本发明涉及船舶携带的压载水中生物活体的检测方法，详细讲是一种操作简单、方便，检测耗时短、效率高，准确率高、结果可靠的压载水中50um以上生物活体检测方法。
背景技术：
我们知道，全球船舶每年携带的压载水约有120亿吨，压载水和压载舱的沉积物中含有大量的生物，包括细菌、藻类、原生动物、浮游生物及其他生物。全球每天存在于船舶压载水中随船舶被扩散到世界各地海域的海洋生物约有7000种。许多细菌和浮游生物经过数月的航程仍存活于压载水及其沉积物中，当船舶到港口装货时，这些生物随着压载水被排放到港口国水域。届时排放的生物可能会捕食本地物种，改变当地物种的生活环境，甚至取代而代之，减少本地生物的多样性，直至整个生态系统的破坏。同时，船舶排放的压载水中携带某些致病细菌、病毒和微藻类，可能降低海产品产量等直接经济损失，也会给人类健康带来威胁。因此，随着国际贸易和航海运输业的快速发展，压载水在国际间的装载和排放不断增多，所携带外来生物和病菌造成的卫生、环保和海洋生态问题越来越受到国际海事组织和世界各港口国的关注。根据《船舶压载水和沉积物控制和管理国际公约》D-2标准，活体生物尺寸在50um以上的生物个体浓度小于10个/m³，在10-50um范围内的生物个体浓度小于10个/ml。可见，公约标准中要求的是活体生物浓度，这就要求必须在短时间内将压载水中种类繁多的生物种类区分死活，并将生物的个数进行加和。但在现有的检测技术条件下，这是一个很大的挑战。
然而现阶段对于压载水中50um以上生物的检测方法上，缺乏规范、准确率高的方法，为此方面的科研工作造成了一定的难度。现有技术在检测50um以上浮游生物活体时，一般使用镜检目测的方法，该法通常耗时长、繁琐且主观性强、准确率低，对于检测结果很难正确检验核实。而且还有较高的成本和对使用者可能造成有毒有害的弊端，其检测效果和结果重复性也较差。因此，需要一种简便、高准确率和结果可靠的压载水中50um以上生物的检测方法。
技术实现要素：
本发明的目的是解决上述现有技术的不足，提供一种操作简单、方便，检测耗时短、效率高，准确率高、结果可靠的压载水中50um以上生物活体检测方法。
本发明解决上述现有技术的不足所采用的技术方案是：
一种压载水中50um以上生物活体检测方法，其特征在于包括如下步骤：
(1) 在船舶排放压载水时，使用网孔对角线长度不大于50um的尼龙筛网过滤Am³的压载水、将其浓缩至0.01%Am³-0.05%Am³，得浓缩液，将浓缩液装在采样瓶中；
（2）向采样瓶中滴加中性红溶液、进行生物活体染色，摇匀后静置10min；
(3)再向采样瓶中滴加乙酸钠溶液，摇匀；增加死细胞的膜通透性；
(4)向采样瓶中边滴加冰醋酸，边摇匀，直至液体颜色由黄色变为品红色；
（5）取样品进行镜检计数，可见活体生物被染成品红色，死亡生物为无色或透明，得50um以上生物活体个数。
本发明中第(1)步中所述的船舶排放压载水时，使用网孔对角线长度45-50um的尼龙筛网过滤1-10m³的压载水、将其浓缩至150-2000ml，得浓缩液；
本发明中第(2)步中所述的向采样瓶中滴加的中性红溶液优选：向采样瓶中滴加采样瓶内液体体积0.02-0.05倍的、浓度为0.5-1.2％（体积百分比）的中性红溶液、进行生物活体染色；
本发明中第(3)步中所述的向采样瓶中滴加乙酸钠溶液优选：向采样瓶中滴加采样瓶中液体体积0.03-0.05倍的、浓度为0.8-2mol/L的乙酸钠溶液。
本发明中当第(3)步完成后，如果不能及时通过镜检来检测水样中的生物，向第(3)步制得的液体内添加甲醛溶液（质量百分比）进行样品固定；可以镜检前再进行第（4）步、第（5）步。
本发明中所述的甲醛溶液为第(3)步制得的液体体积的2-5%的浓度为10-15%（质量百分比）的甲醛溶液。
本发明中所述的中性红学名“3-氨基-7-甲氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐”，是一种弱碱性 pH 指示剂，变色范围 pH6.4～8.0之间（由红变黄）。由于浮游生物细胞内含有液泡、食物泡或伸缩泡等膜泡，在中性或微碱性环境中，活细胞能大量吸收中性红并向膜泡中排泌，膜泡在一般情况下呈酸性反应，因此，进入膜泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现红色，在这种情况下，原生质一般不着色；死细胞由于原生质变性凝固，细胞液不能维持在液泡内，用中性红染色后，不产生液泡着色现象。中性红会在细胞质中形成结晶，使细胞质产生暗红色，对判断细胞颜色形成干扰，而乙酸钠能够增加死细胞的膜通透性，乙酸能够溶解中性红结晶使中性红从细胞质中透出细胞膜，减少干扰。
本发明与现有技术相比，操作方法可以极易区分50um以上生物的存活状态，减少人为观察的主观误差，检测耗时短，准确性高，且溶液配制简单，成本较低、效果明显。
具体实施方式
实施例1
一种压载水中50um以上生物活体检测方法，包括如下步骤：
(1) 在船舶排放压载水时，使用网孔对角线长度45um的尼龙筛网过滤1m³的压载水、将其浓缩至150ml，得150ml的浓缩液，1m³压载水内的50um以上生物被富集到此150ml浓缩液内，将过浓缩液装在500ml采样瓶中；
（2）向采样瓶中添加50mL的经煮沸冷却后的压载水；
（3）向采样瓶中滴加6ml、1％（体积百分比）的中性红溶液、进行生物活体染色，摇匀后静置15min；
(4)再向采样瓶中滴加8mL的1mol/L乙酸钠溶液，摇匀；
(5)向采样瓶中边滴加冰醋酸，边摇匀，直至液体颜色由黄色变为品红色；
（6）取样品进行镜检计数，可见活体生物被染成品红色，死亡生物为无色或透明，得50um以上生物活体个数。
实施例2
一种压载水中50um以上生物活体检测方法，包括如下步骤：
(1) 在船舶排放压载水时，使用网孔对角线长度50um的尼龙筛网过滤2m³的压载水、将其浓缩至350ml，得350ml的浓缩液，2m³压载水内的50um以上生物被富集到此350ml浓缩液内，将过浓缩液装在1000ml采样瓶中；
（2）向采样瓶中滴加13ml、0.8％（体积百分比）的中性红溶液、进行生物活体染色，摇匀后静置20min；
(3)再向采样瓶中滴加20mL的1.2mol/L乙酸钠溶液，摇匀；
(4)向采样瓶中边滴加冰醋酸，边摇匀，直至液体颜色由黄色变为品红色；
（5）取样品进行镜检计数，可见活体生物被染成品红色，死亡生物为无色或透明，得50um以上生物活体个数。
实施例3
一种压载水中50um以上生物活体检测方法，包括如下步骤：
(1) 在船舶排放压载水时，使用网孔对角线长度48um的尼龙筛网过滤5m³的压载水、将其浓缩至600ml，得600ml的浓缩液，5m³压载水内的50um以上生物被富集到此600ml浓缩液内，将过浓缩液装在2000ml采样瓶中；
（2）向采样瓶中滴加28ml、1.2％（体积百分比）的中性红溶液、进行生物活体染色，摇匀后静置12min；
(3)再向采样瓶中滴加30mL的2mol/L乙酸钠溶液，摇匀；
(4)向采样瓶中边滴加冰醋酸，边摇匀，直至液体颜色由黄色变为品红色；
（5）取样品进行镜检计数，可见活体生物被染成品红色，死亡生物为无色或透明，得50um以上生物活体个数。
上述实施例中，当向采样瓶中滴加乙酸钠溶液后，如果不能及时通过镜检来检测水样中的生物，向第液体内添加其体积的2-5%、质量百分比为10-15%的甲醛溶液进行样品固定；可以镜检前再进行其余步骤。
本发明中所述的中性红学名“3-氨基-7-甲氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐”，是一种弱碱性 pH 指示剂，变色范围 pH6.4～8.0之间（由红变黄）。由于浮游生物细胞内含有液泡、食物泡或伸缩泡等膜泡，在中性或微碱性环境中，活细胞能大量吸收中性红并向膜泡中排泌，膜泡在一般情况下呈酸性反应，因此，进入膜泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现红色，在这种情况下，原生质一般不着色；死细胞由于原生质变性凝固，细胞液不能维持在液泡内，用中性红染色后，不产生液泡着色现象。中性红会在细胞质中形成结晶，使细胞质产生暗红色，对判断细胞颜色形成干扰，而乙酸钠能够增加死细胞的膜通透性，乙酸能够溶解中性红结晶使中性红从细胞质中透出细胞膜，减少干扰。
本发明与现有技术相比，操作方法可以极易区分50um以上生物的存活状态，减少人为观察的主观误差，检测耗时短，准确性高，且溶液配制简单，成本较低、效果明显。