一种快速定性定量检测粮食中农残含量的方法与流程

本发明涉及粮食中农残留检测
技术领域：
，具体涉及一种快速定性定量检测粮食中农残含量的方法。
背景技术：
：随着社会的进步，人类逐步改变社会的同时也在影响着自然生态，病虫害作为农作物必须经历的一个过程，随着农药的发明而大幅度避免了这一灾害。但是现在农药的广泛使用，造成的残留问题也逐渐显现在人们的面前。由于农药超过一定含量后，会对人或者动物造成致病、致畸乃至致死作用，而人类作为食物链的顶端，有些农药经过残留不断累积，会对人造成危害，因此世界各国对农产品中农残含量的规定也越来越完善，目前我们国家也制定了相应的检测方法，来控制粮食以及食品中农残的含量。目前对于农残的检测方法也越来越多，而国标中对农残检测的方法涉及的仪器比较多，很多企业乃至高校均不具备，并且国标检测粮食中农残含量一个样品就需耗时将近90分钟，而且是在知晓具体某种农药残留的基础上进行的，因此不利于大量样品的处理。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种快速定性定量检测粮食中农残含量的方法，可以使54种农残在20分钟内实现有效分离，改进了国标检测农残过程的繁琐，分析时间长，定量限高等缺点，可以实现较难发现的有机磷和氨基甲酸酯类农残的分离，实现快速定性、定量检测粮食中农残的含量，同时为保证食品安全做技术支持。本发明通过以下技术方案实现：一种快速定性定量检测粮食中农残含量的方法，包括以下步骤：1）农药混标的配制：精确配制多种农药混标100ug/kg，按照倍数1：2：4：8：16：32：64：128稀释配制8个标线，待测；2）待测粮食样品的制备：准确称取粉碎的待测样品，萃取、净化后过0.22μm有机相滤头，待测；3）步骤1）混标和步骤2）样品分别采用高分辨Q-Exactive液质联用仪按以下液相色谱和质谱条件进行检测，液相色谱条件：色谱柱：HypersilGOLDC18色谱柱（100mm×2.1mm，3μm）；流动相：A：5mM甲酸铵水溶液+0.1%甲酸，B：甲醇；流速：0.30mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL；梯度洗脱程序：时间(time)0.00.512.016.016.120.0A%5510010055B%9595009595；质谱条件：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：Full-MS/t-MS2模式；鞘气压力：35arb；辅助气压力：10arb；毛细管电压：3.80kv（+），3.20kv（-）；毛细管温度：350℃；探针温度：300℃；分辨率：70，000；扫描范围：56-840m/z，Full-MS扫描模式；HCD碰撞能量：35eV；4）通过ToxID软件中农残数据库的精确质量数和保留时间筛选混标中和粮食样品中农残，然后对比样品与标品的Full-MS模式检测的一级碎片离子定性以及t-MS2模式检测的二级碎片离子定性，得到色谱图后采用定量软件，通过标准曲线自动计算得到测定液的样品浓度；粮食中农残含量W0按以下公式计算：，式中C0为测定液样品的浓度，单位ug/L；M为样品质量，单位g；V为加入乙腈体积，单位mL。本方法中特定的液相色谱和质谱条件可使农残在20分钟内实现有效分离，线性范围内具有良好的相关系数R2>0.999，最低检出限低于1μg/L，回收率介于72%～120%，重复检测峰面积和保留时间相对标准偏差均小于3%。高分辨Q-Exactive液质联用仪，通过ToxID软件中600种农残数据库的精确质量数可以精确到小数点后4位，根据对比一级碎片、二级碎片中标品、样品中相应农残的精确质量数和保留时间进行离子定性，然后再根据色谱图中的峰面积计算出样品中农残定量，实现快速定性、定量检测粮食中农残的含量。本发明改进了国标检测农残过程的繁琐，分析时间长，定量限高等缺点，并且可以实现比较难检出的有机磷和氨基甲酸酯类农残的分离。本发明进一步改进方案是，步骤1）中配制54种农药混标，倍硫磷、苯噻酰草胺、吡虫啉、吡蚜酮、苄嘧磺隆、丙环唑、残杀威、哒螨灵、稻瘟灵、丁草胺、啶虫脒、毒死蜱、多菌灵、恶虫威、二甲戊灵、二嗪农、氟环唑、甲胺磷、甲拌磷、甲基毒死蜱、甲基谷硫磷、甲基嘧啶磷、甲萘威、甲氰菊酯、甲霜灵、井冈霉素、久效磷、抗蚜威、克百威、乐果、绿麦隆、氯虫苯甲酰胺、氯氟吡氧乙酸、马拉硫磷、咪鲜胺、嘧菌酯、灭多威、噻虫嗪、噻呋酰胺、噻嗪酮、三环唑、三唑酮、杀螟硫磷、双硫磷、速灭威、特丁硫磷、五氟磺草胺、戊唑醇、烯唑醇、辛硫磷、乙硫磷、异丙隆、异丙威、仲丁威，用甲醇配制母液并用甲醇逐个稀释到100ug/kg。该54种农药为粮食种植中可能出现的农残成分，本发明将54种农药混标，可同时实现54种农药有效分离，其中农药包括比较难检出的有机磷和氨基甲酯类农药。本发明更进一步改进方案是，步骤2）中准确称取粉碎的待测样品5g入离心管中，加入10mL水和10mL乙腈，涡旋振荡2min后，降温至0℃，然后缓慢加入4g无水硫酸镁、1g氯化钠、1g柠檬酸钠和0.5g柠檬酸钠半水，5000rpm离心5min，取上层有机相1.0mL于离心管中，分别加入150mg无水硫酸镁、50mgPSA，涡旋振荡1min后，8000rpm离心5min，经有机相过滤器过滤后取0.5mL。本发明粮食样品经过粉碎后，利用水和乙腈进行萃取，简化了样品前处理过程。本发明与现有技术相比，具有以下明显优点：本发明利用Q-Exactive高分辨液质联用仪特定检测条件，通过ToxID软件中600种农残数据库的精确质量数(小数点后4位)筛选混标中和粮食中可能含有的农残，结合一级、二级碎片离子定性，再根据色谱中响应峰面积计算样品中农残浓度，实现了广泛筛选粮食中含有的农残并进行准确定性和定量。同时该方法实现了54种农药20分钟内有效分离，其中农药包括比较难检出的有机磷和氨基甲酯类农药，可以实现快速、低价、灵敏检测，满足粮食农残含量的检测要求。附图说明图1-7为54种农药混标100ug/kg的检测色谱图。图8为糯米样品的检测色谱图。具体实施方式一种快速定性定量检测粮食中农残含量的方法，包括1）54种农药混标的配制：取农药倍硫磷、苯噻酰草胺、吡虫啉、吡蚜酮、苄嘧磺隆、丙环唑、残杀威、哒螨灵、稻瘟灵、丁草胺、啶虫脒、毒死蜱、多菌灵、恶虫威、二甲戊灵、二嗪农、氟环唑、甲胺磷、甲拌磷、甲基毒死蜱、甲基谷硫磷、甲基嘧啶磷、甲萘威、甲氰菊酯、甲霜灵、井冈霉素、久效磷、抗蚜威、克百威、乐果、绿麦隆、氯虫苯甲酰胺、氯氟吡氧乙酸、马拉硫磷、咪鲜胺、嘧菌酯、灭多威、噻虫嗪、噻呋酰胺、噻嗪酮、三环唑、三唑酮、杀螟硫磷、双硫磷、速灭威、特丁硫磷、五氟磺草胺、戊唑醇、烯唑醇、辛硫磷、乙硫磷、异丙隆、异丙威、仲丁威，用甲醇配制母液并用甲醇逐个稀释到100ug/kg，按照倍数1：2：4：8：16：32：64：128稀释配制8个标线，待测；2）待测粮食样品的制备：准确称取粉碎的待测样品5g入离心管中，加入10mL水和10mL乙腈，涡旋振荡2min后，降温至0℃，然后缓慢加入4g无水硫酸镁、1g氯化钠、1g柠檬酸钠和0.5g柠檬酸钠半水，5000rpm离心5min，取上层有机相1.0mL于离心管中，分别加入150mg无水硫酸镁、50mgPSA，涡旋振荡1min后，8000rpm离心5min，经0.22μm针头式有机相过滤器过滤后取0.5mL，待测；3）步骤1）混标和步骤2）样品分别采用高分辨Q-Exactive液质联用仪按以下液相和质谱条件进行检测，液相色谱条件：色谱柱：HypersilGOLDC18色谱柱（100mm×2.1mm，3μm）；流动相：A：5mM甲酸铵水溶液+0.1%甲酸，B：甲醇；流速：0.30mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL；梯度洗脱程序：时间(time)0.00.512.016.016.120.0A%5510010055B%9595009595；质谱条件：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：Full-MS/t-MS2模式；鞘气压力：35arb；辅助气压力：10arb；毛细管电压：3.80kv（+），3.20kv（-）；毛细管温度：350℃；探针温度：300℃；分辨率：70，000；扫描范围：56-840m/z，Full-MS扫描模式；HCD碰撞能量：35eV；4）通过ToxID软件中农残数据库的精确质量数和保留时间筛选混标中和粮食样品中农残，然后对比样品与标品的Full-MS模式检测的一级碎片离子定性以及t-MS2模式检测的二级碎片离子定性，得到色谱图后采用定量软件，通过标准曲线自动计算得到测定液的样品浓度；粮食中农残含量W0按以下公式计算：，式中C0为测定液样品的浓度，单位ug/L；M为样品质量，单位g；V为加入乙腈体积，单位mL。图1-7为54种农药混标100ug/kg的Full-MS模式检测色谱图。表1为54种农药混标100ug/kg的标线和相关系数R2。表1中54种农药的标准曲线线性R2>0.999均满足要求，符合检测。为验证检测样品中回收率和精密度的准确性，实验室采用糯米加农药进行测试：糯米样品粉碎后，取糯米4份，三份加入60ug/kg、40ug/kg、20ug/kg农药，一份未加，按照前处理后检测；选取其中一个样品重复测定6次得到农残回收率与精密度，试验结果见表2。表2表2中回收率介于72～120%之间，峰面积和保留时间相对标准偏差均小于3%，满足检测要求。现对收集的大米、糯米、大麦、小麦、豌豆、玉米、红粮进行制作成样品，按本发明方法分别检测其农残含量，结果见表3：表3表3中NF表示未检出或响应低未检出图8为糯米样品的检测色谱图。当前第1页1 2 3