具有锥形珠陷获腔的微流体芯片及其制造的制作方法

本发明大体上涉及微流体芯片的领域，并且特别地涉及例如用于生物分析应用的、配备有珠陷获腔的微流体芯片，以及相关制造方法。

背景技术：

微流体器件一般指的是微制造装置，其用于泵送、采样、混合、分析和定量给送液体。微流体器件的突出特征源自液体在微米长度尺度上表现的特殊行为。微流体器件中液体的流动可以典型地为层状。远低于一纳升的体积可以通过制造具有微米范围内的侧向尺寸的结构获得。在大尺度上(通过反应物的扩散)受到限制的反应因此可以被加速。微流体器件因此用于各种应用。

许多微流体装置具有用户芯片接口和闭合流动路径。闭合流动路径便于将功能元件(例如，加热器、混合器、泵、紫外检测器、阀等)整合到一个装置中，同时最小化与泄漏和蒸发相关的问题。

通常，表面上的受体用于结合在样品中需要被检测的特定分析物。在结合之后，样品和干扰物质可以被洗掉。然后可以直接地(例如经由质量、折射率等的变化)或间接地(荧光免疫测定等)检测受体-分析物复合物。尽管微流体器件是用于分析的有前景的装置，但是目前将受体整合到微流体芯片的内部很有挑战。

已提出解决方案，其中受体被图案化在微流体芯片的表面上。更详细地，微流体芯片可以用其上图案化有捕获抗体的线的PDMS层进行密封。在该情况下，通过使用模版从溶液吸附抗体实现图案化捕获抗体。然而，这样的方法是麻烦的，具有低生产率，需要模版，并且另外由于吸附过程而较慢。另外，PDMS是昂贵的并且污染表面(在～20分钟接触时间之后使亲水表面疏水)。

长期以来已知的其它解决方案依赖用于测定的微珠。在这里，珠典型地涂覆有受体。珠可以在溶液中(例如，磁珠，或在毛细管中的单珠)或在沉积/定位在微流体芯片的特定区域中之后被使用。两种情况可以被区分：

·磁珠：通过使用磁体和冲洗将珠从干扰物质和样品分离。然而磁珠比非磁珠更昂贵并且难以制备。而且，这些珠是不透明的并且不是太适合于光学/基于荧光的测定；以及

·非磁珠，已针对非磁珠开发许多技术以用于在微流体器件中定位/操纵珠。

然而，这样的技术具有以下缺陷。它们需要：

-特定致动装置(电极，磁性结构，聚焦光，换能器，压电结构等)，并且因此复杂和昂贵；或

-微流体流动路径的特定几何形状(特定曲率半径，收缩部)，应当注意，有和没有珠，芯片的液压阻力可以显著地不同，并且被陷获的珠的稳定性系统地成问题。而且，特定样品/液体的粘性会是问题。

如上所述，一些解决方案使用收缩部或“过滤器”，其直接是微流体芯片中的流动路径的一部分，用于陷获珠。然而，这样的解决方案导致信号强度和信号质量之间的权衡。珠稳定性愈加成问题。

本发明提出针对珠稳定性问题的确定解决方案。

技术实现要素：

根据第一方面，本发明具体实施为一种微流体芯片，其包括层，珠陷获腔的阵列设在所述层中，其中所述腔中的每一个具有由一个或多个侧壁限定的锥形，所述侧壁均是亲水的，并且其中所述腔的每一个作为盲孔在所述层的厚度中延伸。

在实施例中，所述腔中的至少一些具有由侧壁形成的角锥形状，所述侧壁均是亲水的，并且其中，优选地，该角锥形状基本上由至少四个侧壁限定。

优选地，所述层包括诸如硅的一个或多个半导体元件，并且所述腔的角锥形状具有与所述层中的所述腔的制造的各向异性蚀刻工艺一致的几何形状。

在优选实施例中，所述腔中的至少一个、优选大部分均填充有珠，优选微珠，其平均具有1到40μm之间、优选2到20μm之间并且更优选2到10μm之间的直径。

优选地，所述阵列的腔中的大部分均填充有仅仅一个珠，其优选地是平均具有1到40μm之间、优选2到20μm之间并且更优选2到10μm之间的直径的微珠。

在实施例中，所述腔的开口的平均尺寸与所述腔中的珠的平均直径的比率在1.0到2.4之间，并且优选地在1.4到2.0之间。

优选地，所述腔的平均深度与所述腔中的珠的平均直径的比率至少为0.5，优选1.0，并且更优选1.3。

在优选实施例中，所述腔中的至少一个的两个或更多个子组由至少一个微通道连接，所述子组优选地是所述腔的阵列的行或列，并且其中，更优选地，所述子组中的一个或多个在微通道部分中被限定，所述微通道部分的底壁或顶壁由所述层的表面形成。

优选地，所述阵列由相对于所述腔的阵列延伸的盖层密封。

在实施例中，所述芯片包括一个或多个珠陷获腔的若干阵列，其中所述阵列优选地被插入在不同对的微通道部分之间。

优选地，所述芯片包括相应地位于所述若干阵列中的至少两个的一个或多个腔中的至少两种不同类型珠，其中所述不同类型的珠优选地在尺寸、涂层、材料和/或颜色方面不同。

根据另一方面，本发明具体实施为一种根据以上实施例中的任何一个的微流体芯片的制造方法，所述方法包括：

提供具有层的微流体芯片主体；以及

在所述层中制造珠陷获腔的阵列，其中所述腔中的每一个具有由一个或多个侧壁限定的锥形，所述侧壁均是亲水的，并且其中所述腔的每一个作为盲孔在所述层的厚度中延伸。

优选地，制造所述阵列包括优选地使用自限的各向异性蚀刻工艺各向异性地蚀刻所述层以获得所述腔。

在实施例中，所述方法还包括：通过散布珠溶液的液滴将珠沉积到所述阵列的所述腔中；以及用放置成相对于所述腔的阵列延伸的盖层密封所述阵列，并且其中密封所述阵列优选地包括层压所述盖层。

优选地，在沉积珠之后并且在密封之前，所述方法按照以下顺序还包括：干燥在其中具有珠的所述腔的阵列；优选地通过用冲洗溶液冲洗所述阵列和/或通过施加用于粘附过量珠的带去除未陷获在所述腔的内部的过量珠；以及必要时，再次干燥在其中具有珠的所述腔的阵列。

现在将通过非限制性例子并且参考附图描述具体实施本发明的装置和方法。图中所示的技术特征不必按比例。

附图说明

图1、图2、图12和图13均显示根据本发明的不同实施例的微流体芯片的简化表示的2D(俯)视图；

图3显示：在实施例中涉及的陷获在角锥形腔中的珠的简化表示的截面图(上图)和俯视图(下图)；

图4是在实施例中涉及的陷获在角锥形腔中的珠的扫描电子显微图像；

图5A-5I示意性地示出根据本发明的实施例的微流体芯片的制造方法的详细步骤；

图6示意性地示出图5的制造方法的选定步骤，其中上排显示微流体芯片的截面图，而下排显示相应的俯视图；

类似地，图7-9示意性地示出图5的制造方法的变型的选定步骤；

图10是对应于图5的流程图；

图11显示在实施例中涉及的改进的角锥形腔的简化表示的2D视图。最左侧图是俯视图，而其它图是截面图；

图14显示陷获在根据本发明的实施例获得的腔的阵列中的珠的荧光图像的底片；以及

图15是在实施例中涉及的陷获在截头锥形腔中的珠的简化表示的截面图。

具体实施方式

首先，并且大体上参考图1-4和11-13，描述涉及微流体芯片100的本发明的方面。芯片明显地包括工作层10、60，所述层包括设在其中的珠陷获腔20(也称为陷阱)的阵列30。明显地，腔20中的每一个具有由一个或多个侧壁21-24包围的锥形。重要地，这个或这些侧壁是亲水的并且腔20中的每一个作为盲孔在工作层10、60的厚度中延伸。

工作层10、60可以是衬底层10或盖层60。腔优选地设在层的厚度中，所述层的表面是微流体通道或通道部分12a的底壁或顶壁，如图2中所示。

在本申请中，“锥形”也表示“锥状”，即具有类似锥体的形式。通过“锥形”，并且与锥体的一个一般定义一致地(http://en.wikipedia.org/wiki/Cone)，它表示从平坦基部(对应于腔的开口28)平滑地渐缩到具有比基部28小的截面面积的相对端部(例如，顶点或截断面)的三维几何形状，所述平坦基部不必为圆形。其它定义假设锥体是角锥的特定情况，即将锥体定义为具有圆形横截面的角锥，例如参见http://mathworld.wolfram.com/Cone.html。在这里，假设锥形包括作为特定情况的角锥(具有多边形基部)。也就是说，当前的锥形不必具有圆形横截面。

由于制造限制，锥形然而将可能被截断，或至少不终止为完美、点状顶点。实际上，甚至可以利用截头锥体，如随后所述。如上面刚刚所述并且如下面的实施例中进一步所示，锥形孔将优选地具有多边形基部(基部对应于腔20的开孔)，并且因此为角锥形(具有多边形基部)。锥形在这样的情况下可以被称为倒角锥形状，原因是珠50可能从直接散布(通过液体散布技术)在珠陷阱的下阵列30的顶部上的液滴被捕获，其中陷阱是腔20，其在顶部是敞开的，即向内空心化。然而，该配置可以颠倒，从而具有设在罩盖中的腔，参见图7。

相比于本发明人也测试的其它解决方案，例如对于陷阱使用柱或通孔状腔的方案，对于珠陷阱使用盲孔状锥形腔结果证明在珠的稳定性方面出人意料地有利。也就是，由此产生的陷阱显示出在冲洗之后保持珠50的前所未有的倾向。本发明的实施例应用于微珠(例如，在其表面上具有受体的珠，其中按照生物测定中的常规做法，这样的受体可以用于结合溶液中的配体)，具有适度的复杂性并且不需要附加手段(如真空、磁场或电场)将珠保持就位。

珠的稳定性的显著改善的起因还不清楚；改善的稳定性可能是由于当珠陷获在腔中，即在锥形孔的尖端处时，侧向地(当冲洗时锥形腔更好地保护珠免于流体(气体或液体)的侧向、平面内运动的影响)和/或在珠下方发生的界面和/或机械现象。而且，锥形腔的(一个或多个)侧壁需要是亲水的，以便于它工作。

当前的设计和相应的制造方法还允许在覆盖陷阱之前放置珠，与多数(即使不是全部)已知的解决方案不同。

在制造方面，本发明人已注意到在散滴珠溶液之后并且在冲洗过量珠之前，对珠50和陷阱20进行干燥仍然实质上改善被陷获的珠的稳定性。这将随后详细地进行论述。

在一些已知的现有技术解决方案(例如参见，Sohn等人，生物传感器和生物电子器件，第21卷，2005，第303-312页)中，通孔状角锥形腔已被制造，以便陷获“巨型”珠，即在直径上比本文中预期的珠大至少一个量级的珠。然而，由于制造的角锥形腔在该情况下为通孔，它们必然具有对于本申请而言远远太大的最小深度。而且，这样的解决方案需要拾取-放置工具和背侧真空的施加，其不能应用于更小的珠，如这里预期的微珠，微珠典型地是具有在1-40μm的范围内的直径的聚合物珠(这样的珠典型地从液体悬浮液获得)。

尽管本发明允许在腔20中获得稳定的珠，然而它并不排除介电DEP电极等的附加使用。DEP电极可以实际上位于陷阱中或附近，例如使珠50浮起，从而例如回收珠(如果需要的话)，或将珠更多地暴露于在陷阱的阵列30所处的微通道中流动的溶液。另外，在实施例中，腔的表面可以例如使用Al金属化以便通过反射来放大荧光信号。

现在更特别地参考图3、图4、图11和图15，腔20中的一些或全部可以被赋予角锥形状，即具有多边形基部的锥形体积，也就是，由若干、不同侧壁21-24形成的腔，所述壁在当前情况下均是亲水的。角锥形状例如可以为四面体、四角锥或更复杂。尽管优选地，该形状基本上由(至少)四个侧壁21-24限定。因此，这样的腔20典型地具有三角形壁21-24，其理想地会聚到点，但是更可能会聚到截断面29。限定腔的开口28的平坦基部具有多边形，其至少是三边的，并且优选地是四边的。在后一种情况下，角锥形状基本上由至少四个侧壁21-24限定。

应当注意，壁不需要是完美平坦壁，可能是由于制造工艺中的危险。然而，应当注意，本文中公开的优选制造技术(参见下面)基本上防止该情况。例如由于光刻工艺，一些残余缺陷可能存在，但是这实际上是罕见的。相反地，侧壁通常是平坦的，原因是各向异性蚀刻遵循晶面。例如可以通过修改掩模(布局)控制如图11中所示的形状，所以最后形状至少在实施例中能够是可控的和可预测的。侧壁中的一个或多个例如可以被结构化或成形，如图11中所示，其中壁中的一个被结构化23a-d，从而允许局部液体注入，以及珠释放和吸引，尤其对于不使用盖层的那些实施例而言。

相比于“更”圆锥形的腔，在珠的稳定性方面，已发现使用角锥形状导致更加好的结果。这样的原因还未完全被理解。这可能是由于在围绕球形珠的拐角中留下的自由空间，这允许残余液体蒸发，参见图3，与圆锥形状不同。

图4是显示陷获在角锥形腔中的珠的扫描电子显微图像。在该图像中：

-“EHT”表示以千伏kV计的电子高压；

-“WD”表示样品表面和透镜的下部分之间的工作距离；

-“Mag”是放大倍数；

-“倾斜角”表示样品台的法线相对于电子枪的轴线的角；以及

-“信号A＝SE2”指示使用次级电子的检测器。

参考图4：在实施例中，工作层10包括诸如硅的一个或多个半导体元件，并且腔20的角锥形状具有与用于获得腔的制造工艺一致的几何形状，所述工艺有利地使用各向异性蚀刻工艺(典型地使用具有<100>晶向的硅片，原因是其它取向，例如<111>不会产生期望的角锥形状)。现在，尽管硅是优选的，但是以下考虑适用于其它半导体，例如第IV族元素，例如Ge或化合物半导体，例如SiGe，其它化合物III-V或II-VI材料，以及它们的相应的氧化物或氮化物。例如，可以各向异性地蚀刻GaAs和Ge。而且，本方法所基于的原理可以应用于一些金属层和相应的氧化物。然而，金属层不太实用。特别地，它们可能在层厚度上不具有相当的晶体均匀性。而且，可以例如预期使用Al2O3表面。Al2O3可以用作达到100-200nm的薄膜电介质，并且通过溅射或通过原子层沉积ALD被沉积。后者是昂贵但质量高的技术。而且，用于微珠陷获所需的层的厚度对于使用ALD是有挑战的。

角锥形状意外地与各向异性蚀刻工艺兼容。对于Si或类似的半导体元件，制造腔的各向异性蚀刻工艺导致角锥的平坦基部(即，开口28)和邻接壁之间的54.7°的理想角，这又确定角锥的深度-宽度比率。在图4中可以看到，这样的工艺允许腔的容易和清洁制造。然而，该理想角可能由于小缺陷而稍稍改变。

在变型中，可以使用干膜抗蚀剂并且更一般地，可以预料一些聚合物、塑料和金属。优选地，使用环氧基干膜抗蚀剂，其可以通过热压印被图案化。热压印也可以应用于其它塑料材料(例如，PMMA，COC，聚碳酸酯)，对于所述材料普通的塑料图案化方法可能不适合于产生角锥形微腔。例如，在已使用Si的各向异性蚀刻制造腔的阵列之后，可以通过Ni电镀来填充腔。电镀Ni层然后脱离，形成将在随后的热压印工艺中使用的模具或印模。可以通过将压力和温度施加到与塑料相接触的印模并且然后冷却和脱模而在塑料层上产生Si制腔的真实复制物。

现在更具体地参考图14，在实施例中，预备芯片使得它的腔(即，腔20中的至少一些，优选大部分)均填充有珠50、51、52。如先前所述，这样的珠优选地是微珠，即平均而言具有1到40μm之间的直径。对于如本文中预期的应用，2到20μm之间并且更优选地2到10μm之间的直径是优选的。珠优选地是聚合物珠，例如聚苯乙烯珠，但是原则上也可以使用硅石珠或乳胶珠。

如附图中所示，腔的横截面面积的尺寸相当于珠的尺寸。珠陷获腔是专门设计成陷获单个珠的陷阱。因此，珠可以典型地在两个(或更多个)点接触腔壁，甚至粘附在腔的尖端处。“腔”在本文中预期是不同于微通道或其它微流体特征的物体。由于本文中提出的解决方案，阵列30中的腔20的大多数均可以填充有仅仅一个珠50、51、52，如图14中所见。

目前，给出关于腔对珠的相对尺寸的细节，其允许优化被陷获的珠的稳定性和陷阱的占用率。更特别地参考图3、11和15：腔开口28的平均(线性)尺寸与平均珠直径的比率应当优选地在1.0到2.4之间。而且，对于1.4到2.4之间的比率已观察到最佳结果(在占用率方面)(也就是，平均40-60％占用率)。当比率在1.4-2.0内时这些结果进一步改善(在冲洗之后可以观察到平均达到60％占用率)。在一些情况下，可以获得达到90％的占用率。而且，将以上比率保持在2.0以下或优选地1.8以下允许基本上防止相同腔的多重占用。

例如，并且根据发明人汇集的各种结果，对于10μm(直径)珠，限定腔20的开口28的平坦基部的最大尺寸应当优选地小于24μm，并且更优选地小于18μm。这些优选数字例如由图14中所示的荧光图像确认。后者实际上显示陷获在根据随后参考图5描述的方法获得的腔的阵列中的珠的荧光图像的底片。实际上通过执行Si衬底的13μm深的TMAH蚀刻获得芯片的腔；使用200μm×500μm阵列。通过将大约200nL的10μm Fluoro-MAX(来自Thermo Scientific^TM)珠溶液(未稀释)移液到每个阵列上来整合珠。因此，在图14的图像的每一个中，使用10μm直径的珠。腔的开口的侧向尺寸(在图像中不可见)从8μm到24μm不等，而相应的最后占用率从5％上升到63％，对于18-20μm开孔看到80％-90％的峰值。对于该特定情况，获得的实际百分比为：8μm：5.4％；10μm：24.4％；12μm：32.5％；14μm：46.3％；16μm：51.6％；18μm：80.1％；20μm：89.9％；22μm：72.2％；以及24μm：63.2％。然而，多重占用出现在18μm并且在此之上增加。因此，开孔的尺寸的范围可以因此被限制到(对于10μm直径珠)例如14-18μm，甚至16-18μm。一致地，腔开口28的平均尺寸与平均珠直径的比率可以被限制到1.4-1.8或1.6-1.8。应当注意由以上特定情况引起的百分比值不同于先前提到的平均值，原因是后者从各种经验汇集。

现在参考图3和图15：腔20的平均深度与珠50的平均直径的比率优选地为至少0.5，更优选地为1.0，并且更加优选地为1.3。例如，由本发明人进行的实验表明10μm直径的珠能够在8μm×8μm开口中保持稳定，但是在该情况下发现珠的最后占用率/稳定性是欠佳的。当使用自限的各向异性蚀刻工艺时，这样的尺寸意味大约5μm的深度。因此，平均腔深度与平均珠直径的比率可以低至0.5。现在，对于经各向异性蚀刻的锥体，当希望获得完全包埋(即，嵌入)在腔中的珠时至少(大约)1.0d(其中d是珠的直径)的深度是必要的，假设锥形腔被截断并且截断面29足够大以容纳珠，如图15中所示。例如，10μm珠可以完全包埋到腔中，假如开口为至少19.33μm×19.33μm，并且深度最小为至少10μm，使用时基蚀刻；在时基蚀刻中在所有平面在顶点处合并之前停止蚀刻。如果腔未被截断(它们具有点状顶点，即自限蚀刻)，则比率需要至少为大约1.3，如图3中所示。

而且，本发明人还认识到珠不必需要完全包埋在腔中。也就是说，珠的一部分可以在开口28的平面上方出现(即，突出)以保持满意的稳定性，如图5中所示(未按比例)。因此可以相应地减小上述比率。

现在参考图1、图2、图6-9和图12-13，在实施例中，微流体芯片100可以具有腔20的两个或更多个子组32，例如阵列30中的行或列，其中两个子组由至少一个微通道14连接。优选地，这些子组中的一个或多个限定于微通道部分12a中，所述微通道部分的底壁或顶壁由工作层10限定。这样的配置允许多路复用，同时防止子组32之间的交叉污染。所以，优选的是将阵列30分成珠50的子组32，以便部分地隔离子组。腔的阵列例如可以布置成匹配微量滴定孔的典型坐标：在微量滴定板上，孔以9、4.5或2.25mm的间隔定位在二次点阵上。这可以便于使用机器人机械分配珠的溶液。为了腔的阵列的增加整合，也可以选择六角形点阵。例如，在图14所示的实验中使用的芯片设计包括阵列，其沿着蛇形微流体通道(200μm宽，14μm深)以六角形点阵布置分布，其中从一个阵列到另一个的角对角距离为约1.1mm。该布置允许在3mm×5mm的总面积内放置10个单独的阵列(每个占用200μm×500μm面积)，并且允许将200nL珠溶液的液滴分配到每个阵列而不合并液滴或交叉污染。

接着，如图5-9所示的“最后”装置中所见，微流体芯片100的腔20的阵列30优选地由相对于阵列30延伸的盖层60密封。盖层保护并且密封腔和它们的内容物。除了腔20之外，盖层60将可能密封通常存在于芯片100上的其它微流体结构。这样的微结构的例子是：装载垫11，检测抗体(或dAb)沉积区域70，毛细泵16或通气孔18，如图1和2中所示。

应当注意，尽管盖层60相对于阵列30延伸，但是它不必接触腔，原因是通常需要间隙以形成微流体通道。在图9的制造工艺中，腔由盖层密封，原因是微通道布置在腔之间。而且，在本文中所述的其它制造技术中，盖膜60实际上不直接接触腔，总是有由通道层沉积(图6)或蚀刻(图7和8)引入的间隙。典型地，通道深度在1到20μm之间。更浅的通道将产生更高的液压阻力和更小的厚度均匀性，而更深通道的制造将更困难和/或耗时。一般而言，可以制造的特征的最小侧向尺寸由于通道制造技术的纵横比限制随着通道的深度而增加。目前的制造技术(湿蚀刻或干蚀刻或干膜抗蚀剂图案化)将容易地提供具有高于1的纵横比的结构(例如，20μm深的通道中的20μm宽的特征)而不需要大量的参数优化努力。

就此而言，通道高度(或深度)可以被调节以确保珠不会在流动期间脱离。由于本解决方案，珠的稳定性显著地改善。而且，在强流体流动存在于微通道中的情况下可能总是有松动一些珠的残留风险。现在，如果微流体通道深度略小于珠的直径(例如，在先前的例子中小于10μm)，珠在流动期间决不会脱离。然而，太小的通道深度(例如，1μm)将增加液压阻力并且减小芯片的总液体容量(体积)；太大的深度(例如，大于10μm)将增加松动一些珠的概率。在使用带来去除过量珠的情况(即，在腔的内部的珠将保留并且在通道内部的过量将粘附到带)下具有略小于珠的直径的通道深度也将是有益的。

现在更具体地参考图12和图13，芯片100可以实际上包括若干阵列30(每个阵列包括一个或多个珠陷获腔20)。这些阵列30优选地在指定流动路径中插入在不同对的微通道部分之间，即并联或串联。例如，这些通道部分可以明显地由平行分离通道组成，如图13中所示，从而避免从一个部分到另一个的交叉污染，或者可以串联地布置(如图12中)。它们也可以布置在蛇形通道(未显示)的通道部分中。

接着，也可以有利地使用位于(一个或多个)阵列30的腔20中的不同类型的珠51、52。由于优选沉积技术，珠51、52典型地沉积在不同阵列30中。例如，可以使用两种不同类型的珠：一种类型的珠51用于分析物检测，而另一类型的珠52用于对照，如图12、13中所示。如先前所述，取决于寻求的实际应用，阵列30可以串联或并联。在本文中预期的多数应用(例如，生物分析)中，珠在涂层方面不同。然而珠可以更一般地在尺寸、涂层、材料和/或颜色方面不同。

应当注意，现有技术的解决方案主要着重于在装载珠(经由珠溶液流动)之前密封装置。这使得难以(如果可能的话)具有位于装置中的预定位置的不同类型的珠。因此，这对于生物分析实际上意味着更多的步骤。

根据另一方面，本发明可以具体实施为如上所述的芯片100的制造方法。现在参考图5-10描述制造方法。最一般地，这样的方法围绕着在装置100的工作层10、60中制造(步骤S20)珠陷获腔20的阵列30的基本步骤。与先前所述的装置100一致地，这种制造保证腔20中的每一个具有由一个或多个侧壁21-24限定的锥形，所述侧壁均是亲水的。腔20均作为盲孔在工作层10、60的厚度中延伸。

取决于所选择的材料10、60，不同方法是可能的。腔可以设在衬底层10中或盖层或膜60中。如先前进一步所述，制造方法可以包括各向异性蚀刻工艺、热压印工艺或任何其它合适的工艺以获得腔20。迄今为止，各向异性蚀刻工艺在针对腔获得的质量方面似乎是最有前景的。自限的各向异性蚀刻工艺优于时基蚀刻工艺，原因是前者不易受到蚀刻速率的变化并且在过蚀刻的情况下允许深度保持几乎恒定(最后深度由腔开口28的尺寸限制)。

如先前所述，各向异性蚀刻工艺优选地在<100>晶片上执行，<100>晶片具有在<110>方向上的平坦部；因此顶表面具有在<100>方向上的法线。晶片的暴露面因此平行于(100)平面，即在倒易点阵向量的基础上正交于(100)方向(对于Si为钻石结构)。除了腔的制造之外，各向异性蚀刻工艺也可以用于制造微流体结构(例如，图8和9)。如果具有倾斜侧壁对于微流体结构(例如通道)不是有害的，则具有<100>晶向的Si晶片的湿蚀刻优于干蚀刻技术，原因是湿蚀刻与分批加工兼容并且因此可以总体上更快，这取决于经加工的晶片的数量。应当注意，湿蚀刻通常比干蚀刻慢，生产每个晶片，干蚀刻快得多。总生产率因此取决于一起加工的晶片的数量。

必要时，(一个或多个)阵列30可以被清洁(例如，使用乙醇、水等)和/或用等离子体(例如，空气、氧或氦)处理。在所有情况下，可以仅仅通过将珠溶液55的液滴散布S32到例如(一个或多个)阵列30的顶部上而将珠50、51、52沉积S30到腔20中。例如，可以将大约2μL的储备珠溶液(典型地作为1％固体悬浮液被提供)施加到(一个或多个)阵列30。

在沉积S30珠之后(并且在密封S40芯片之前)，建议：

-干燥S34腔20(珠50保持在腔中或附近)；并且然后

-例如通过用冲洗溶液冲洗S36a(一个或多个)阵列30和/或通过施加用于粘附S36b过量珠的带来去除S36过量珠(即，未陷获在腔20内部的那些珠)；之后

-必要时，再次干燥S38在其中具有剩余珠的腔20的阵列30，即不总是需要最后干燥步骤，例如当仅仅施加带以去除过量珠时。

本发明人已认识到，在去除过量珠之前干燥阵列30出人意料地导致更稳定的珠50。因此发现对最后占用率的影响是显著的：取决于其它条件，由于在先的干燥步骤S34，占用率可以改善20％到60％，甚至更多。可以推断当冲洗和干燥(例如，N2流动)时锥形腔更好地保护珠免于流体(气体或液体)的侧向、平面内运动的影响。优选的冲洗溶液例如是缓冲溶液或去离子水。更一般地，它可以是不会不利地影响珠或涂覆在其上的蛋白的任何溶液。

最后，阵列30(更一般地芯片100的一部分或全部)可以用盖层60(例如，干膜)密封S40，所述盖层优选被层压以便保证良好密封。当腔设在层10中时，盖60放置成相对于腔20的阵列30延伸，由此形成闭合微流体通道12、12a、14和结构16、18。

现在详细地论述四个不同制造例子。第一制造例子在图5中详细地示出。图5的详细步骤另外在图10的流程图中被捕捉。图6仅仅示出该第一制造方法的选定步骤，而图7-9示出其它可能制造方法的选定步骤。在图6-9的每一个中，上排图是在不同制造阶段的微流体芯片的截面图，而下排显示相应的俯视图。

首先参考图5、图6和图10，第一制造例子使用各向异性腔蚀刻，接着使用干膜抗蚀剂通道制造。详细地：

-步骤S10：提供微流体芯片主体，其包括层(或衬底)10。

-块S20：腔和通道的制造：

○S21，图5A：层10被氧化，例如，硅通过热氧化被氧化以获得SiO2层10o。获得的电绝缘层10o典型地覆盖整个衬底10。代替氧化物，也可以试图获得氮化物，如Si3N4。

○在步骤S22，图5B：例如使用干湿蚀刻或湿蚀刻图案化氧化物。为了该目的，光致抗蚀剂典型地用作掩模(图5B示意性地描绘在蚀刻氧化物和剥离光致抗蚀剂之后的芯片)；

○然后，各向异性蚀刻衬底层10，步骤S24，图5C，从而获得腔20和其它沉积区域70。优选地，使用湿蚀刻剂，其典型地是TMAH或KOH。典型地在Si蚀刻之前进行短氧化物蚀刻(例如BHF)以便去除Si表面上的天然氧化物；

○接着：剥离氧化物，步骤S25，图5D。然而这是可选的，原因是需要时氧化物可以留在表面上。典型地，缓冲氧化物蚀刻(例如BHF)用于该目的；并且优选地通过沉积、暴露和然后显影干膜抗蚀剂(负性光致抗蚀剂)或环氧基负性光致抗蚀剂(例如SU-8)图案化通道的侧壁62，步骤S26，图5D；

-块S30：珠沉积(也称为试剂整合)：

○步骤S32，图5E：珠溶液的液滴沉积在腔阵列20上(不同类型的珠可以沉积在相应的阵列上，如图12-13中所示)；

○步骤S34，图5F：干燥阵列30和珠(优选地通过自然蒸发，通过N2的气流或通过将芯片放置在受控环境中或暖板上，等等)；

○步骤S36：去除过量珠，优选地通过：(i)冲洗它们，例如使用去离子水或缓冲溶液的流，步骤S36a，图5G；和/或(ii)施加诸如胶带或PDMS的带，过量珠将粘附到所述带，步骤S36b，图5H。必要时，多次施加带；以及

-S40，图5I：最后，芯片100(特别是腔的(一个或多个)阵列30)用优选地被层压S42的盖层60(例如，干膜抗蚀剂)密封。为了该目的，盖层60典型地被适度加热到例如45-50℃。盖膜可以具有在装载垫处的开口以移液液体(在步骤S40中看到，图6)。可以通过切割或冲压来图案化这样的开口。

制造方法的以上例子允许灵活设计，原因是腔和通道的制造被分开。还可以认识到，这样的方法允许圆形通道结构。然而这样的方法的缺陷在于它需要两次掩模并且被冲洗的珠可能留在通道内部。

现在参考图7，描述第二制造例子，其中珠被整合到盖层60(例如，干膜抗蚀剂)而不是层10。简单地说：

-步骤S20a：使用模具65以在层60中图案化腔(例如，通过热压印)；

-步骤S20b：分离图案化的层60；

-步骤S30：再次通过移液珠溶液液滴、干燥、冲洗和再次干燥将珠沉积在图案化的层60的腔中；

-步骤S40：最后，通过将盖层60放置在芯片上，优选地通过将盖层60层压到其上密封MF芯片。

在该方法中，珠的整合与衬底和通道无关，这允许衬底10和通道的设计的更大灵活性。MF芯片可以具有被蚀刻(各向异性蚀刻，或深度反应蚀刻)或沉积(干膜抗蚀剂，SU-8等)的或通过热压印或模制图案化的微流体结构。盖膜可以层压在有或没有预先表面修饰或处理的任何相容衬底上。然而，该方法可能需要透明衬底以用于更有效的荧光检测。而且，相比于整合到衬底中的珠，珠可能更容易从膜脱离。

接着，参考图8，简单地描述第三制造例子，其使用两步光刻和各向异性Si蚀刻：

-步骤S20c：通过各向异性Si蚀刻来蚀刻通道。接着进行热氧化(未显示)；然后

-步骤S20d：在氧化物的图案化之后通过各向异性Si蚀刻来蚀刻腔；

-步骤S30：整合珠；以及

-步骤S40：密封芯片。

这样的制造方法允许灵活设计，原因是陷阱和通道制造被分开。然而，它需要更多的制造步骤(需要两次掩模)，以及两个蚀刻步骤之间的附加热氧化。另外，在该方法中，被冲洗的珠可能留在通道内部。

最后，并且参考图9，描述最后制造例子，其依赖于单步光刻和各向异性Si蚀刻。在步骤S20e：在相同时间使用各向异性蚀刻在单个光刻步骤中蚀刻通道和腔。然后，在步骤S30整合珠，并且密封芯片，步骤S40。利用这样的方法，在一个蚀刻步骤中制造通道和陷阱两者，其成本效益更高。而且，在自限的蚀刻工艺中可以通过调节通道的宽度限定通道深度，原因是更宽的开口导致更深的通道，反之亦然。每个腔可以经由微流体通道彼此连接并且连接到微流体网络，所述微流体通道的宽度小于腔的宽度，如S20e(图9)中所示。然而，这样的制造方法意味着更严格的设计规则，由于将腔互连的微流体通道的小尺寸导致更高的液压阻力。也有在腔的内部形成气泡的风险。

目前，论述了本发明的实施例的应用的例子。也就是，在开放通道系统(为了简单起见，芯片未用盖膜密封)中示范简单的配体-受体测定：

·使用来自Bangs Laboratories Inc.^TM的聚苯乙烯制的“Superavidin”涂层珠(10μm直径)：用抗生物素蛋白(已知很强地结合到生物素的一种蛋白)涂覆10μm聚苯乙烯珠。商用储备溶液包含作为1％固体的珠；

·用PBS+0.5％吐温20将储备溶液稀释到1/5(也可以使用更大的稀释)；

·使用根据图5A-5C(图10中的步骤S10至S24)获得的腔的阵列：将大约2μL的珠溶液散布在阵列上并且进行干燥(1到2分钟足以完成干燥)；

·在PBS+0.5％吐温20的流下冲洗阵列和珠(大约30mL、持续10s)；

·然后在DI水流下冲洗阵列和珠(大约30mL、持续10s)；

·然后在氮流下干燥阵列；

·用PBS中的1％BSA+0.5％吐温20的滴覆盖阵列和珠持续15分钟；

·用PBS+0.5％吐温20、水冲洗阵列和珠并且在氮流下干燥。

·最后，可以密封和储存芯片。

对于典型测定，用户进行以下三个步骤，其中分析物由荧光标记生物素分子表示。

·阵列和珠暴露于50μg/mL生物素-590-Atto的溶液持续15分钟，同时被保护免于光。在该步骤期间，生物素-590-Atto结合到珠上的抗生物素蛋白；

·用PBS+0.5％吐温20和水冲洗阵列和珠。这些冲洗步骤是可选的，但是可以被应用以便增加测定的灵敏度。

·使用荧光显微镜监视生物素-Atto-590(配体)结合到珠上的抗生物素蛋白(受体)。单珠腔允许简单的信号读取和解释而没有任何光学伪影。

本文中所述的方法和装置可以在微流体芯片的制造中使用。由此产生的芯片可以由制造商以原始形式(例如，作为结构化的双层装置)或以包装形式配销。在后一种情况下芯片可以安装在单芯片封装中。在任何情况下芯片然后可以与其它元件整合，作为(a)中间产品或(b)最终产品的一部分。

总之，本发明的实施例提供各种优点。例如：

-本发明的实施例允许以特别地和出人意料地稳定的方式保持珠，尤其是假如在去除过量珠之前干燥珠和腔阵列。在随后暴露于液体和干燥期间仅仅损失少量珠。在对用于测定的微流体器件和图案化受体的多年全球研究之后，终于发现用于将珠(或受体)整合到微流体器件的很有效方法；

-当前的设计和相应的制造方法还允许在覆盖陷阱之前放置珠；

-腔的阵列可以相对于珠确定尺寸从而每个腔陷获单珠。单珠腔允许更简单的信号读取和解释，需要单层以容纳珠，并且导致更少(甚至没有)光学伪影；以及

-本文中提出的制造方法允许高生产率制造。各种珠整合策略被提出，其允许微流体器件和流动路径的灵活设计。本发明的实施例所基于的概念偶然地与若干微流体特征(镜、塑料芯片制造等)相容。

尽管已参考有限数量的实施例、变型和附图描述本发明，但是本领域的技术人员将理解，可以进行各种变化并且等效物可以被替换而不脱离本发明的范围。特别地，在指定实施例、变型中叙述或在图中显示的特征(装置或方法)可以与另一实施例、变型或图中的另一特征组合或替换另一特征，而不脱离本发明的范围。因此可以预料关于以上实施例或变型中的任何一个所述的特征的各种组合，其仍然在附带的权利要求的范围内。另外，可以进行许多微小的修改以使特定情况或材料适应于本发明的教导而不脱离它的范围。所以，本发明旨在不限制到所公开的特定实施例，而是本发明将包括落在附带的权利要求的范围内的所有实施例。另外，可以预料不同于上面明确描述的许多其它变型。例如，不同于本文中明确描述的其它材料可以用于层10、60的每一个。另外，通道、装载垫、通气孔、腔等可以带有各种尺寸。

附图标记列表

10 基层

10o 氧化物层

11 装载垫

12 微流体通道(微通道)

12a 微通道部分

14 多路复用微通道

16 毛细泵

18 通气孔

20 珠陷获腔

21-24 腔的侧壁

24a-d 结构化(多面)的壁

28 腔开口/锥形基部

29 腔底表面

30 珠陷获腔的阵列

32 腔子组(行/列)

50 珠

51 分析物检测珠

52 控制珠

55 珠溶液(液滴)

60 盖层(干膜)，盖

62 通道壁

65 用于在盖层60中压印腔的模具

70 用于检测抗体(dAb)沉积的腔

72 沉积的检测抗体(dAb)

100 微流体芯片