一种抗肿瘤中药组合物的质量检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，该方法包括佛手，西洋参的薄层鉴定，西洋参和蟾酥的高效液相色谱法含量测定方法，及其中药组合物的指纹图谱检测方法。本发明提供的检测方法可以全面、客观、准确的检测和评价抗肿瘤中药组合物的质量，为保证临床疗效具有重要意义。
【专利说明】一种抗肿瘤中药组合物的质量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种中药组合物的质量检测方法，具体涉及一种具有抗肿瘤作用的中 药组合物的质量检测方法。
【背景技术】
[0002] 天佛参口服液系用现代先进工艺提炼精制而成的一种纯天然中药制剂，由常熟雷 允上制药有限公司生产，具有养阴益气，解毒散结的功效，与抗肿瘤化学药品合用，用于非 小细胞肺癌属气阴两虚证，可减轻化疗所致的恶心、呕吐、便秘、脱发等现象，临床上得到的 广泛的应用，疗效确切可靠。其中天佛参口服液由西洋参、蟾酥、天门冬、土贝母、倒卵叶五 力口、猕猴桃根、沙棘果、佛手8味药材组成。其中倒卵叶五加、猕猴桃根、沙棘果为水提工艺 提取，西洋参、天门冬、土贝母为醇提工艺，总提取物中所含化合物极性涵盖强极性和中等 极性范围，现有技术的检测方法，并不能全面、客观的检测和评价天佛参口服液的质量。
【发明内容】
[0003]发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种具有抗肿瘤中药组合 物（天佛参口服液）的质量检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价抗肿瘤中药 组合物（天佛参口服液）的质量，对控制该抗肿瘤中药组合物（天佛参口服液）的质量与 保证临床疗效具有重要意义。
[0004]技术方案：为了实现以上技术目的，本发明采取的技术方案为：
[0005]-种抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，按重量份数计，所述的中药组合物由西 洋参40?60份、蟾酥0. 22?0. 30份、天冬160?180份、土贝母190?210份、倒卵叶五 力口 560?620份、猕猴桃根900?1100份、沙棘果320?340份、佛手190?210份制成口 服液制剂，所述检测方法包括佛手和西洋参的薄层鉴定，包括以下步骤：
[0006]佛手的薄层鉴定，包括以下步骤：
[0007] (1)制备供试品溶液：取中药组合物20?60ml，加醋酸乙酯提取三次，每次15? 45ml，合并醋酸乙酯提取液，水浴上浓缩至约2?4ml，即得；
[0008] (2)制备对照品溶液：取佛手对照药材粉末1?5g，加体积浓度60%?80%乙醇 20?60ml，水浴上回流提取1?3小时，滤过，滤液置水浴上蒸干，残留物加醋酸乙酯溶解， 取上清液，即得；
[0009] (3)测定：吸取步骤（1)供试品溶液和步骤⑵对照品溶液各2?5μ1，分别点于 同一块硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品溶液与对照药材色谱 相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
[0010] 西洋参的薄层鉴定，包括以下步骤：
[0011] (1)制备供试品溶液：取中药组合物20?60ml，加醋酸乙酯提取三次，每次15? 45ml，合并醋酸乙酯提取液，加氢氧化钠试液，用水饱和正丁醇提取3次，每次10?15ml，合 并正丁醇提取液，加水洗涤两次，每次10?15ml，弃去洗液，正丁醇液置水浴上减压蒸干， 残留物加乙醇溶解，即得；
[0012] (2)制备对照品溶液：取西洋参对照药材1?2g，加体积浓度70%乙醇30?60ml， 水浴上回液提取1?2小时，滤过，滤液蒸干，残留物加水溶解，加氢氧化钠试液，用水饱和 正丁醇提取3?5次，每次10ml，合并正丁醇提取液，加水洗涤两次，每次10ml，弃去洗液， 正丁醇液置水浴上减压蒸干，残留物加乙醇溶解，即得；
[0013] (3)测定：吸取上述两种溶液各1?3μ1，分别点于同一块硅胶G薄层板上，展开， 喷以5%硫酸溶液显色，自然光下检视，供试品溶液与西洋参对照药材色谱相应的位置上， 显相同颜色的斑点。
[0014] 作为优选方案，以上所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，所述的中药组合 物由西洋参50份、蟾酥0. 25份、天冬167份、土贝母200份、倒卵叶五加599份、猕猴桃根 1000份、沙棘果333份、佛手167份制成口服液制剂，所述检测方法包括佛手和西洋参的薄 层鉴定，包括以下步骤：
[0015] 佛手的薄层鉴定，包括以下步骤：
[0016] (1)制备供试品溶液：取中药组合物20ml，加醋酸乙酯提取三次，每次15ml，合并 醋酸乙酯提取液，水浴上浓缩至约2ml，即得；
[0017] (2)制备对照品溶液：取佛手对照药材粉末lg，加体积浓度80%乙醇20ml，水浴上 回流提取1小时，滤过，滤液置水浴上蒸干，残留物加醋酸乙酯溶解，取上清液，即得；
[0018] (3)测定：吸取步骤（1)供试品溶液和步骤⑵对照品溶液各2?5μ1，分别点于 同一块硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品溶液与对照药材色谱 相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
[0019] 西洋参的薄层鉴定，包括以下步骤：
[0020] (1)制备供试品溶液：取中药组合物20ml，加醋酸乙酯提取三次，每次15ml，合并 醋酸乙酯提取液，加氢氧化钠试液，用水饱和正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇提取 液，加水洗涤两次，每次IOml，弃去洗液，正丁醇液置水浴上减压蒸干，残留物加乙醇溶解， 即得；
[0021] (2)制备对照品溶液：取西洋参对照药材lg，加体积浓度70%乙醇30ml，水浴上回 液提取1小时，滤过，滤液蒸干，残留物加水溶解，加氢氧化钠试液，用水饱和正丁醇提取3 次，每次IOml，合并正丁醇提取液，加水洗涤两次，每次IOml，弃去洗液，正丁醇液置水浴上 减压蒸干，残留物加乙醇溶解，即得；
[0022] (3)测定：吸取上述两种溶液各1?3μ1，分别点于同一块硅胶G薄层板上，展开， 喷以5%硫酸溶液显色，自然光下检视，供试品溶液与西洋参对照药材色谱相应的位置上， 显相同颜色的斑点。
[0023] 作为优选方案，以上所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，所述检测方法还 包括采用高效液相色谱法检测中药组合物中西洋参的含量，包括以下步骤：
[0024] (1)对照品溶液的制备：取人参皂甙Rb1对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀 释制成每Iml中含Img的溶液作为对照品溶液；
[0025](2)供试品溶液的制备：精密量取中药组合物10?30ml，置分液漏斗中，用乙醚提 取4次，每次15?45ml，分取水层用水饱和的正丁醇提取3?5次，每次20?30ml，合并 正丁醇液，置水浴上蒸干；加水溶解并置已处理好填有Dltll大孔吸附树脂柱内，用水洗脱， 流速lml/min，弃去水洗液，用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解并 定量转移至IOml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，即得；
[0026] (3)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μ1注入液相色谱仪，测 定；其中所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂， 以体积比为70 : 30甲醇-磷酸二氢钠溶液为流动相，其中磷酸二氢钠浓度为0.03mol/L， 并用磷酸调节pH值为4. 5,检测波长为207nm。
[0027] 作为优选方案，所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，所述中药组合物中含 西洋参以人参阜式Rbjf，不得少于35mg/100ml。
[0028] 作为优选方案，以上所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，所述检测方法还 包括采用高效液相色谱法检测中药组合物中蟾酥的含量，包括以下步骤：
[0029] (1)对照品溶液的制备：精密称取经五氧化二磷减压干燥24小时的华蟾酥毒基 对照品、酯蟾毒配基对照品适量，加甲醇配制成每Iml含华蟾酥毒基10μg和酯蟾毒配基 50μg的混合溶液，作为对照品溶液；
[0030] (2)供试品溶液的制备：精密量取中药组合物制成的口服制剂25ml，置分液漏斗 中，加水50ml，混匀，依次加30ml，30ml，30ml，20ml，20ml的三氯甲烷提取5次，合并三氯甲 烷提取液，用氢氧化钠溶液洗涤，弃去氢氧化钠液，再用水洗涤，弃去水液，取三氯甲烷液用 无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇溶解并转移至IOml容量瓶中，加无水乙 醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
[0031] (3)测定：分别精密吸取步骤⑴对照品溶液与步骤⑵供试品溶液各10μ1， 注入液相色谱仪，测定；其中所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷 键合硅胶为填充剂，以体积比为38:62的乙腈和0. 5%磷酸二氢钾为流动相，并用磷酸调 ρΗ2· 5,检测波长为296nm，柱温40°C。
[0032] 作为优选方案，以上所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，所述中药组合物 中含蟾酥按华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的总量计，应为〇. 50mg?2. 50mg/100ml。
[0033] 作为优选方案，以上所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，所述检测方法还 包括中药组合物指纹图谱检测方法，包括以下步骤：
[0034] (1)供试品溶液制备：取中药组合物，经适当方法处理后制成供试品溶液；
[0035] (2)高效液相色谱法测定对照指纹图谱：取10批以上中药组合物供试品在适当的 色谱条件下进样，测得各批次供试品的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计 算获得共有模式作为本品的对照指纹图谱；
[0036] (3)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤⑴供试品溶液按步骤（2) 相同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱；
[0037] (4)将步骤（3)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤⑵得到的对照指纹图谱用相 似度软件评价。
[0038] 作为优选方案，以上所述的抗肿瘤中药组合物的指纹图谱检测方法，步骤（1)中 供试品溶液制备方法为：用〇. 22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液；或IOOOOrpm离心lOmin， 取上清液即得；
[0039] 步骤（2)中，所述的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲 醇为流动相A，以体积浓度为0. 05?0. 1 %甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度 洗脱；柱温为35?40°C;流速为每分钟0. 8?I.Oml;检测波长：270?280nm;
【权利要求】
1. 一种抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，按重量份数计，所述的中药组合物由西洋 参40?60份、蟾酥0. 22?0. 30份、天冬160?180份、土贝母190?210份、倒卵叶五加 560?620份、猕猴桃根900?1100份、沙棘果320?340份、佛手190?210份制成口服 液制剂，其特征在于，所述检测方法包括佛手和西洋参的薄层鉴定，包括以下步骤： 佛手的薄层鉴定，包括以下步骤： (1)制备供试品溶液：取中药组合物20?60ml，加醋酸乙酯提取三次，每次15?45ml， 合并醋酸乙酯提取液，水浴上浓缩至约2?4ml，即得； ⑵制备对照品溶液：取佛手对照药材粉末1?5g，加体积浓度60 %?80%乙醇20? 60ml，水浴上回流提取1?3小时，滤过，滤液置水浴上蒸干，残留物加醋酸乙酯溶解，取上 清液，即得； (3)测定：吸取步骤（1)供试品溶液和步骤（2)对照品溶液各2?5iU，分别点于同一 块硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品溶液与对照药材色谱相应 的位置上，显相同颜色的荧光斑点； 西洋参的薄层鉴定，包括以下步骤： (1) 制备供试品溶液：取中药组合物20?60ml，加醋酸乙酯提取三次，每次15?45ml， 合并醋酸乙酯提取液，加氢氧化钠试液，用水饱和正丁醇提取3次，每次10?15ml，合并正 丁醇提取液，加水洗涤两次，每次10?15ml，弃去洗液，正丁醇液置水浴上减压蒸干，残留 物加乙醇溶解，即得； (2) 制备对照品溶液：取西洋参对照药材1?2g，加体积浓度70 %乙醇30?60ml，水 浴上回液提取1?2小时，滤过，滤液蒸干，残留物加水溶解，加氢氧化钠试液，用水饱和正 丁醇提取3?5次，每次10ml，合并正丁醇提取液，加水洗涤两次，每次10ml，弃去洗液，正 丁醇液置水浴上减压蒸干，残留物加乙醇溶解，即得； (3) 测定：吸取上述两种溶液各1?3yl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，展开，喷 以5%硫酸溶液显色，自然光下检视，供试品溶液与西洋参对照药材色谱相应的位置上，显 相同颜色的斑点。
2. 根据权利要求1所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，其特征在于，所述的中 药组合物由西洋参50份、蟾酥0. 25份、天冬167份、土贝母200份、倒卵叶五加599份、猕 猴桃根1000份、沙棘果333份、佛手167份制成口服液制剂，其特征在于，所述检测方法包 括佛手和西洋参的薄层鉴定，包括以下步骤： 佛手的薄层鉴定，包括以下步骤： (1) 制备供试品溶液：取中药组合物20ml，加醋酸乙酯提取三次，每次15ml，合并醋酸 乙酯提取液，水浴上浓缩至约2ml，即得； (2) 制备对照品溶液：取佛手对照药材粉末lg，加体积浓度80%乙醇20ml，水浴上回流 提取1小时，滤过，滤液置水浴上蒸干，残留物加醋酸乙酯溶解，取上清液，即得； (3) 测定：吸取步骤（1)供试品溶液和步骤（2)对照品溶液各2?5iU，分别点于同一 块硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品溶液与对照药材色谱相应 的位置上，显相同颜色的荧光斑点； 西洋参的薄层鉴定，包括以下步骤： (1)制备供试品溶液：取中药组合物20ml，加醋酸乙酯提取三次，每次15ml，合并醋酸 乙酯提取液，加氢氧化钠试液，用水饱和正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇提取液，力口 水洗涤两次，每次l〇ml，弃去洗液，正丁醇液置水浴上减压蒸干，残留物加乙醇溶解，即得； (2) 制备对照品溶液：取西洋参对照药材lg，加体积浓度70 %乙醇30ml，水浴上回液提 取1小时，滤过，滤液蒸干，残留物加水溶解，加氢氧化钠试液，用水饱和正丁醇提取3次，每 次10ml，合并正丁醇提取液，加水洗涤两次，每次10ml，弃去洗液，正丁醇液置水浴上减压 蒸干，残留物加乙醇溶解，即得； (3) 测定：吸取上述两种溶液各1?3yl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，展开，喷 以5%硫酸溶液显色，自然光下检视，供试品溶液与西洋参对照药材色谱相应的位置上，显 相同颜色的斑点。
3. 根据权利要求1或2所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，其特征在于，所述检 测方法还包括采用高效液相色谱法检测中药组合物中西洋参的含量，包括以下步骤： (1) 对照品溶液的制备：取人参皂甙Rh对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制 成每lml中含lmg的溶液作为对照品溶液； (2) 供试品溶液的制备：精密量取中药组合物10?30ml，置分液漏斗中，用乙醚提取4 次，每次15?45ml，分取水层用水饱和的正丁醇提取3?5次，每次20?30ml，合并正丁 醇液，置水浴上蒸干；加水溶解并置已处理好填有D1(ll大孔吸附树脂柱内，用水洗脱，流速 lml/min，弃去水洗液，用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解并定量 转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，即得； ⑶测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10Ul注入液相色谱仪，测定；其 中所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积 比为70 : 30甲醇-磷酸二氢钠溶液为流动相，其中磷酸二氢钠浓度为0.03mol/L，并用磷 酸调节pH值为4. 5,检测波长为207nm。
4. 根据权利要求3所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，其特征在于，所述中药 组合物中含西洋参以人参阜式，不得少于35mg/100ml。
5. 根据权利要求3所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，其特征在于，所述检测 方法还包括采用高效液相色谱法检测中药组合物中蟾酥的含量，包括以下步骤： (1) 对照品溶液的制备：精密称取经五氧化二磷减压干燥24小时的华蟾酥毒基对照 品、酯蟾毒配基对照品适量，加甲醇配制成每lml含华蟾酥毒基10yg和酯蟾毒配基50yg 的混合溶液，作为对照品溶液； (2) 供试品溶液的制备：精密量取中药组合物制成的口服制剂25ml，置分液漏斗中，力口 水25?50ml，混匀，依次加30ml，30ml，30ml，20ml，20ml的三氯甲烷提取5次，合并三氯甲 烷提取液，用氢氧化钠溶液洗涤，弃去氢氧化钠液，再用水洗涤，弃去水液，取三氯甲烷液用 无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇溶解并转移至l〇ml容量瓶中，加无水乙 醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得； (3) 测定：分别精密吸取步骤（1)对照品溶液与步骤（2)供试品溶液各10yl，注入液 相色谱仪，测定；其中所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅 胶为填充剂，以体积比为38:62的乙腈和0. 5%磷酸二氢钾为流动相，并用磷酸调pH2. 5,检 测波长为296nm，柱温40°C。
6. 根据权利要求5所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，其特征在于，所述中药 组合物中含蟾酥按华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的总量计，应为0. 50mg?2. 50mg/100ml。
7. 根据权利要求5所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，其特征在于，所述检测 方法还包括中药组合物指纹图谱检测方法，包括以下步骤： (1) 供试品溶液制备：取中药组合物，经适当方法处理后制成供试品溶液； (2) 高效液相色谱法测定对照指纹图谱：取10批以上中药组合物供试品在适当的色谱 条件下进样，测得各批次供试品的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获 得共有模式作为本品的对照指纹图谱； (3) 高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤（1)供试品溶液按步骤（2)相 同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱； (4) 将步骤（3)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤⑵得到的对照指纹图谱用相似度 软件评价。
8. 根据权利要求7所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，其特征在于，步骤（1)中 供试品溶液制备方法为：用〇. 22ym的微孔滤膜滤过，取续滤液；或lOOOOrpm离心lOmin， 取上清液即得； 步骤（2)中，所述的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为 流动相A，以体积浓度为0. 05?0. 1 %甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗 脱；柱温为35?40°C;流速为每分钟0. 8?1. 0ml;检测波长：270?280nm;
〇
9. 根据权利要求8所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，其特征在于，步骤（1)中 供试品溶液制备方法为：用〇. 22ym的微孔滤膜滤过，取续滤液；或lOOOOrpm离心10min， 取上清液即得； 步骤（2)中，所述的色谱条件为：色谱柱：WatersAtiantis T3,250_X4. 6mmi.d., 5 y m ;以甲醇为流动相A，以体积浓度为0. 05%甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行 梯度洗脱；柱温为35°C;流速为每分钟0. 8ml;检测波长：270nm;
〇
10. 根据权利要求7所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，其特征在于，步骤（1) 中供试品溶液制备方法为：精密吸取本中药组合物5. 0ml上样于经预处理的C18固相萃取柱 中，加纯水洗脱，弃去洗脱液,再加体积浓度20%甲醇溶液洗脱，弃去洗脱液，加甲醇洗脱， 洗脱液收集于量瓶中，l〇〇〇〇rpm离心10?15min，取上清液即得； 步骤（2)中，所述的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含 0. 05?0. 1 %甲酸的乙腈为流动相A，以体积浓度为0. 05 %甲酸溶液为流动相B，并按下表 中的规定进行梯度洗脱；柱温为30?40°C;流速为每分钟0. 8?1. 0ml;检测波长：203? 210nm；
〇
11. 根据权利要求10所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，其特征在于，步骤（1) 中供试品溶液制备方法为：精密吸取本中药组合物5.Oml上样于经预处理的C18固相萃取柱 中，加纯水洗脱，弃去洗脱液,再加体积浓度20%甲醇溶液洗脱，弃去洗脱液，加甲醇洗脱， 洗脱液收集于量瓶中，l〇〇〇〇rpm离心lOmin，取上清液即得；
步骤⑵中，所述的色谱条件为：色谱柱AgilentZorbax SB-C18，规格为250mmX4. 6mmi. d.，5 ii m ;以含0. 05%甲酸的乙腈为流动相A，以体积浓度为0. 05%甲酸溶 液为流动相B，并按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30°C;流速为每分钟0.8ml ;检测波 长：203nm ; 〇
【文档编号】G01N30/88GK104483437SQ201410756123
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月10日 优先权日:2014年12月10日
【发明者】顾治平, 阙瑞艳, 王恒斌, 陈力建, 张礼学 申请人:常熟雷允上制药有限公司