本发明涉及显微组织切片和组织化学成分胼胝质的快速检测技术，具体涉及一种基于石蜡切片和苯胺蓝荧光染色法观察匍匐翦股颖叶片组织胼胝质的沉积的方法。
背景技术：
胼胝质是一种具有1，6分支的线性β-1，3葡聚糖，加热后为加粗变短的胶状结构。在植物发育过程中，在很多地方都可以发现胼胝质，包括细胞板、花粉、花粉管、种子、叶以及茎、表皮、筛板、胞间连丝、木质部形成过程中的次生壁等。胼胝质具有迅速聚合和解聚的物理和生理特性。此外，作为应激反应的一部分，在植物受伤、遭受病原菌感染或受到各种胁迫时快速而大量地合成，来应答外界的机械损伤、各种病原菌入侵引起的生物胁迫，以及物理、化学、环境因子等引起的生物胁迫等。逆境下，筛管分子内会迅速合成胼胝质并沉积到筛板的表面或筛孔内堵塞，一旦外界刺激解除，沉积到筛板表面或筛孔内的胼胝质则会迅速消失，使筛管恢复正常的运输功能。因此，胼胝质在植物的生命活动中起重要调节作用。
匍匐剪股颖是多年生草本植物，主要用于草坪草、高尔夫球场、足球场等地方，但是在生长过程中面对多种病害的威胁，对于银元斑病、褐斑病、蠕孢菌病害、棉腐病、灰雪霉病、粉红雪霉病都感染。当植物遭受病原菌侵染时，胼胝质能快速积累在某些细胞间的通道上，将病原菌限制在某一区域，阻止其进一步扩展。而作为应对，病原物也能通过蛋白互作募集寄主的胼胝质降解酶将阻碍运动的胼胝质降解掉，恢复其运动能力。因此，监测匍匐剪股颖染病情况下维管束中的胼胝质的合成及其含量是衡量匍匐剪股颖染病状况以及筛选出具有较强抗病性植株的关键指标。目前，对于匍匐剪股颖叶片组织中胼胝质的研究相关的报道在国内尚无相关文献。
石蜡切片是组织学常规制片技术中经典、应用最为广泛的方法。但是常规的石蜡切片方法耗时长，从取材固定到封片制成永久片标本至少需要连续一周的时间，并在实际应用中受到诸多因素的限制，而且在制片过程中涉及到一些对人体有害药品的使用，长时间实验会危害实验人员的身体健康以及造成环境污染。最重要的是因其实验周期过长不能及时的检测匍匐剪股颖的生长状况并对病害情况及时的采取补救措施。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种基于石蜡切片和苯胺蓝荧光染色法观察匍匐翦股颖叶片组织胼胝质的沉积的方法，首次利用石蜡切片和苯胺蓝荧光染色法观察匍匐翦股颖叶片组织胼胝质的沉积，石蜡制片全程耗时2天，极大的缩了短匍匐剪股颖石蜡制片的实验时间，突破了材料本身、环境因素所带来的限制，可快速高效的完成石蜡制片过程。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
基于石蜡切片和苯胺蓝荧光染色法观察匍匐翦股颖叶片组织胼胝质的沉积的方法，包括如下步骤：
S1、进行药品的配制；
S11、将福尔马林10ml、乙酸3ml、50％的乙醇87ml、5ml甘油混合均匀，得FAA固定液；
S12、将无水乙醇与二甲苯以1：1的比例混合配制成1/2二甲苯；
S13、称取0.1g水溶性苯胺蓝溶解于100ml浓度为0.07mol/L，pH＝7的磷酸缓冲液中，得0.1％的苯胺蓝荧光染色剂。
S2、制作石蜡切片；
S21、用锋利的刀片快速取下宽度约0.8mm的匍匐剪股颖叶片，将叶片切割成长度约5mm左右小段，放入青霉素小瓶中，加入步骤S11所得的FAA固定液，固定12h；
S22、经FAA固定后，依次置换15％、30％、50％、70％、85％乙醇中进行梯度脱水，各脱水20min，于95％乙醇中脱水30mim，无水乙醇中脱水两次，各20min；然后依次置换1/2二甲苯、二甲苯进行透明，于1/2二甲苯中透明1h，二甲苯中透明两次，每次30min，至材料完全透明为止；
S23、在装有所得透明材料的青霉素小瓶中加碎蜡两次，第一次加入与瓶中二甲苯等量的碎蜡，放入电热鼓风干燥箱中温度36℃保持1h至所加碎蜡完全融化后，加入瓶中液体一半的碎蜡，放入电热鼓风干燥箱中调节温度至36℃过夜后，调节温度至42℃，置换50％石蜡保持1h后，温度调至50℃，置换75％的石蜡保持30min后，调节温度至60℃，依次置换纯石蜡A、纯石蜡B、纯石蜡C各30min，然后采用TKY-BMB型石蜡包埋机进行包埋，一个蜡块中一个材料，蜡块的尺寸为：0.5cm×0.5cm×0.5cm，将包埋好的蜡块冷却后直接修块，进行切片或保存到4℃冰箱备用；
S24、采用轮式手动切片机进行连续切片，厚度10μm；将HH-6数显恒温水浴锅温度调节至45℃，在500ml大烧杯加入蒸馏水放入水浴锅中，将切好的蜡带放入烧杯中，待蜡带完全展开后，将涂抹好蛋清甘油的载玻片伸入烧杯中，使蜡带粘到载玻片上，将粘有蜡带的载玻片自然晾干后，在光学显微镜下观察展片效果，取展片效果好的片子置于电热鼓风干燥箱中于38℃下烘烤，直到片子完全干燥；
S25、取干燥的片子，依次放到分别加有二甲苯、1/2二甲苯、95％的乙醇、85％的乙醇、70％的乙醇、50％的乙醇、30％的乙醇、磷酸缓冲液、0.1％的苯胺蓝染色剂的立式染缸中；在二甲苯、1/2二甲苯中各5min，95％的乙醇、85％的乙醇、70％的乙醇、50％的乙醇、30％的乙醇中各5S，磷酸缓冲液中10min，0.1％的苯胺蓝染色剂中30min；然后将染色后的片子取出，置于蒸馏水中30S，洗净片子上的杂质后，过1/2二甲苯、二甲苯各10S，待片子干燥后采用中性树胶封片；
S26、将所得的片子自然风干后，置于LeiCaDM6000B荧光显微镜下观察并拍照。
其中，所述锋利的刀片为剃须刀片或单面刀片。
其中，所述步骤S4中的磷酸缓冲液的浓度为0.07mol/L，pH＝7。
本发明具有以下有益效果：
首次利用石蜡切片和苯胺蓝荧光染色法观察匍匐翦股颖叶片组织胼胝质的沉积，同时极大的缩了短匍匐剪股颖石蜡制片的实验时间，突破了材料本身、环境因素所带来的限制，可快速高效的完成石蜡制片过程，且染色效果好，染色结果较稳定。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了基于石蜡切片和苯胺蓝荧光染色法观察匍匐翦股颖叶片组织胼胝质的沉积的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、进行药品的配制；
S11、将福尔马林10ml、乙酸3ml、50％的乙醇87ml、甘油5ml混合均匀，得FAA固定液；
S12、将无水乙醇与二甲苯以1∶1的比例混合配制成1/2二甲苯；
S13、称取0.1g水溶性苯胺蓝溶解于100ml浓度为0.07mol/L，pH＝7的磷酸缓冲液中，得0.1％的苯胺蓝荧光染色剂。
S2、制作石蜡切片；
S21、用锋利的刀片快速取下直径约0.8mm的匍匐剪股颖叶片，，将叶片切割成长度约5mm左右的小段，放入青霉素小瓶中，加入步骤S11所得的FAA固定液，固定12h；
S22、经FAA固定后，依次置换15％、30％、50％、70％、85％、95％、100％的乙醇中进行梯度脱水，各脱水20min，于95％乙醇中脱水30mim，无水乙醇中脱水两次，各30min；然后依次置换1/2二甲苯、二甲苯进行透明，于1/2二甲苯中透明两次，每次1h，二甲苯中透明1h，至材料完全透明为止；
S23、在装有所得透明材料的青霉素小瓶中加碎蜡两次，第一次加入与瓶中二甲苯等量的碎蜡，放入电热鼓风干燥箱中温度36℃保持1h至所加碎蜡完全融化后，加入瓶中液体一半的碎蜡，放入电热鼓风干燥箱中调节温度至36℃过夜后，调节温度至42℃，置换50％石蜡保持1h后，温度调至50℃，置换75％的石蜡保持30min后，调节温度至60℃，依次置换纯石蜡A、纯石蜡B、纯石蜡C各30min，然后采用TKY-BMB型石蜡包埋机进行包埋，一个蜡块中一个材料，蜡块的尺寸为：0.5cm×0.5cm×0.5cm，将包埋好的蜡块冷却后直接修块，进行切片或保存到4℃冰箱备用；
S24、采用轮式手动切片机(KD-2508浙江省金华市科迪仪器有限公司)进行连续切片，厚度10μm；将HH-6数显恒温水浴锅(金坛市顺华仪器有限公司)温度调节至45℃(低于石蜡熔点15℃)，在500ml大烧杯加入蒸馏水放入水浴锅中，将切好的蜡带放入烧杯中，待蜡带完全展开后，将涂抹好蛋清甘油的载玻片伸入烧杯中，使蜡带粘到载玻片上，将粘有蜡带的载玻片自然晾干后，在光学显微镜(Motic B3 Professional Series)下观察展片效果，取展片效果好的片子置于电热鼓风干燥箱中于36℃下烘烤，直到片子完全干燥；
S25、取干燥的片子，依次放到分别加有二甲苯、1/2二甲苯、95％的乙醇、85％的乙醇、70％的乙醇、50％的乙醇、30％的乙醇、磷酸缓冲液、0.1％的苯胺蓝染色剂的立式染缸中；在二甲苯、1/2二甲苯中各5min，95％的乙醇、85％的乙醇、70％的乙醇、50％的乙醇、30％的乙醇中各5S，磷酸缓冲液中10min，0.1％的苯胺蓝染色剂中30min；然后将染色后的片子取出，置于蒸馏水中30S，洗净片子上的杂质后，过1/2二甲苯、二甲苯各10S，待片子干燥后采用中性树胶封片；
S26、将所得的片子自然风干后，置于LeiCaDM6000B荧光显微镜下观察并拍照，在荧光显微镜下拍照后，照片中淡黄绿色亮斑即为胼胝质。
所述锋利的刀片为剃须刀片或单面刀片。所述步骤S4中的磷酸缓冲液的浓度为0.07mol/L，pH＝7。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。