糖蜜中生物素的提取方法及其薄层层析扫描检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种糖蜜中生物素的提取方法，以糖蜜为原料，经N,N-二甲基甲酰胺提取，无水乙醇洗涤，盐酸苯肼溶液提取，吸附剂吸附，最终得到含生物素的样品液。本发明还提供了一种生物素的薄层层析扫描检测方法，(1)取待检测样品液，点在硅胶板上，在加有展开剂的展开缸内展开，然后将薄层板拿出放在通风柜中晾干；(2)展完后晾干的展板，用染色液喷雾染色，得到与背景对比明显的标准品的斑点和样品的斑点；(3)利用薄层扫描仪以530nm吸收波长进行薄层层析扫描，计算出样品液中生物素的质量浓度。具有简单、快速、准确、可靠、稳定等优点。
【专利说明】糖蜜中生物素的提取方法及其薄层层析扫描检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种糖蜜中生物素的提取方法及其薄层层析扫描检测方法。
【背景技术】
[0002]生物素是生命活动中必需的维生素之一，是机体内许多酶的辅助因子，参加机体的羧化，脱羧和脱氢反应，参与糖类、脂肪、蛋白质三大营养物质的代谢。生物素已广泛应用于食品、化工、医药、畜牧、生物发酵等领域。在谷氨酸发酵生产中，生物素用量的控制直接影响着生产菌的生长、增殖、代谢和细胞壁、细胞膜的渗透性以及谷氨酸产酸率的高低，由于大多数谷氨酸菌都是生物素缺陷型的，所以生物素的含量对生产起着至关重要的作用，因此开展对生物素检测的研究具有重要的意义。
[0003]糖蜜是一种粘稠、黑褐色、呈半流动态的物质，是制糖工业上不能再用来煮制糖品的废料，但糖蜜中生物素的含量丰富，可作为良好的谷氨酸发酵的原料和添加剂，是目前谷氨酸生产中生物素的主要来源。但由于其中生物素的含量与糖蜜的来源、生产批次等密切相关，因此，为稳定生产、提高产酸率必须密切关注糖蜜的组成变化，准确测定其中的生物素含量，以实现谷氨酸发酵中对生物素用量的控制。
[0004]现有技术文献报道的生物素的检测方法有微生物法、荧光法、分光光度法、酶联免疫法、气相色谱法、高效液相色谱法、薄层扫描法等等。目前，对糖蜜中生物素的检测，微生物法和高效液相色谱法最为常用，但存在以下缺陷:微生物法由于大多数菌株都不是专一性的，因此会带来较大的检测误差，并且整个操作过程费时、费力。高效液相色谱法投资大、溶剂用量大、成本较高，又由于糖蜜粘稠、色深、含有杂质较多，故样品处理即生物素的提取纯化过程困难，且高效液相色谱法对样品的纯度要求又较高，对成分复杂、色素含量高、杂质干扰大的糖蜜样品，不宜用该法检测。
【发明内容】
[0005]针对上述现有技术，本发明提供了一种糖蜜中生物素的提取方法，本发明还提供了一种生物素的薄层层析扫描检测方法。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0007]一种糖蜜中生物素的提取方法，步骤如下:
[0008](I)取糖蜜10g，加15?25ml (优选20ml) N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌均匀，过滤，用20?40ml无水乙醇冲洗滤洛,过滤,将滤洛加入到70?IOOml无水乙醇中，在70?78 °C、40Hz、400?500W条件下超声处理28?32min (优选30min)，然后趁热过滤，得滤液，滤液经旋转蒸发得5?8ml样品粗液；
[0009](2)取2ml盐酸苯肼溶液，加入到上述5?8ml样品粗液中，混匀，在90?98°C下水浴加热28?32min(优选30min)，然后放在-10?_26°C下冷冻30?40分钟，取出，除去下层沉淀，得上清液；
[0010]所述盐酸苯肼溶液是通过以下方法制备得到的:称取盐酸苯肼0.3g，加3ml蒸馏水，加热溶解；称取0.45g乙酸钠，加入3ml蒸馏水溶解；将两种液体合并，即得；
[0011](3)取0.01?0.02g吸附剂，加入到步骤(2)所得上清液中，搅拌吸附0.5?Ih,然后6000?8000转/分离心，得上清液，即为生物素溶液(含有生物素的溶液，旋转蒸发浓缩至2ml，作为样品液)。
[0012]所述吸附剂是通过以下方法制备得到的:取硅藻土 lg、活性白土 Ig和糖用活性炭lg，混合混匀，即得。
[0013]一种生物素的薄层层析扫描检测方法，步骤如下:
[0014](I)取待检测样品液(即上述方法制备得到的生物素溶液)4μ1，点在硅胶板(优选10cmX20cm的涂有娃胶GF254高效薄层板)上，向展开缸中加入展开剂，在展开缸(IOcmX 12cmX 15cm)内展开,展程15cm,然后将薄层板拿出放在通风柜中晾干；同时,采用外标一点法点4μ I不同浓度的生物素标准品溶液，同时展开；
[0015]所述展开剂为氯仿-甲醇-甲苯-乙酸混合液，其中，氯仿、甲醇、甲苯、乙酸四者的体积比为4?4.5:0.5?0.6:2?2.2:0.I?0.15。
[0016]所述生物素标准品溶液包括浓度分别为0.05 μ g/μ 1,0.2 μ g/μ 1,0.25 μ g/μ I,
0.3 μ g/ μ I, 0.4 μ g/ μ I的一系列标准品溶液；
[0017]所述生物素标准品溶液的配制方法为:精密称取生物素标准品(购自Sigma公司)1.29mg,加入N，N-二甲基甲酰胺1.29ml,配制成浓度为lmg/ml的标准溶液；精密吸取50，200，250，300，400μ llmg/ml 的标准溶液，配制成浓度分别 0.05 μ g/μ 1，0.2 μ g/μ 1，
0.25 μ g/ μ I, 0.3 μ g/ μ I, 0.4 μ g/ μ I 的一系列标准品溶液；
[0018](2)将2，4-二甲氨基肉桂醛、硫酸和无水乙醇混合，配成染色液，其中2，4-二甲氨基肉桂醛终浓度为0.1?0.2% (质量体积分数，单位g/ml)，硫酸终浓度为I?2% (质量体积分数，单位g/ml);展完后晾干的展板，用染色液喷雾染色，得到与背景对比明显的标准品的斑点和样品的斑点(橘红色)；
[0019](3)利用Camag3型薄层扫描仪以530nm吸收波长进行薄层层析扫描，扫描速度为20mm/s,分辨率为50 μ m/step，得Rf = 0.2 ;照射灯为钨灯，检测计算得到生物素标准品溶液质量和峰面积积分值的关系的回归方程(通过薄层色谱仪管理软件winCATSl.4.1计算出，为常规手段)，然后根据样品液的峰面积积分值计算出样品液中生物素的质量浓度。
[0020]本发明的糖蜜中生物素的提取方法，操作简单、可靠，本发明的生物素的薄层层析扫描检测方法，具有简单、快速、准确、可靠、稳定等优点。
【具体实施方式】
[0021]下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0022]实施例1从糖蜜中提取生物素，并进行检测
[0023]步骤如下:
[0024](I)制备样品粗液:
[0025]取糖蜜IOgJP 20ml N, N-二甲基甲酰胺(DMF)搅拌均匀过滤，用20ml无水乙醇冲洗滤渣过滤。将滤渣加入IOOml无水乙醇，在78°C、40Hz、功率400W超声0.5h。趁热过滤得滤液。滤液经旋转蒸发至5ml为样品粗液。
[0026](2)盐酸苯肼液的制备:[0027]称取盐酸苯肼0.3g，加3ml蒸馏水加热溶解。称取乙酸钠0.45g加3ml蒸馏水溶解。将两种液体合并，即得。
[0028](3)取2ml盐酸苯肼溶液加入到5ml样品粗液中，95°C水浴加热0.5h。得淡黄色浊液，放至-10°C冷冻40分钟。取出除去下层沉淀得上清液。
[0029](4)配制吸附剂:
[0030]取硅藻土 lg、活性白土 Ig和糖用活性炭Ig混合均匀，得吸附剂。从中取0.0lg加入步骤(3)的上清液中搅拌吸附0.5h。经8000转/分离心得上清液。
[0031](5)将上清液旋转蒸发浓缩至2ml作为样品液。
[0032](6)检测:
[0033]精密称取生物素标准品(Sigma公司)1.29mg,加入N，N- 二甲基甲酰胺1.29ml,配制成浓度为lmg/ml的标准溶液。精密吸取50，200, 250，300, 400 μ llmg/ml的标准溶液，配制成浓度分别 0.05 μ g/ μ 1，0.2 μ g/ μ I, 0.25 μ g/ μ I, 0.3 μ g/ μ I, 0.4 μ g/ μ I 的一系列标准品溶液，分别取实施例1所得的样品液4 μ I和标准液4 μ I点在涂有硅胶GF254高效薄层板(IOcmX 20cm)上，以氯仿:甲醇:甲苯:乙酸=4:0.5:2:0.1 (体积比)配制20ml展开剂，在展开缸(IOcmX 12cmX 15cm)内层析,展程15cm,然后将薄层板拿出放在通风柜中晾干。将2，4-二甲氨基肉桂醛、硫酸和无水乙醇混合，配成染色液，其中2，4-二甲氨基肉桂醛浓度为0.1%，硫酸浓度为1%，晾干后的薄层板用染色液喷雾染色，得到与背景对比明显桔红色的标准品斑点和样品斑点。
[0034]用CAMAG3薄层扫描仪以530nm吸收波长扫描。扫描速度为20mm/s，分辨率为50 μ m/step,由薄层扫描仪软件wincatsl.4.1处理得回归方程Y = 72.1356+2.0456X, r =
0.99953，RSD = 1.99%。经检测计算糖蜜中生物素含量平均为25.5μ g/g。
[0035]实施例2从糖蜜中提取生物素，并进行检测
[0036]步骤如下:
[0037](I)制备样品粗液:
[0038]取糖蜜IOgJP 20ml DMF搅拌均匀过滤，用30ml无水乙醇冲洗滤渣过滤。将滤渣加入70ml无水乙醇中。在751:、40取、4501超声0.511。趁热立即过滤得滤液。滤液旋转蒸发至5ml为样品粗液。
[0039](2)盐酸苯肼溶液的制备:同实施例1。
[0040](3)取2ml盐酸苯肼溶液加入到5ml样品粗液中，90°C水浴加热0.5h。然后放入-20°C冷冻35分钟。取出除去下层沉淀得上清液。
[0041](4)配制吸附剂同实施例1，取0.015g吸附剂加入(3)的上清液中搅拌吸附45分钟。经7000转/分离心得上清液。
[0042](5)将上清液旋转蒸发至2ml作为样品液。
[0043](6)检测方法同实施例1，不同的是，所用展开剂为氯仿:甲醇:甲苯:乙酸=4.5:
0.6:2.2:0.15 (体积比)。经检测糖蜜中生物素含量为26.00μ g/g。
[0044]实施例3从糖蜜中提取生物素，并进行检测
[0045]步骤如下:
[0046](I)制备样品粗液
[0047]取糖蜜IOgJP 20ml DMF搅拌均匀过滤，用40ml无水乙醇冲洗滤渣过滤。将滤渣加入到80ml无水乙醇中。在70°C、40Hz、功率为500W超声0.5h。趁热过滤得滤液。滤液旋转蒸发至8ml为样品粗液。
[0048](2)盐酸苯肼溶液的制备:同实施例1。
[0049](3)取2ml盐酸苯肼溶液加入到8ml样品粗液中，95°C水浴加热0.5h。然后放在-26°C冷冻30分钟。取出除去下层沉淀得上清液。
[0050](4)吸附剂的配制同实施例1，取0.02g吸附剂加入(3)的上清液中搅拌吸附lh。经6000转/分离心得上清液。
[0051](5)将上清液旋转蒸发至2ml作为样品液。
[0052](6)检测同实施例1，不同的是，所用展开剂为氯仿:甲醇:甲苯:乙酸=4.2:
0.55:2.1:0.12 (体积比)。经检测糖蜜中生物素含量为25.00μ g/g。
【权利要求】
1.一种糖蜜中生物素的提取方法，其特征在于:步骤如下: (1)取糖蜜IOg,加15~25mlN, N- 二甲基甲酰胺,搅拌均匀，过滤，用20~40ml无水乙醇冲洗滤渣，过滤，将滤渣加入到70~100mL无水乙醇中，在70~78°C、40Hz、400~500W条件下超声处理28~32min，然后趁热过滤，得滤液，滤液经旋转蒸发得样品粗液； (2)取2ml盐酸苯肼溶液，加入到上述样品粗液中，混匀，在90~98°C下水浴加热28~32min，然后放在-10~_26°C下冷冻30~40分钟，取出，除去下层沉淀，得上清液； 所述盐酸苯肼溶液是通过以下方法制备得到的:称取盐酸苯肼0.3g，加3ml蒸馏水，加热溶解；称取0.45g乙酸钠，加入3ml蒸馏水溶解；将两种液体合并，即得； (3)取0.01~0.02g吸附剂，加入到步骤(2)所得上清液中，搅拌吸附0.5~lh，然后6000~8000转/分离心，得上清液，即为生物素溶液； 所述吸附剂是通过以下方法制备得到的:取硅藻土 lg、活性白土 Ig和糖用活性炭lg，混合混匀，即得。
2.一种生物素的薄层层析扫描检测方法，其特征在于:步骤如下: (1)取待检测样品液4μ 1，点在硅胶板上，向展开缸加入展开剂，在展开缸内展开，展程15cm，然后将薄层板拿出放在通风柜中晾干；同时，采用外标一点法点4μ I不同浓度的生物素标准品溶液，同时展开； 所述展开剂为氯仿-甲醇-甲苯-乙酸混合液，其中，氯仿、甲醇、甲苯、乙酸四者的体积比为 4 ~4.5:0.5 ~0.6:2 ~2.2:0.I ~0.15 ； (2)将2，4-二甲氨基肉桂醛、硫酸和无水乙醇混合，配成染色液，其中2，4- 二甲氨基肉桂醛终浓度为0.1~0.2%，硫酸终浓度为I~2%;展完后晾干的展板，用染色液喷雾染色，得到与背景对比明显的标准品的斑点和样品的斑点； (3)利用薄层扫描仪以530nm吸收波长进行薄层层析扫描，照射灯为钨灯，检测计算得到生物素标准品溶液质量和峰面积积分值的关系的回归方程，然后根据样品液的峰面积积分值计算出样品液中生物素的质量浓度。
3.根据权利要求2所述的生物素的薄层层析扫描检测方法，其特征在于:所述硅胶板为涂有硅胶GF254高效薄层板。
4.根据权利要求2所述的生物素的薄层层析扫描检测方法，其特征在于:所述生物素标准品溶液包括浓度分别为 0.05 μ g/ μ I, 0.2 μ g/ μ I, 0.25 μ g/ μ I, 0.3 μ g/ μ I, 0.4 μ g/μ I的一系列标准品溶液。
5.根据权利要求2所述的生物素的薄层层析扫描检测方法，其特征在于:所述样品液是通过以下方法制备得到的: (1)取糖蜜IOg,加15~25mlN, N- 二甲基甲酰胺,搅拌均匀，过滤，用20~40ml无水乙醇冲洗滤渣，过滤，将滤渣加入到70~100mL无水乙醇中，在70~78°C、40Hz、400~500W条件下超声处理28~32min，然后趁热过滤，得滤液，滤液经旋转蒸发得样品粗液； (2)取2ml盐酸苯肼溶液，加入到上述样品粗液中，混匀，在90~98°C下水浴加热28~32min，然后放在-10~_26°C下冷冻30~40分钟，取出，除去下层沉淀，得上清液； 所述盐酸苯肼溶液是通过以下方法制备得到的:称取盐酸苯肼0.3g，加3ml蒸馏水，加热溶解；称取0.45g乙酸钠，加入3ml蒸馏水溶解；将两种液体合并，即得； (3)取0.01~0.02g吸附剂，加入到步骤(2)所得上清液中，搅拌吸附0.5~lh，然后6000~8000转/分离心，得上清液，为生物素溶液，即为样品液； 所述吸附剂是通过以下方法制备得到的:取硅藻土 lg、活性白土 Ig和糖用活性炭lg，混合混匀，即得。
【文档编号】G01N1/28GK103926369SQ201410188077
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】刘代成 申请人:山东师范大学