一种从细叶杜香中提取鉴定七叶树素、秦皮苷、秦皮素和白藜芦醇的方法
【专利摘要】本发明涉及一种从细叶杜香中提取鉴定七叶树素、秦皮苷、秦皮素和白藜芦醇的方法，步骤为：原料选取和预处理；加压溶液提取技术提取粗提物，提取温度为115℃，提取时所用甲醇的体积分数为65%，加入甲醇后静止提取时间为20-30min；On-line?HPLC-ABTS+在线鉴定抗氧化组分；保留时间为7.41min的峰即为七叶树素、保留时间为11.71min的峰即为秦皮苷、保留时间为15.22min的峰即为秦皮素、保留时间为17.43min的峰即为白藜芦醇。本发明简化了抗氧化活性成分的提取及鉴定步骤，一次提取过程即可同时完成七叶树素、秦皮苷、秦皮素和白藜芦醇四种抗氧化活性成分的分离鉴定，效率显著提高。
【专利说明】一种从细叶杜香中提取鉴定七叶树素、秦皮苷、秦皮素和白
藜芦醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细叶杜香中抗氧化活性成分的提取鉴定方法，特别涉及一种从细叶杜 香中提取鉴定七叶树素、秦皮苷、秦皮素和白藜芦醇的方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]杜香(Ledum palustre L)是分布我国大小兴安岭、长白山地区的主要天然植物之 一，是杜醇花科杜香属小灌木，分为细叶杜香(Ledum palustre L.var.Angustum E.Busch) 和宽叶杜香(Ledum palustre L.var.dilatatum Wahl),资源十分丰富。杜香广泛应用于 中国传统医学，其功能包括:解毒、戒毒、抗菌、抗癌和抗糖尿病等，常用于治疗风湿病、关 节病、咳嗽、感冒等疾病。现代研究表明，杜香属植物含有丰富的挥发油、萜烯类、黄酮类等 多种生物活性化合物，广东药学院的黄莹、张德志等分离鉴定了七叶内酯、对羟基苯甲酸、 槲皮素、金丝桃苷等化学成分，中国沈阳药科大学的左文健、王金辉等从杜香中鉴定出蒲公 英萜醇、熊果酸、熊果醇、角鲨烯、大戟醇乙酰酯、槲皮素、山奈酚、棉花皮素、正十一烷、正庚 烷等多种化学成分，东北林业大学的赵敏等从杜香中鉴定出32种挥发性成分，相对于众多 的杜香中的各种化学成分分析研究，对杜香的抗氧化活性成分的分离鉴定以及应用方面 还处于初期探索阶段，仅有中国齐齐哈尔大学的郑永杰、裴世春等少数研究人员发表论文 分析鉴定了杜香中的抗氧化活性成分，并利用核磁及质谱等技术确证了杜香中含有秦皮 素、染料木苷等抗氧化活性成分，其研究虽然在抗氧化活性成分的分离鉴定过程中采用了 On-line HPLC-ABTS+在线系统，但是抗氧化成分的提取方法采用的是传统的溶剂萃取法， 不仅提取过程复杂繁琐，且有效成分提取效率不高，无法鉴定出更多的抗氧化活性成分。
[0003]目前，抗氧化活性成分的提取鉴定方法主要分三个步骤，一是抗氧化活性成分的 提取分离，二是抗氧化活性成分的活性分析，三是抗氧化活性成分的结构鉴定。抗氧化活性 成分的提取分离通常包括各种溶剂萃取法、超临界流体萃取法以及结合微波、色谱柱等各 种辅助工具进行的提取、分离、纯化方法。抗氧化活性成分的活性鉴定主要是采用体外或体 内抗氧化活性的测定的方法。成分的结构鉴定主要是采用核磁、各种色谱技术进行。
[0004]传统的抗氧化活性成分的提取鉴定不仅分析时间长，而且操作过程繁琐，特别是 不利于微量抗氧化成分的提取鉴定。
[0005]现代技术中，有两项技术有利于抗氧化成分的快速提取鉴定，一是高压溶液提取 法(PLE, Pressure Liquid Extract), PLE是一种非常先进的提取方法。原理是提取溶液在 高温高压下对样品进行提取，高温帮助液体更好的进入提取物里，减小提取溶液的粘性，提 高扩散率，高压则能够帮助当液体超过沸点时保持液体状态。PLE与传统提取方法比较有着 显著的优点，包括:减少提取时间、减少提取溶液的使用量、减少对环境污染、并且提高提取 率，目前在化合物提取过程中已有应用，包括发明专利号为CN201310055337.8的一种利用 高压溶剂提取橘皮中有效成分的方法及装置等；二是On-line HPLC-DPPH+在线鉴定抗氧化 组分的方法，该方法具有简便快速的特点，专利号为CN102879499A和CN102879500A的专利公开了一种DPPH-HPLC法检测白刺果汁中抗氧化成分的方法和一种DPPH-HPLC法检测黑果 枸杞果汁中抗氧化成分的方法，该方法主要是利用了 DPPH作为检测试剂。
[0006]杜香中含有丰富的抗氧化活性成分，在活性成分的提取过成中需要对其提取过程 进行有效控制，特别是需要一种多种成分同时进行提取鉴定的简便有效的方法。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种从细叶杜香里同时提取鉴定抗 氧化活性成分七叶树素、秦皮苷、秦皮素和白藜芦醇的方法。
[0008]本发明目的通过以下技术方案予以实现，包括如下步骤:
[0009](I)原料选取和预处理:取大兴安岭细叶杜香的嫩枝为原料，经过室温阴干后制成 长度为0.5-1.0cm的前处理样品。
[0010](2)加压溶液提取技术提取粗提物:取预处理样品1-2克与双倍重量的海沙混合 填装于加速溶剂萃取管(ASE)中后放入密闭避光的提取箱中，在提取温度115°C，提取压力 1500psi的条件下，用加速溶剂萃取管容积的60%-70%的体积分数为65%的甲醇静止提取 20-30min后收集溶剂，用加速溶剂萃取管容积的30%_40%的体积分数为65%的甲醇溶液对 加速溶剂萃取管进行冲洗，用氮气将提取溶液全部冲出后收集所有提取溶液，利用旋转蒸 发仪在45-50°C下将提取液制成浸膏粗提物。
[0011](3) On-line HPLC-ABTS+在线鉴定抗氧化组分:将步骤(2)获得的浸膏粗提物用 ImL甲醇溶解并过滤后取5 ii L进样到On-line HPLC-ABTS+在线检测系统中；HPLC的检 测条件设定:移动相A为乙腈，B为水，流速为lmL/min ;冲洗梯度为:0_5min，体积分数为 10%的乙腈；5-30min，体积分数为40%乙腈；30_40min，体积分数为100%乙腈；柱子型号 为 KromasillOO - 5C18Column (250X4.6mm 1.d, 5 y m)，检测波长为 330nm ;2，2-联氮-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)溶液的流速为0.5mL/min,检测波长734nm ；
[0012](4)保留时间为7.41min的峰即为七叶树素、保留时间为11.71min的峰即为秦皮 苷、保留时间为15.22min的峰即为秦皮素、保留时间为17.43min的峰即为白藜芦醇。
[0013]优选的，所述步骤(2)中用加速溶剂萃取管容积的60%_70%的体积分数为65%的 甲醇静止提取25-28min后收集溶剂。
[0014]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0015](I)本发明采用Pressure Liquid Extract (PLE)提取方法，PLE是一种非常先进 的提取方法。原理是提取溶液在高温高压下对样品进行提取，高温帮助液体更好的进入提 取物里，减小提取溶液的粘性，提高扩散率；高压则能够帮助当液体超过沸点时保持液体状 态。PLE与传统提取方法比较有着显著的有点，包括:减少提取时间、减少提取溶液的使用 量、减少对环境污染、并且提闻提取率。
[0016](2)本发明采用On-line HPLC-ABTS+抗氧化成分筛选系统，通过正峰值和副峰值 出现的情况(图1)，能够快速，准确的鉴定抗氧化化合物，并且能够判断其含量与抗氧化能 力。因此On-line HPLC-ABTS+系统是一种鉴定细叶杜香提取物中是否含有抗氧化成分的 一种方便，快速的筛选方法。
【专利附图】
【附图说明】[0017]图1为通过本发明方法提取的抗氧化活性成分七叶树素、秦皮苷、秦皮素和白藜 芦醇的On-line HPLC-ABTS+在线系统检测图。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0019]实施例1 一种从细叶杜香中提取鉴定七叶树素、秦皮苷、秦皮素和白藜芦醇的方 法，包括以下步骤:
[0020](I)原料选取和预处理:取大兴安岭细叶杜香的嫩枝为原料，经过室温阴干后制成 长度为0.5-1.0cm的前处理样品；
[0021](2)加压溶液提取技术提取粗提物:取预处理样品1.5克与双倍重量的海沙混 合填装于加速溶剂萃取管中后放入密闭避光的提取箱中，在提取温度115°C，提取压力 1500psi的条件下,用加速溶剂萃取管容积的65%的体积分数为65%的甲醇静止提取26min 后收集溶剂，用加速溶剂萃取管容积的35%的体积分数为65%的甲醇溶液对加速溶剂萃取 管进行冲洗，用氮气将提取溶液全部冲出后收集所有提取溶液，利用旋转蒸发仪在47°C下 将提取液制成浸膏粗提物，在此条件下粗提物的产率为49.08mg/g ；
[0022](3) On-line HPLC-ABTS+在线鉴定抗氧化组分:将步骤(2)获得的浸膏粗提物用 ImL甲醇溶解并过滤后取5 ii L进样到On-line HPLC-ABTS+在线检测系统中；HPLC的检 测条件设定:移动相A为乙腈，B为水，流速为lmL/min ;冲洗梯度为:0_5min，体积分数为 10%的乙腈；5-30min，体积分数为40%乙腈；30_40min，体积分数为100%乙腈；柱子型号 为 KromasillOO - 5C18Column (250X4.6mm 1.d, 5 y m)，检测波长为 330nm ;2，2-联氮-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐溶液的流速为0.5mL/min,检测波长734nm ；
[0023](4)保留时间为7.41min的峰即为七叶树素、保留时间为11.71min的峰即为秦皮 苷、保留时间为15.22min的峰即为秦皮素、保留时间为17.43min的峰即为白藜芦醇，如图1所示。
[0024]实施例2 —种从细叶杜香中提取鉴定七叶树素、秦皮苷、秦皮素和白藜芦醇的方 法，包括以下步骤:
[0025](I)原料选取和预处理:取大兴安岭细叶杜香的嫩枝为原料，经过室温阴干后制成 长度为0.5-1.0cm的前处理样品；
[0026](2)加压溶液提取技术提取粗提物:取预处理样品1.1克与双倍重量的海沙混 合填装于加速溶剂萃取管中后放入密闭避光的提取箱中，在提取温度115°C，提取压力 1500psi的条件下，用加速溶剂萃取管容积的60%的体积分数为65%的甲醇静止提取22min 后收集溶剂，用加速溶剂萃取管容积的30%的体积分数为65%的甲醇溶液对加速溶剂萃取 管进行冲洗，用氮气将提取溶液全部冲出后收集所有提取溶液，利用旋转蒸发仪在45°C下 将提取液制成浸膏粗提物，在此条件下粗提物的产率为47.55mg/g ；
[0027](3) On-line HPLC-ABTS+在线鉴定抗氧化组分:将步骤(2)获得的浸膏粗提物用 ImL甲醇溶解并过滤后取5 ii L进样到On-line HPLC-ABTS+在线检测系统中；HPLC的检测条件设定:移动相A为乙腈，B为水，流速为lmL/min ;冲洗梯度为:0_5min，体积分数为 10%的乙腈；5-30min，体积分数为40%乙腈；30_40min，体积分数为100%乙腈；柱子型号 为 KromasillOO - 5C18Column (250X4.6mm 1.d, 5 y m)，检测波长为 330nm ;2，2-联氮-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐溶液的流速为0.5mL/min,检测波长734nm ；
[0028](4)保留时间为7.41min的峰即为七叶树素、保留时间为11.71min的峰即为秦皮 苷、保留时间为15.22min的峰即为秦皮素、保留时间为17.43min的峰即为白藜芦醇，如图1所示。
[0029]实施例3 —种从细叶杜香中提取鉴定七叶树素、秦皮苷、秦皮素和白藜芦醇的方 法，包括以下步骤:
[0030](I)原料选取和预处理:取大兴安岭细叶杜香的嫩枝为原料，经过室温阴干后制成 长度为0.5-1.0cm的前处理样品；
[0031](2)加压溶液提取技术提取粗提物:取预处理样品2克与双倍重量的海沙混合填 装于加速溶剂萃取管中后放入密闭避光的提取箱中，在提取温度115°C，提取压力1500psi 的条件下，用加速溶剂萃取管容积的70%的体积分数为65%的甲醇静止提取29min后收集 溶剂，用加速溶剂萃取管容积的39%的体积分数为65%的甲醇溶液对加速溶剂萃取管进行 冲洗，用氮气将提取溶液全部冲出后收集所有提取溶液，利用旋转蒸发仪在50°C下将提取 液制成浸膏粗提物，在此条件下粗提物的产率为48.15mg/g ；
[0032](3) On-line HPLC-ABTS+在线鉴定抗氧化组分:将步骤(2)获得的浸膏粗提物用 ImL甲醇溶解并过滤后取5 ii L进样到On-line HPLC-ABTS+在线检测系统中；HPLC的检 测条件设定:移动相A为乙腈，B为水，流速为lmL/min ;冲洗梯度为:0_5min，体积分数为 10%的乙腈；5-30min，体积分数为40%乙腈；30_40min，体积分数为100%乙腈；柱子型号 为 KromasillOO - 5C18Column (250X4.6mm 1.d, 5 y m)，检测波长为 330nm ;2，2-联氮-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐溶液的流速为0.5mL/min,检测波长734nm ；
[0033](4)保留时间为7.41min的峰即为七叶树素、保留时间为11.71min的峰即为秦皮 苷、保留时间为15.22min的峰即为秦皮素、保留时间为17.43min的峰即为白藜芦醇，如图1所示。
【权利要求】
1.一种从细叶杜香中提取鉴定七叶树素、秦皮苷、秦皮素和白藜芦醇的方法，其特征在 于，包括以下步骤:(1)原料选取和预处理:取大兴安岭细叶杜香的嫩枝为原料，经过室温阴干后制成长度 为0.5-1.0cm的前处理样品；(2)加压溶液提取技术提取粗提物:取预处理样品1-2克与双倍重量的海沙混合填装 于加速溶剂萃取管中后放入密闭避光的提取箱中，在提取温度115°C，提取压力1500psi的 条件下，用加速溶剂萃取管容积的60%-70%的体积分数为65%的甲醇静止提取20-30min 后收集溶剂，用加速溶剂萃取管容积的30%-40%的体积分数为65%的甲醇溶液对加速溶 剂萃取管进行冲洗，用氮气将提取溶液全部冲出后收集所有提取溶液，利用旋转蒸发仪在 45-50°C下将提取液制成浸膏粗提物；(3)On-line HPLC-ABTS+在线鉴定抗氧化组分:将步骤(2)获得的浸膏粗提物用ImL 甲醇溶解并过滤后取5 u L进样到On-line HPLC-ABTS+在线检测系统中；HPLC的检测条 件设定:移动相A为乙腈，B为水，流速为lmL/min ;冲洗梯度为:0_5min，体积分数为10% 的乙腈；5-30min,体积分数为40%乙腈；30-40min,体积分数为100%乙腈；柱子型号 为 KromasillOO - 5C18Column (250X4.6mm 1.d, 5 y m)，检测波长为 330nm ;2，2-联氮-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐溶液的流速为0.5mL/min,检测波长734nm ；(4)保留时间为7.41min的峰即为七叶树素、保留时间为11.71min的峰即为秦皮苷、保 留时间为15.22min的峰即为秦皮素、保留时间为17.43min的峰即为白藜芦醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中用加速溶剂萃取管容积的 60%-70%的体积分数为65%的甲醇静止提取25-28min后收集溶剂。
【文档编号】G01N30/88GK103558324SQ201310511195
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月25日 优先权日:2013年10月25日
【发明者】裴世春, 徐玖亮, 高建伟, 甄玉萍 申请人:齐齐哈尔大学