧核糖-3’硝基吡咯或2’脱氧核糖-5’硝基吲哚。
5.根据权利要求1或2或3所述的含通用碱基寡核苷酸序列，其特征在于，所述含通用碱基寡核苷酸序列包含标记物或不包含标记物。
6.权利要求1或2或3所述的含通用碱基寡核苷酸序列在DNA杂交分析中的应用。
7.权利要求1或2或3所述的含通用碱基寡核苷酸序列在DNA杂交芯片分析中的应用。`
【文档编号】C12N15/11GK103484458SQ201310469720
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年10月10日 优先权日:2013年10月10日
【发明者】肖鹏峰, 刘必成, 钱晓婷, 王柳, 陈玲 申请人:东南大学