用于肺癌早中期快速诊断试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于肺癌早中期快速诊断试剂盒，所述捕获抗体包括半乳糖凝集素、细胞角质素片段抗原21-1和人类天冬胺酰基β－羟化酶分别制得的单克隆抗体；所述试剂盒还包括检测抗体，所述检测抗体包括半乳糖凝集素、细胞角质素片段抗原21-1和人类天冬胺酰基β－羟化酶分别制得的HRP标记后的多克隆抗体。本发明的有益效果如下：具有灵敏度高准确性强的特点，其灵敏度及准确性均达到90%以上，另外可以有效降低检测成本、减少操作步骤和降低检测误差。
【专利说明】用于肺癌早中期快速诊断试剂盒及其检测方法
【技术领域】:
[0001]本发明涉及癌症诊断检测用的试剂盒领域，具体为一种用于肺癌早中期快速诊断试剂盒及其检测方法。
【背景技术】:
[0002]肺癌是全球范围内死亡率最高的癌症。这种癌症治疗困难，转移的肺癌尤其难治。大约有75%的肺癌患者在确诊时已经为转移性或晚期，其5年生存率仅为6%。过去数十年来，虽然化疗、放疗和手术等治疗措施有了快速的发展，但肺癌的5年生存率仍然较低。主要是因为还没有一种安全的方法可以对其进行筛选，在疾病的早期——治疗的最佳时机，就及时发现患者罹患肺癌的可能性微乎其微。
[0003]目前迫切需要一种有效的筛选策略。当CT扫描不清楚，血液测试能帮助医生做出更好的判断。对无症状患者采用CT扫描进行筛选，既昂贵又危险。这种筛选有很高的假阳性，其中一些患者将接受不必要的肺部活组织检查。
[0004]肿瘤标志物(tumor markers,TM)是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身合成、释放，或由机体对肿瘤细胞反应而产生的标志肿瘤存在和生长的一类物质。这些物质在正常成人中不存在或者是在癌症患者中出现的水平显著高于正常人。目前肿瘤标志物检测技术被认为是早期发现无症状微灶肿瘤的唯一途径，这一检测技术可先于X光片、超声、CT、MRI或PET-CT等物理检查发现肿瘤。可用于高危人群恶性肿瘤的筛查，肿瘤诊断与鉴别诊断，评估治疗的效果，预测或监视肿瘤复发或转移。目前，医院出现的肺癌诊断试剂盒都是检测一些常见的肿瘤标记物，灵敏性及准确性都偏低。因主要是选定的肿瘤标记物单项检测往往有很大的局限性，难以满足早期快速诊断的要求。
[0005]目前，市场上还没有针对肺癌的快速高效诊断试剂盒问世，严重影响到肺癌早期发现及治疗。
【发明内容】
:
[0006]本发明的目的是针对以上述现有肺癌诊断存在的不足，提供一种灵敏度高、准确性强且使用方便高效的用于肺癌早中期快速诊断试剂盒。
[0007]本发明另一目的是提供一种用于肺癌早中期快速诊断试剂盒的检测方法。
[0008]为了实现本发明目的，本发明采取的技术方案是:用于肺癌早中期快速诊断试剂盒，包括捕获抗体，所述捕获抗体包括半乳糖凝集素和细胞角质素片段抗原21-1(CYFRA21-1)分别制得的单克隆抗体。
[0009]所述捕获抗体还包括人类天冬胺酰基β —羟化酶(HAAH)制得的单克隆抗体。
[0010]所述试剂盒还包括检测抗体，所述检测抗体包括半乳糖凝集素、细胞角质素片段抗原21-1(CYFRA21-1)和人类天冬胺酰基β —羟化酶(HAAH)分别制得的HRP标记后的多克隆抗体。
[0011]所述捕获抗体为将半乳糖凝集素、细胞角质素片段抗原21-1(CYFRA21-1)和人类天冬胺酰基β —羟化酶(HAAH)克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到相应的抗原，将所述抗原免疫哺乳动物得到的相应单克隆抗体。
[0012]所述捕获抗体的制备方法包括的步骤如下:
[0013](I)抗原的制备:把半乳糖凝集素、细胞角质素片段抗原21-1及人类天冬胺酰基β —羟化酶的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原，此抗原也可作为标准品用；
[0014](2)捕获抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的单克隆抗体为捕获抗体。
[0015]所述检测抗体为将半乳糖凝集素、细胞角质素片段抗原21-1 (CYFRA21-1)和人类天冬胺酰基β —羟化酶(HAAH)克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到相应的抗原，将所述抗原免疫哺乳动物得到的相应多克隆抗体，对所述多克隆抗体进行HRP标记。
[0016]所述检测抗体的制备方法包括的步骤如下:
[0017](I)抗原的制备:把半乳糖凝集素、细胞角质素片段抗原21-1及人类天冬胺酰基β —羟化酶的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原，此抗原也可作为标准品用；
[0018](2)检测抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的多克隆抗体为检测抗体；
[0019](3) HRP标记:对所述多克隆抗体进行HRP标记。
[0020]所述半乳糖凝集素优选半乳糖凝集素-3和半乳糖凝集素_8。
[0021]所述捕获抗体预先包被于微量滴定板的孔内，可以简化步骤，提高检测效率。
[0022]用于肺癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法，其包括以下步骤:
[0023](I)抗原的制备:将半乳糖凝集素、细胞角质素片段抗原21-1及人类天冬胺酰基β —羟化酶的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作为标准品用。
[0024](2)捕获抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体。
[0025](3)检测抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，对所述多克隆抗体进行HRP标记。本发明检测抗体具有标记功能，可以省去标记抗体以及添加标记抗体的操作步骤，有效的节约成本，减少操作步骤，降低检测误差。
[0026](4)捕获抗体包被:
[0027]①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(ρΗ9.6)将浓度为I μ g/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔；②.封盖微量滴定板并在4°C下孵育过夜；③.弃去包被液(碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体)，并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200 μ IPBST (磷酸盐吐温缓冲液)，在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4°C环境中备用。
[0028](5)封闭:每孔添加200 μ I封闭缓冲液(1.2% BSA/PBS)，封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。
[0029]用于肺癌早中期快速诊断试剂盒的检测方法，其包括以下步骤:[0030](I)抗原的制备:将Galectin-3，HAAH及CYFRA21-1基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原；
[0031](2)捕获抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；
[0032](3)检测抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，对所述多克隆抗体进行HRP标记；
[0033](4)捕获抗体包被:
[0034]①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)将浓度为I μ g/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔；
[0035]②.封盖微量滴定板并在4°C下孵育过夜；
[0036]③.弃去包被液(碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体)，并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸盐吐温缓冲液)，在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4°C环境中备用。
[0037](5)封闭
[0038]①.在微量滴定板的每个孔添加200 μ I封闭缓冲液(1.2% BSA/PBS)，封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点；
[0039]②.封盖微量滴定板并在37°C孵育I小时；
[0040](6)加样
[0041]①.将100μ I的样品添加到微量滴定板的每个孔，在37°C下孵育60分钟；要得到准确的定量结果，通常做法是比较未知样品与标准曲线的信号。每个酶标板都必须测定标准品(两重测定或三重测定)和空白样，以确保准确性；
[0042]②.弃去样品，并洗涤微量滴定板三次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸盐吐温缓冲液);
[0043]③.将100 μ I浓度为0.5 μ g/ml的检测抗体添加到每个孔；
[0044]④.封盖微量滴定板并在37°C下孵育I小时；
[0045]⑤.用PBST洗涤微量滴定板四次；
[0046](7)检测
[0047]①.将TMB (3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)溶液添加到每个孔，孵育15-30分钟，添加等体积的终止液，然后在450nm处读取光密度。
[0048]②.由系列稀释液得到的数据绘制标准曲线，浓度标在X轴(对数标度)上，而吸光度标在Y轴(线性标度)上。通过内插法在此标准曲线上得出样品浓度。
[0049]本发明从众多的肿瘤标记物中，通过各种不同的排列组合，筛选出3个肿瘤标记物(半乳糖凝集素-3，人类天冬胺酰基β-羟化酶(HAAH)，细胞角质素片段抗原21-KCYFRA21-1)组成肺癌快速诊断试剂盒。其中，人类天冬胺酰基β —羟化酶(HumanAsparty 1/AsparaginyI β -hydroxylase, ΗΑΑΗ)是胚胎期即存在于细胞内的一种酶，属于依赖α-酮戊二酸双加氧酶家族，可催化特定蛋白中表皮生长因子(EGF)受体样结构域的天冬氨酸或天冬酰胺残基上的β —碳原子羟基化。研究表明HAAH在肿瘤细胞表面的高表达，是一种新型恶性肿瘤高特异性的分子标记物。最近的研究也证实HAAH是肺癌的理想标记物。半乳糖凝集素_3(Galectin-3)是一种半乳糖结合蛋白，是Glectin家族中唯一具有嵌合结构的成员。半乳糖凝集素-3 (Galectin-3)广泛分布于肿瘤组织中，半乳凝素_3的表达同其肿瘤的侵袭和转移密切相关。Galectin-3可与细胞表面糖基化的CD98结合促使整合素在细胞表面聚集成簇，间接增强整合素与其配体的亲和力；也能直接结合整合素α?β?和⑶Ilb / 18，正性或负性调节整合素的活性，影响整合素与细胞外配体的结合。Galectin-3还可以增加整合素在细胞表面的表达，并促进胶原在细胞间隔的分泌。由于半乳糖凝集素-3对多聚糖有亲和力，它也可以直接结合糖基化的细胞外基质成分，介导细胞与基质的黏附。研究显示肺癌患者血清中Galectin-3水平明显超过健康人群。细胞角质素片段抗原21-1(CYFRA21-1)是细胞角蛋白19 (CYK-19)的可溶性片段，CYK-19广泛分布在正常组织表面，如层状或鳞状上皮中。在恶性上皮细胞中，激活的蛋白酶加速了细胞的降解，使得大量细胞角蛋白片段CYFRA21-1释放入血，在恶性肺癌组织中，CYFRA21-1含量丰富，尤其是在肺鳞癌中有高表达。
[0050]与现有技术相比，本发明的有益效果如下:具有灵敏度高准确性强的特点，其灵敏度及准确性均达到90%以上，另外可以有效降低检测成本、减少操作步骤和降低检测误差。
【专利附图】
【附图说明】
[0051]图1是本发明用于肺癌早中期快速诊断试剂盒的原理图；
[0052]图2是本发明用于肺癌早中期快速诊断试剂盒的检测抗体最佳工作浓度的选择对比图；
[0053]图3是本发明用于肺癌早中期快速诊断试剂盒在肺癌治疗前后血中检测到Galectin-3的变化对 比图；
[0054]图4是本发明用于肺癌早中期快速诊断试剂盒在肺癌治疗前后血中检测到CYFRA21-1的变化对比图；
[0055]图5是本发明用于肺癌早中期快速诊断试剂盒在肺癌治疗前后血中检测到HAAH的变化对比图。
【具体实施方式】
[0056]以下结合附图和具体实施例对本发明用于肺癌早中期快速诊断试剂盒进行详细的描述说明。
[0057]用于肺癌早中期快速诊断试剂盒，包括捕获抗体，捕获抗体封闭缓冲液，标准品，标记HRP的检测抗体，洗涤液及显色液等。所述捕获抗体包括半乳糖凝集素和细胞角质素片段抗原21-1(CYFRA21-1)分别制得的单克隆抗体；通过对半乳糖凝集素和细胞角质素片段抗原21-1(CYFRA21-1)的共同快速检测，可以有效的提高检测准确率和灵敏度，有效的克服单凭检测CYFRA21-1导致的不足。
[0058]所述捕获抗体还包括人类天冬胺酰基β —羟化酶(HAAH)制得的单克隆抗体，通过检测半乳糖凝集素、细胞角质素片段抗原21-1(CYFRA21-1)以及人类天冬胺酰基β —羟化酶(HAAH)，使其灵敏度及准确性均达到90%以上。
[0059]所述捕获抗体为将半乳糖凝集素、细胞角质素片段抗原21-1 (CYFRA21-1)和人类天冬胺酰基β —羟化酶(HAAH)克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到相应的抗原，将所述抗原免疫哺乳动物得到的相应单克隆抗体。
[0060]所述捕获抗体的制备方法包括的步骤如下:
[0061](I)抗原的制备:通过分子克隆的方法把Galectin-3，HAAH及CYFRA21-1基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原，此抗原也可作为标准品用；所述抗原的制备也可以使用现有常规方法制备，在此不再累赘。
[0062](2)捕获抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的单克隆抗体为捕获抗体。所述哺乳动物是小鼠及兔子，优选小鼠。所述捕获抗体的制备也可以使用现有常规方法制备，在此不再累赘。
[0063]所述检测抗体包括半乳糖凝集素、细胞角质素片段抗原21-1 (CYFRA21-1)和人类天冬胺酰基β —羟化酶(HAAH)分别制得的HRP标记后的多克隆抗体。
[0064]所述检测抗体为将半乳糖凝集素、细胞角质素片段抗原21-1 (CYFRA21-1)和人类天冬胺酰基β —羟化酶(HAAH)克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到相应的抗原，将所述抗原免疫哺乳动物得到的进行HRP标记后的多克隆抗体。所述检测抗体的制备方法包括的步骤如下:
[0065](I)抗原的制备:通过分子克隆的方法把半乳糖凝集素、细胞角质素片段抗原21-1及人类天冬胺酰基β —羟化酶的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原，此抗原也可作为标准品用；
[0066](2)检测抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应多克隆抗体；
[0067](3) HRP标记:对所述多克隆抗体进行HRP标记。
[0068]所述哺乳动物是小鼠及兔子，优选兔子。对所述多克隆抗体进行HRP标记可以使用目前常规的现有方法。
[0069]其中，所述半乳糖凝集素优选半乳糖凝集素-3或者半乳糖凝集素-8 ;所述细胞角质素片段抗原21_1优选血清细胞角质素片段抗原21_1。
[0070]其中，所述捕获抗体可以预先包被于PVC材质的微量滴定板的孔内，可以简化步骤，提高检测效率。
[0071]用于肺癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法，其包括以下步骤:
[0072](I)抗原的制备:通过分子克隆的方法将Galectin-3，HAAH及CYFRA21-1基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作为标准品用；
[0073](2)捕获抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；
[0074](3)检测抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，对所述多克隆抗体进行HRP标记；所述检测抗体具有标记功能,可以省去标记抗体以及添加标记抗体的操作步骤，有效的节约成本，减少操作步骤，降低检测误差。
[0075](4)捕获抗体包被:
[0076]①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)将浓度为I μ g/ml的捕获抗体包被于微量滴定板的孔；
[0077]②.用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在4°C下孵育过夜；
[0078]③.弃去包被液(碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体)，并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸盐吐温缓冲液)，在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4°C环境中备用；所述洗涤液为PBS (磷酸盐缓冲液)中加入一定量的TWeen20，所述Tween20的质量百分比浓度为0.05% ；
[0079](5)封闭
[0080]①.在微量滴定板的每孔添加200 μ I封闭缓冲液(为含1.2% BSA (牛血清白蛋白)的PBS (磷酸盐缓冲液))，用于封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点；
[0081]②.封盖微量滴定板并在37°C孵育I小时。
[0082]用于肺癌早中期快速诊断试剂盒的检测方法，其包括以下步骤:
[0083](I)抗原的制备:通过分子克隆的方法将Galectin-3，HAAH及CYFRA21-1基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作为标准品用；
[0084](2)捕获抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；
[0085](3)检测抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，对所述多克隆抗体进行HRP标记；
[0086](4)捕获抗体包被:
[0087]①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)将浓度为I μ g/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔；
[0088]②.用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在4°C下孵育过夜；
[0089]③.弃去包被液(碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体)，并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸盐吐温缓冲液，可以是含0.05%吐温-20的ρΗ7.4的磷酸盐缓冲液)，在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4°C环境中备用；所述洗涤液为PBS (磷酸盐缓冲液)中加入一定量的Tween20，所述Tween20的质量百分比浓度为0.05% ；
[0090](5)封闭
[0091]①.在微量滴定板的每个孔添加200μ I封闭缓冲液(1.2% BSA/PBS)，封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点；
[0092]②.用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在37°C孵育I小时；
[0093](6)加样
[0094]①.将100 μ I适当稀释(稀释20倍)的样品添加到微量滴定板的每个孔，在37°C下孵育60分钟；要得到准确的定量结果，通常做法是比较未知样品与标准曲线的信号。每个酶标板都必须测定标准品(两重测定或三重测定)和空白样，以确保准确性；
[0095]②.弃去样品，并洗涤微量滴定板三次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸盐吐温缓冲液);
[0096]③.将100 μ I浓度为0.5 μ g/ml的检测抗体添加到每个孔；
[0097]④.用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在37°C下孵育I小时；
[0098]⑤.用PBST洗涤微量滴定板四次；
[0099](7)检测[0100]①.将TMB(3，3'，5，5'-四甲基联苯胺)溶液添加到每个孔，孵育15_30分钟，添加等体积的终止液(2M H2SO4),然后用酶联免疫检测仪在450nm处读取光密度。
[0101]②.由系列稀释液得到的数据绘制标准曲线，浓度标在X轴(对数标度)上，而吸光度标在Y轴(线性标度)上。通过内插法在此标准曲线上得出样品浓度。
[0102]本发明用于肺癌早中期快速诊断试剂盒包括半乳糖凝集素-3(Galectin-3)，人类天冬胺酰基羟化酶(HAAH)，CYFRA21-1三项指标中的两项同时升高作为诊断早中期乳腺癌的标准，检测原理如图1所示；半乳糖凝集素-3(Galectin-3)，人类天冬胺酰基β-羟化酶(HAAH)，CYFRA21-1三项指标中的两项同时下降作为肺癌治疗效果评估的标准。可以用于临床上通过检测血中3个肿瘤标记物水平的高低对肺癌的治疗效果进行动态评估；另外还可以用于临床上对肺癌的复发转移及预后判断的应用。
[0103]试验效果说明
[0104]双抗体夹心ELISA最佳实验条件的选择
[0105]包被鼠抗人Galectin-3，HAAH及CYFRA21-1单抗最佳工作浓度的选择:根据方阵法确定包被浓度为lug/mL时,单克隆抗体的OD值为1.03,所以其最佳包被浓度为lug/mL。如图2所示，兔抗人Galectin-3，HAAH及CYFRA21-1多抗最佳工作浓度的选择:随着检测抗体稀释倍数的增加，待测肺癌病例血清和正常人血清OD值有递减的趋势，当抗体浓度为1:200时，阳性对照(阳性对照OD值减去空白对照OD值)与正常对照(正常对照OD值减去空白对照OD值)A450nm之比(简称P / N值)较高，故选择兔抗人抗体最佳工作浓度为1:200。血清摸索的最佳工作浓度为1:25。封闭液摸索最佳工作溶度为1.2% BSA。
[0106]临床血清标本检测
[0107]共检测了 400份血`清标本，以医院经确诊为肺癌1-1I期患者血清为阳性对照组(110例)，其他良性病患者和正常人群血清为阴性对照组(290例(正常170例，良性病120例))，PBST为空白对照，通过上述双抗夹心ELISA法进行定性及定量检测临床血清标本。如下表所示:
【权利要求】
1.用于肺癌早中期快速诊断试剂盒，包括捕获抗体，其特征在于，所述捕获抗体包括半乳糖凝集素和细胞角质素片段抗原21-1分别制得的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的用于肺癌早中期快速诊断试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体还包括人类天冬胺酰基β —羟化酶制得的单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的用于肺癌早中期快速诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测抗体，所述检测抗体包括半乳糖凝集素、细胞角质素片段抗原21-1和人类天冬胺酰基β —羟化酶分别制得的HRP标记后的多克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的用于肺癌早中期快速诊断试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体的制备方法包括的步骤如下: (1)抗原的制备:把半乳糖凝集素、细胞角质素片段抗原21-1及人类天冬胺酰基β-羟化酶的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原； (2)捕获抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的单克隆抗体为捕获抗体。
5.根据权利要求3所述的用于肺癌早中期快速诊断试剂盒，其特征在于，所述检测抗体的制备方法包括的步骤如下: (1)抗原的制备:把半乳糖凝集素、细胞角质素片段抗原21-1及人类天冬胺酰基β-羟化酶的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原； (2)检测抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的多克隆抗体为检测抗体；` (3)HRP标记:对所述多克隆抗体进行HRP标记。
6.根据权利要求1-5任一所述的用于肺癌早中期快速诊断试剂盒，其特征在于，所述半乳糖凝集素是半乳糖凝集素_3。
7.根据权利要求6所述的用于肺癌早中期快速诊断试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体预先包被于微量滴定板的孔内。
8.根据权利要求6所述的用于肺癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法，其特征于，其包括以下步骤: (1)抗原的制备:将半乳糖凝集素、细胞角质素片段抗原21-1及人类天冬胺酰基β-羟化酶的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原； (2)捕获抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体； (3)检测抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，对所述多克隆抗体进行HRP标记； (4)捕获抗体包被: ①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液将浓度为I μ g/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔；②.封盖微量滴定板并在4°C下孵育过夜；③.弃去包被液，并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200 μ I PBST，除去洗涤液和剩余的液滴，晾干放于4°C环境中； (5)封闭:每孔添加200μ I封闭缓冲液，封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。
9.根据权利要求6所述的用于肺癌早中期快速诊断试剂盒的检测方法，其特征于，包括以下步骤:(1)抗原的制备:将半乳糖凝集素、细胞角质素片段抗原21-1及人类天冬胺酰基β-羟化酶的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原； (2)捕获抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体； (3)检测抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，对所述多克隆抗体进行HRP标记； (4)捕获抗体包被: ①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液将浓度为Iμ g/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔； ②.封盖微量滴定板并在4°C下孵育过夜； ③.弃去包被液，并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200μ I PBST,除去洗涤液和剩余的液滴，晾干放于4°C环境中； (5 )封闭 ①.在微量滴定板的每个孔添加200μI封闭缓冲液，封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点； ②.封盖微量滴定板并在37°C孵育I小时； (6)加样 ①.将100μ I的样品添加到微量滴定板的每个孔，在37°C下孵育60分钟； ②.弃去样品，并洗涤微量滴定板`三次，每次在微孔中加入200μ I PBST ； ③.将100μ I浓度为0.5 μ g/ml的检测抗体添加到每个孔； ④.封盖微量滴定板并在37°C下孵育I小时； ⑤.用PBST洗涤微量滴定板四次； (7)检测 ①.将TMB溶液添加到每个孔，孵育15-30分钟，添加等体积的终止液，然后在450nm处读取光密度。
【文档编号】G01N33/577GK103823066SQ201410093875
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月13日 优先权日:2014年3月13日
【发明者】余跃飞 申请人:广州恒泰生物科技有限公司