一种通过tead4细胞核阳性表达情况对结直肠癌评价的方法
【专利摘要】本发明涉及一种通过TEAD4细胞核阳性表达情况对结直肠癌评价的方法，即首先制成肿瘤组织芯片，然后进行免疫组化实验、免疫评分，根据免疫评分进行分组，最后按照TEAD4的细胞核着染情况将患者分为TEAD4细胞核阳性表达组和TEAD4细胞核阴性表达组，然后运用统计学方法分析两组病人的临床特征以及总生存期的差异。发明的一种通过结直肠癌免疫学指标TEAD4细胞核阳性表达情况对结直肠癌患者的临床特征和总体预后进行评价的方法，即根据结直肠癌患者肿瘤组织中TEAD4细胞核阳性表达的情况可以直接确定患者的临床特征和预后信息。
【专利说明】—种通过TEAD4细胞核阳性表达情况对结直肠癌评价的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种方法，具体地说，是关于一种通过TEAD4细胞核阳性表达情况对结直肠癌评价的方法。
【背景技术】
[0002]结、直肠癌是我国常见的恶性肿瘤。占我国恶性肿瘤的第四位，并有上升的趋势。中国人结、直肠癌与西方人比较有3个流行病学特点:①直肠癌比结肠癌发病率高，约1.5: I ;②低位直肠癌在直肠癌中所占比例高，约占75%，大多数直肠癌可在直肠指检时触及；③青年人(<30岁)患者比例较高，约占15%。但近几十年来，随着人民生活水平的提高及饮食结构的改变，结肠癌比例亦逐渐增多。但是关于一种通过结直肠癌免疫学指标TEAD4细胞核阳性表达情况对结直肠癌患者的临床特征和预后进行评价的方法，目前还未见报道。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种通过结直肠癌免疫学指标TEAD4细胞核阳性表达情况对结直肠癌患者的临床特征和预后进行评价的方法。
[0004]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:
[0005]一种通过TEAD4细胞核阳性表达情况对结直肠癌评价的方法，包括如下步骤:
[0006](I)、制成肿瘤组织蜡块；
[0007](2)、根据HE染色确定步骤(I)所得的蜡块中肿瘤组织的位置，选取其中的肿瘤组织的中央部位制成组织芯片；
[0008](3)、对步骤⑵所得的组织芯片、阳性对照和阴性对照进行免疫组织化学染色；其中所述的阳性对照使用已证实为阳性组织的肿瘤细胞组织制成的组织芯片；所述的阴性对照使用相同的组织芯片；
[0009](4)、组织芯片常规脱蜡、水化；
[0010](5)、微波抗原修复；
[0011](6)、灭活内源性过氧化物酶；
[0012](7)、封闭非特异性蛋白；
[0013](8)、滴加一抗
[0014]TEAD4—抗用5%的牛血清白蛋白水溶液按1: 50稀释，至于湿盒里4°C孵育过夜；阴性对照中以PBS缓冲液代替一抗；
[0015](9)、复温 45 分钟；
[0016](10)、滴加二抗；
[0017](11)、DAB 显色；
[0018](12)、苏木素复染；[0019](13)、脱水和透明；
[0020](14)、封片；
[0021](15)、结果分析:
[0022]阳性信号为棕黄色颗粒，用徕卡光学显微镜在200倍放大倍数下，对上述所得的每个组织位点拍摄五张图片，记录图片中TEAD4阳性染色细胞核的颜色强度；
[0023]若没有棕黄色着染的细胞核，则免疫评分为O分；
[0024]若阳性染色细胞核的强度为浅棕色，则免疫评分为I分；
[0025]若阳性染色细胞核的强度为中度棕色，则免疫评分为2分；
[0026]若阳性染色细胞核的强度为深棕色，则免疫评分为3分；
[0027](16)、根据步骤(15)所得的免疫评分进行分组，免疫评分为0、1、2的归为一组即为TEAD4细胞核阴性表达的一组，免疫评分为3的归为一组即为TEAD4细胞核阳性表达的
一组；
[0028](17)、利用Spssll.0分析软件和Graph Pad prism5作图软件,按照步骤(16)的分组对TEAD4细胞核阳性和阴性表达情况与患者的临床特征和总生存率的关系进行分析，来判定TEAD4的细胞核表达情况与结直肠癌患者的预后效果。
[0029]所述，步骤(5)所述的微波抗原修复，即将组织切片浸于由柠檬酸钠、柠檬酸三钠和纯水配制的抗原修复液中，于微波炉中高火档加热3分钟，然后中低火档加热4分钟X2次，取出后室温下冷却，用PBS缓冲液洗涤，5分钟X 3次。
[0030]所述，步骤(6)所述的灭活内源性过氧化物酶，即用30%过氧化氢和甲醇按1: 9配成的灭活液，将组织切片浸泡在灭活液中30分钟，以灭活内源性过氧化物酶后，用PBS缓冲液洗涤，5分钟X 3次。
[0031]所述，步骤(7)所述的封闭非特异性蛋白即将组织切片擦洗干净，在每张组织切片上滴加50微升的封闭液即5%的BSA水溶液，孵育30分钟，封闭非特异性抗原。
[0032]所述，步骤(10)所述的滴加二抗即将切片置入湿盒中，用滤纸将组织周围的水分吸去，每张组织切片滴加抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒中的A液即辣根过氧化物酶聚合物一滴，室温下孵育半小时。
[0033]本发明优点在于:发明的一种通过结直肠癌免疫学指标TEAD4细胞核阳性表达情况对结直肠癌患者的临床特征和总体预后进行评价的方法，即根据结直肠癌患者肿瘤组织中TEAD4细胞核阳性表达的情况可以直接确定患者的临床特征和预后信息。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1、在200和400放大倍数下正常组织TEAD4免疫评分为O分；
[0035]图2、在200和400放大倍数下肿瘤组织TEAD4免疫评分为O分；
[0036]图3、在200和400放大倍数下肿瘤组织TEAD4免疫评分为I分；
[0037]图4、在200和400放大倍数下肿瘤组织TEAD4免疫评分为2分；
[0038]图5、在200和400放大倍数下肿瘤组织TEAD4免疫评分3分；
[0039]图6、生存期和总生存率的关系图。
【具体实施方式】[0040]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0041]本发明实施例中所用的426个结直肠癌组织的蜡块都来自上海交通大学附属新华医院结直肠肛门疾病外科。本实验通过了新华医院伦理委员会，每位患者都签订了知情同意书。
[0042]免疫组织化学方法，参考王光辉2013年Identificationof MXRA5as a noveltissue biomarker for colorectal cancer progression。
[0043]所用作图软件为Graph Pad prism5，分析软件为Spssll.0。
[0044]本发明的实施例中所用到的试剂见表1，主要实验仪器与耗材见表2，实验所用配制试剂的见表3。
[0045]表1实验试剂
[0046]
【权利要求】
1.一种通过TEAD4细胞核阳性表达情况对结直肠癌评价的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)、制成肿瘤组织蜡块； (2)、根据HE染色确定步骤(1)所得的蜡块中肿瘤组织的位置，选取其中的肿瘤组织的中央部位制成组织芯片； (3)、对步骤(2)所得的组织芯片、阳性对照和阴性对照进行免疫组织化学染色；其中所述的阳性对照使用已证实为阳性组织的肿瘤细胞组织制成的组织芯片；所述的阴性对照使用相同的组织芯片； (4)、组织芯片常规脱蜡、水化； (5)、微波抗原修复； (6)、灭活内源性过氧化物酶； (7)、封闭非特异性蛋白； (8)、滴加一抗 TEAD4 一抗用5%的牛血清白蛋白水溶液按1:50稀释，至于湿盒里4°C孵育过夜；阴性对照中以PBS缓冲液代替一抗； (9)、复温45分钟； (10)、滴加二抗； (11)、DAB显色； (12)、苏木素复染； (13)、脱水和透明； (14)、封片； (15)、结果分析: 阳性信号为棕黄色颗粒，用徕卡光学显微镜在200倍放大倍数下，对上述所得的每个组织位点拍摄五张图片，记录图片中TEAD4阳性染色细胞核的颜色强度； 若没有棕黄色着染的细胞核，则免疫评分为O分； 若阳性染色细胞核的强度为浅棕色，则免疫评分为I 分； 若阳性染色细胞核的强度为中度棕色，则免疫评分为2分； 若阳性染色细胞核的强度为深棕色，则免疫评分为3分； (16)、根据步骤(15)所得的免疫评分进行分组，免疫评分为0、1、2的归为一组即为TEAD4细胞核阴性表达的一组，免疫评分为3的归为一组即为TEAD4细胞核阳性表达的一组； (17)、利用Spssll.0分析软件和Graph Pad prism 5作图软件,按照步骤(16)的分组对TEAD4细胞核阳性和阴性表达情况与患者的临床特征和总生存率的关系进行分析，来判定TEAD4的细胞核表达情况与结直肠癌患者的预后效果。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述的微波抗原修复，即将组织切片浸于由柠檬酸钠、柠檬酸三钠和纯水配制的抗原修复液中，于微波炉中高火档加热3分钟，然后中低火档加热4分钟X 2次，取出后室温下冷却，用PBS缓冲液洗涤，5分钟X 3次。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(6)所述的灭活内源性过氧化物酶，即用30%过氧化氢和甲醇按1:9配成的灭活液，将组织切片浸泡在灭活液中30分钟，以灭活内源性过氧化物酶后，用PBS缓冲液洗涤，5分钟X 3次。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(7)所述的封闭非特异性蛋白即将组织切片擦洗干净，在每张组织切片上滴加50微升的封闭液即5%的BSA水溶液，孵育30分钟，封闭非特异性抗原。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(10)所述的滴加二抗即将切片置入湿盒中，用滤纸将组织周围的水分吸去，每张组织切片滴加抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒中的A液即辣根过氧化物酶聚合物一滴，室温下孵育半小时。
【文档编号】G01N33/574GK103954757SQ201410169571
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月25日 优先权日:2014年4月25日
【发明者】崔龙, 刘云, 刘辰莹, 王光辉 申请人:上海交通大学医学院附属新华医院