一种用于犬冠状病毒的免疫层析用试剂组合物及检测方法与流程

本发明涉及一种提高灵敏度的，并可以抑制非特异性反应的用于检测犬冠状病毒的免疫层析用试剂组合物或待检物处理液。本发明进一步涉及可抑制非特异性反应的、迅速简便且高精度地测定待检物的免疫层析检测方法。

背景技术：

犬冠状病毒病的病原体是犬冠状病毒（Canine Corona Virus, CCV）。以轻重不一的胃肠炎为临床特征，临床上呈致死性的水样腹泻。突然发病、精神消沉、食欲废绝、呕吐、排出恶臭稀软而带粘液的粪便。呕吐常可持续数天，直至出现腹泻前才有所缓解。以后，粪便由精状、半糊状至水样，呈橙色或绿色，内含粘液和数量不等的血液。迅速脱水，体重减轻。感染源主要是病犬和带毒犬，病犬排毒时间为14天，保持接触必传染的能力为期更长。病犬经呼吸道、消化道随口涎、鼻液和粪便向外排毒，污染饲料、饮水、笼具和周围环境，直接或间接地传给有易感动物。CCV在粪便中可存活6—9天，在水中也可保持数日的传染性，因此一旦发病，则很难制止传播流行。犬冠状病毒广泛分布于全世界,是对我国养犬业、毛皮动物养殖业危害最大的疫病之一。

近年来，人们对检测抗原的体外诊断试剂盒或便携式诊断装置的研究已经比较广泛。犬类疾病检测方面，如犬细小病毒、犬瘟热病毒检测试剂盒是一种常见的免疫层析装置。此病例中，抗原存在于犬的分泌物如泪液、唾液、粪便中，利用能识别病毒的单抗对此病毒检测的免疫层析装置进行深入研究。 但是，在检测试样为粪便的犬冠状病毒情况下，由于粪便中含有多种成分，且组成和比重也有差异，影响免疫化学结合检测法的准确性。为了使待检试样的影响最小化，已经提出了使用各种补偿手段对其来进行处理。

目前EDTA对于粪便等试样中所含有的血红蛋白稳定化来说不具备充分的作用，使用过渡金属离子的水溶性金属络合物得到的稳定化效果比只使用EDTA的效果要高。在传统的免疫层析装置中，层析膜的背景着色，通过所述组合物能够消除疏水结合和电相互作用效果的物质，如表面活性剂、高分子稳定剂，达到减弱或消除非特异性结合的作用。为了抑制非特异性反应，通常在缓冲剂中使用各种添加剂，例如牛血清白蛋白、酪蛋白、聚乙二醇、Tween20等。

本发明对非离子表面活性剂（例如Tween20、Triton X-100等）进行了实验。结果发现，利用免疫层析法检测试样中的待检物时，非特异性反应依然存在。在此基础上，本发明提出一种提高灵敏度的，并可以抑制非特异性反应的用于检测犬冠状病毒的免疫层析用试剂组合物及检测方法。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题

在传统的免疫层析检测装置中，目前EDTA对于粪便等试样中所含有的血红蛋白稳定化来说不具备充分的作用，利用免疫层析法检测试样中的待检物时，非特异性反应依然存在，使用过渡金属离子的水溶性金属络合物得到的稳定化效果比只使用EDTA的效果要高。

与现有技术相比，本发明提供了一种可抑制非特异性反应且高灵敏度的免疫层析用试剂组合物或待检物处理液。在此基础上，本发明提供了一种不用对试样进行预处理的、通过将试样直接添加到检测装置的样品吸收部位，可迅速简便且高精度地进行检测的免疫层析装置。例如，提供了一种通过将粪便用稀释液稀释，直接滴加到检测装置的样品吸收部位，可以迅速简便且高精度地进行犬疾病诊断的免疫层析检测装置。

另外，本发明还涉及通过将粪便、泪液、唾液等检测物，用待检物处理液混匀处理后，直接滴加到检测装置的样品吸收部位，可迅速简便且高精度地进行检测的检测技术。

解决问题的手段

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种适用于犬类病毒感染早期的检测试剂装置组合物及相应的免疫层析检测试纸条，利用本发明组合物的试剂条检测犬冠状病毒方法简单、检测时间短、成本低、特异性更强。

本发明的免疫层析组合物对犬类粪便、泪液、唾液等分泌物检测很有效，将稀释后的待检物滴加到样品吸收部位，可抑制样品中杂质的非特异性反应，从而达到灵敏度，检测出待检物。本发明的检测对象物为犬冠状病毒，生物体试样为粪便。

本发明中免疫层析用试剂组合物中的缓冲剂类型有：乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、Tris 盐酸缓冲液等,优选Tris 盐酸缓冲液。浓度为0.01-250mM 的范围，浓度如果低于0.01mM，缓冲作用不充分。浓度为250mM 以上时，高于必要的浓度，造成浪费。

本发明的免疫层析用试剂组合物的成分之一的螯合剂，含有氨基和羧酸官能团且可以与重金属离子和碱土金属离子形成络合的化合物，优选氨基膦酸类螯合剂，螯合剂的浓度为0.0001-0.005mM 的范围，浓度低于0.0001mM 时，不能抑制非特异性反应。

本发明的免疫层析用试剂组合物成分之一的非离子表面活性剂的例子有：聚氧丙烯烷基醚，聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯（商品名“Tween”系列）、聚氧乙烯对叔辛基苯基醚（商品名“Triton”系列）。非离子表面活性剂的含量为免疫层析试剂组合物的0.01-10%的范围，优选0.5-1%的范围。含量为1%以上时，不会带来更好的抑制非特异性反应的影响。

为了实现本发明目的，本发明根据上述免疫层析用试剂组合物提供一种用于检测犬冠状病毒的胶体金免疫层析检测试纸条，所述胶体金免疫层析检测试纸条包含：

1）包被犬冠状病毒抗原的单克隆抗体和二抗IgG两个条带的硝酸纤维膜；

2）含有胶体金标记犬冠状病毒抗原的单克隆抗体的玻璃纤维膜。

其中，所述的二抗IgG为羊抗鼠IgG抗体。

进一步地，所述硝酸纤维膜中犬冠状病毒抗原的单克隆抗体的浓度为1mg/mL，所述羊抗鼠IgG抗体的浓度为1mg/mL。

作为优选，所述玻璃纤维膜中胶体金标记的犬冠状病毒抗原的单克隆抗体的标记pH值为8.5，单克隆抗体与胶体金结合浓度为40μg/mL。

作为优选，所述胶体金颗粒平均直径为25nm。

前述免疫层析检测试纸条，还包括底板、样品垫和吸水纸，所述底板上黏贴硝酸纤维膜，硝酸纤维膜上方粘贴吸水纸，硝酸纤维膜下方依次相互搭接粘贴玻璃纤维膜和样品垫。

本发明还提供了一种制备前述胶体金免疫层析检测试纸条的方法，包括如下步骤：

1）制备犬冠状病毒抗原的单克隆抗体；

2）硝酸纤维膜的制备：稀释犬冠状病毒抗原的单克隆抗体及羊抗鼠IgG抗体；将硝酸纤维膜贴于底板后，在硝酸纤维膜上划上上述犬冠状病毒抗原的单克隆抗体与羊抗鼠IgG抗体，分别形成检测线和质控线，室温包被过夜，备用；

3）玻璃纤维膜的制备：将胶体金调整抗体pH值为8.5，单克隆抗体与胶体金结合浓度为40μg/mL，经稳定剂处理后，将标记好单抗的胶体金溶液均匀涂布到已经处理好的玻璃纤维膜上，冷冻干燥，备用；

4）最后在步骤2）制得的硝酸纤维膜的上方粘贴吸水纸，在硝酸纤维膜的下方依次相互搭接粘贴玻璃纤维膜和样品垫。

本发明的效果在于

本发明的免疫层析用试剂组合物含有缓冲液、螯合剂以及非离子表面活性剂，在对检测试样中的检测对象物进行处理后，能够抑制非特异性反应，使灵敏度增强，判断结果准确。

本发明的检测技术的另一重要作用是：若不用本发明的免疫层析用试剂组合物特殊处理样品垫与标记垫，则可以直接用免疫层析用待检物处理液对待检物进行预先混匀处理，并以展开液的方式滴加到免疫层析装置的样品吸收部位，直接检测抗原，迅速简便的对犬类疾病进行诊断。

本发明的免疫层析检测试纸条装置，采用双抗体夹心方法及免疫层析技术检测犬冠状病毒抗原，与其他检测技术相比，其检测样品不需要特殊处理，试剂和样本用量极小，样本量可低至1μL～2μL；既可用于抗原检测，也可用于抗体检测。并且能够大大缩短检测时间，不需使用荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器，就可以定性的检测犬冠状病毒抗原，检测结果清楚易于判断，试验结果可长期保存。因此本发明胶体金免疫层析检测试纸条具有特异性强、灵敏度高、操作简单、检测快速准确、不需要复杂的设备等优点，可以满足临床检验的要求，也非常适合野外现场、门诊、家庭个人以及实验条件不具备的场所等临床样品检测使用。

附图说明

图1 是免疫层析装置的试验片的示意图;其中，1为样品垫，2为标记垫，3为层析膜，4为检测线，5为质控线，6为吸水垫，7为背板。

图2 是本发明试纸条检测装置检测犬冠状病毒结果；其中，从左到右分别为未检测、阴性结果、阳性结果。

具体实施方式

以下实施例仅对本发明进行详细说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

免疫层析用试剂组合物：

1.1免疫层析用试剂组合物中的缓冲剂没有特别要求，作为缓冲剂类型有：乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、Tris 盐酸缓冲液等,优选Tris 盐酸缓冲液。浓度为0.01-250mM 的范围，优选10-200mM的范围，更优选30-180mM 的范围。浓度如果低于0.01mM，缓冲作用不充分。浓度为250mM 以上时，高于必要的浓度，造成浪费。

1.2作为本发明的免疫层析用试剂组合物的成分之一的螯合剂，没有特别限定，只要它可用作具有多个配位基的配位体即可。作为本发明中螯合剂，含有氨基和羧酸官能团且可以与重金属离子和碱土金属离子形成络合的化合物，优选氨基膦酸类螯合剂，螯合剂的浓度为0.0001-0.005mM 的范围，优选0.0005-0.002mM的范围，浓度低于0.0001mM 时，不能抑制非特异性反应。

1.3作为本发明的免疫层析用试剂组合物成分之一的非离子表面活性剂的例子有：聚氧丙烯烷基醚，聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯（商品名“Tween”系列）、聚氧乙烯对叔辛基苯基醚（商品名“Triton”系列）。非离子表面活性剂的含量为免疫层析试剂组合物的0.01-10%的范围，优选0.5-1%的范围。含量为1%以上时，不会带来更好的抑制非特异性反应的影响。

实施例2

免疫检测试纸条装置 ：

2.1标记垫，样品垫通常选用玻璃纤维膜。标记垫上含有胶体金颗粒与单克隆抗体或多克隆抗体其片段的结合物。

2.2层析介质主要采用硝酸纤维膜。层析介质其上划有识别抗原用的单抗或者多抗，以及识别标记物的二抗。

2.3 吸水垫选用滤纸即可。

2.4背板的一个面上涂布胶粘剂或者粘贴胶带，使其具有胶粘性，在该胶粘面上贴合设置样品垫部分、标记物部分、层析介质部分、吸水部分。

2.5判定原理简要说明

以样品垫（经过免疫试剂组合物处理的）末端浸入样本后，样品溶液沿着试纸条通过毛细作用从下往上泳动，溶解标记垫上干燥的标记物，若待测样品中有待检物存在，则标记物会直接泳动到检测线(T)和硝酸纤维膜上的划线物质发生免疫反应，从而胶体金颗粒发生聚集，形成红色的线条，然后其他未与划线物质结合的金标抗体继续通过毛细管作用向前泳动，与控制线(C)的羊抗鼠二抗发生结合反应，也形成红色线条，包被膜上即形成两条红色线，表示样品为阳性；若待测样品中无待检物，则无抗体与T线划线物质结合，从而T线红色线条消失，表示样品为阴性。C线是为检验金标免疫层析方法本身是否有效而设定的，所以无论样品中是否存在待检物，控制线C都应该显色。如果控制线C不显色，则说明试纸条失效。也可利用将试样与免疫层析用待检物处理液预先混合，然后以展开液的方式滴加到样品垫上(未经过任何处理)，与上述进行同样的检查，可以达到与上述同样的结果。

实施例3

犬冠状病毒胶体金免疫层析检测试纸条制备方法如下：

3.1 标记物的制备

在1ml的胶体金溶液液中加入0.1ml犬冠状病毒抗原的单克隆抗体[磷酸缓冲液 (pH7.4稀释至1mg/ml）]，室温下静置1分钟，再加入100μl 10%的牛血清蛋白(BSA)，充分搅拌后，以8000rpm离心15分钟。除去上清液后，加入上述磷酸缓冲液，制成标记试剂溶液。

3.2 层析膜上的判定部的制备

用磷酸缓冲液(pH7.4)将犬冠状病毒抗原的单克隆抗体稀释到1.0mg/ml，二抗稀释到1.0mg/ml ，经喷金划膜仪，将两者同时划到层析膜上，干燥后备用。

3.3 试纸条的组装

试纸条组成为一个衬板，在其上按顺序粘上样品垫、标记物垫、层析膜和吸水垫。将贴好的板切割成3mm宽的条状即为犬冠状病毒胶体金免疫层析试纸条,然后将试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存。

3.4 测定

检测时，用无菌棉签沾取待检动物的粪便样品，在1mL PBS缓冲液（pH7.2，0.01mol/L） 中混匀，待大颗粒沉于管底后，取上清滴在该试纸条上，约5-10min读取试纸条检测结果，读取时，试纸条水平放置，正面观察。

3.5结果判定

如果在包被膜上仅有C线一条红线显色，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中不存在犬冠状病毒；如果在包被膜上C线和T线两条红线都显色，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中存在犬冠状病毒；如果在C线不显色，则表明试纸条已失效。

3.6本发明应用效果举例：

（1）特异性试验：用生理盐水对犬冠状病毒、犬腺病毒Ⅱ型、犬细小病毒、犬腺病毒Ⅰ型、犬瘟热病毒、犬副流感病毒培养液倍比稀释至1:130，分别取120 μL滴加在样品垫上，另外设生理盐水做阴性对照。除犬冠状病毒呈阳性反应外，其他的样本皆为阴性反应，重复3次后结果相同，说明该方法有较高的特异性。

（2）敏感性试验：用生理盐水对犬冠状病毒作倍比稀释至1:130，分别取120μL滴加在样品垫上，试纸仍呈阳性反应，重复3次后结果相同，本发明试纸敏感性强。

（3）稳定性试验：将本发明的3批试纸条分别放置在在37℃恒温培养箱、常温、4℃，每隔1个月取出同时检测10份犬冠状病毒样本、10份阴性犬冠状病毒阴性样本，结果显示：37℃作用6个月对本发明的试纸条无破坏作用，证明该试纸条在高温下较为稳定；本发明的试纸条常温放置12个月仍较为稳定。

实施例4

分别用实施例3制备的犬冠状病毒胶体金免疫层析检测试纸条分别与韩国进口犬冠状病毒检测试纸条（韩国森普特公司）、上海生物公司犬冠状病毒检测试纸条（上海快灵生物科技有限公司）对临床80份样品进行检测，同时对比临床症状。分析检测结果。

结果表明（表1），本发明的检测试纸条同两种试纸条对检测样品的阳性符合率为100%，本发明同韩国安捷公司试纸条检测阴性符合率为98%，同上海快灵检测阴性符合率为97.5%，总符合率为98.5%。因此，从实验数据可以表明，本发明采用的免疫层析用试剂组合物及制备的胶体金免疫层析检测试纸条优于大多数商品试纸条。

表1 同两种试纸条检测样品对比结果

实施例5

用商品化ELISA试剂盒（上海岚派生物）和实施例3制备的胶体金免疫层析检测试纸条同时检测80份CCV粪便样品计算两者总符合率，分析检测结果。如表2所示，本发明的免疫层析检测试纸条同ELISA的总符合率为97.5%。

表2 试纸条与ELISA试剂盒检测结果比较

上述实施例为本发明较佳的一种实施方式，但本发明的实施方式并非受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的核心实质与原理的改变均应为等效的置换方式，均属于本发明要求保护的范围。