一种蛋白印记膜抗体的洗脱液及其制备方法与应用与流程

本发明涉及一种分子生物学技术领域，特别是涉及一种蛋白印记膜抗体的洗脱液及其制备方法与应用。

背景技术：

Western blot印迹法是通过特异性抗体对凝胶电泳分离的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。Western blot一抗二抗洗脱液，常用于转移了蛋白的聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)或硝酸纤维素膜(NC膜)的重复利用。在Western blot中完成了一抗二抗结合和后续的化学发光检测后，有时还需要检测其它蛋白进行比较。通过使用抗体洗脱液，充分去除一抗二抗，可以非常方便地重新利用使用过的膜检测其它蛋白。和重新跑一个SDS-PAGE胶相比，不仅省时省力，而且可以消除重新上样而带来的误差，提高结果准确性与可比性。

但是目前现有技术的抗体洗脱液含有刺激性较强的化学物质β-巯基乙醇，对粘膜、上呼吸道、皮肤和眼睛都有非常严重的损伤作用。而且现有技术的抗体洗脱液洗脱时间长，许多一抗二抗洗脱液需要增加温度或延长时间才能完全去除，洗脱效率低，并且洗脱效果不明显，对实验带来一定的误差。

技术实现要素：

发明目的：本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种成分配比科学合理，组份构成简单，成本低，安全性高，尤其是洗脱效率高，洗脱效果好的蛋白印记膜抗体的洗脱液；本发明另一个目的是提供该蛋白印记膜抗体的洗脱液的制备方法与其应用。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种蛋白印记膜抗体的洗脱液，它包括下列原料：

20～200mmol/L Tris-HCl，100～200mmol/L NaCl，体积浓度0.05～0.1％Tween-20，洗脱液pH值为12～14。

作为优选方案，以上所述的蛋白印记膜抗体的洗脱液，它包括下列原料：

20～100mmol/L Tris-HCl，100～150mmol/L NaCl，体积浓度0.05％Tween-20，洗脱液pH值为12～14。

作为优选方案，以上所述的蛋白印记膜抗体的洗脱液，它包括下列原料：

20mmol/L Tris-HCl，137mmol/L NaCl，体积浓度0.05％Tween-20，洗脱液pH值为12～14。

本发明所述的蛋白印记膜抗体的洗脱液的制备方法，其包括以下步骤：

精密称取NaCl，配置Tris-HCl缓冲液，使Tris-HCl的摩尔浓度为20～100mmol/L，NaCl的摩尔浓度为100～200mmol/L，再添加Tween-20，使其终体积浓度达到0.05％，最后用碱调整溶液的pH值为12～14。

作为优选方案，以上所述的蛋白印记膜抗体的洗脱液的制备方法，所述的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸钾等。

一种蛋白印记膜抗体洗脱液试剂盒，它包括以上所述的蛋白印记膜抗体的洗脱液。

有益效果：本发明提供的蛋白印记膜抗体的洗脱液和现有技术相比具有以下优点：

本发明所述的蛋白印记膜抗体的洗脱液，本发明通过大量实验筛选其组成和pH值，得到的洗脱液成分配比科学合理，成本低，安全性高，尤其是洗脱效率高，洗脱效果好。使用本发明的抗体洗脱液能显著减少洗膜时间，常温洗脱5分钟可以大部分去除，常温洗脱10分钟后即可完全去除一抗二抗的结合，可大大提高试验效率，且该洗脱液储存简单方便，室温储存即可，能广泛应用于PVDF膜和NC膜等。

附图说明

图1为PVDF膜中不同pH值的洗脱液对抗体的洗脱效果图。

图2为PVDF膜中不同洗脱液在不同时间下对抗体的洗脱效果图。

图3为NC膜中不同洗脱液对抗体的洗脱效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1 不同抗体洗脱液的洗脱效果比较

一、实验方法

1、验漏：在配胶之前首先加水验漏，等待至少10-20分钟，保证不漏水的情况下开始配胶。

2、配胶：下层胶配好后立即用ddH₂O液封，用以保证胶面的平齐；等20-30分钟后胶层与水层之间会产生明显的分界，即可配上层胶；上层胶配好后立即插梳子(15孔)，上层胶30分钟凝固。

3、拔梳子：梳子拔出后用水冲洗胶孔，确保孔内或边上没有残胶。

4、上样：匀速的注入样品，并保证没有有气泡的产生，以防止最后的气泡将样品冲上来，导致上样量不均一。

5、跑胶：电压调至80V，等到指示条带跑出上层胶后将电压调到110V继续电泳至样品中蓝色染料跑出玻璃板时终止电泳。

6、转膜：PVDF膜事先用甲醇激活3分钟，然后将海绵和滤纸以及PVDF膜都浸泡在转膜液里，将胶轻轻放在事先预冷的Transfer buffer里面，转膜用的夹板黑色放上，白色放下；先垫一层海绵，再垫滤纸，然后将胶放在滤纸上，PVDF膜在放在胶上；接着对称着继续放滤纸和海绵，最后把夹板夹好，黑对黑，白对红的插在转膜槽中(黑胶白膜)；将电压调至300mA，时间为120分钟；NC膜则无需甲醇激活，其它操作同PVDF膜。

7、封闭：转膜结束后将膜放置在事先配好的5％牛奶里面，放在摇床上摇封闭1小时。

8、加一抗：根据抗体的稀释比将相应的抗体加入牛奶中，用封膜带封好后放入4度冰箱过夜。

9、洗涤：次日，用事先配好的TBST室温洗涤3遍，每次10分钟。

10、加二抗：二抗的稀释比一般为1:5000～1:10,000，室温孵育2小时，

11、TBST洗涤3遍，操作同步骤9。

11、显色：使用ECL化学发光超敏显色试剂盒进行显色，数码化学发光成像系统Tanon4500SF进行曝光，曝光时间根据目的条带出现的情况再做适当的调整，至目的条带清晰为止。

12、抗体洗脱液洗膜：分别采用本发明抗体洗脱液，国产洗脱液(碧云天Western一抗二抗去除液(酸性)，货号：P0025S)和进口洗脱液(Abcam Harsh Stripping Buffer(20ml SDS10％，12.5ml Tris HCl pH 6.80.5M，0.8mlβ-巯基乙醇，66.7ml ddH₂O))，室温洗脱不同时间。

13、TBST洗涤：操作同步骤9。

14、孵育第二种抗体(一抗)：操作同步骤8。

15、洗涤：操作同步骤9。

16、加二抗：操作同步骤10。

17、洗涤：操作同步骤9。

18、显色：操作同步骤12。

19、第三次抗体洗脱液洗膜以及第三种抗体的孵育及信号检测等操作，重复操作步骤13-18。

试剂配制：

1、10x Running buffer：Tris Base(30.4g)，Glycine(144.2g)，SDS(10.0g)，加ddH₂O至1L

2、10x TBS buffer：Tris Base(24.2g)，NaCl(80g)，调节pH＝7.6，加ddH₂O至1L

3、10x Transfer buffer：Tris Base(30.275g)，Glycine(144g)，加ddH₂O至1L

4、Block buffer：脱脂牛奶5g定容至100ml 1x TBST

5、1x Running buffer：100ml的10x Running Buffer加ddH₂O至1L

6、1x Transfer Buffer：100ml的10x Transfer Buffer，200ml的甲醇加ddH₂O至1L

7、4x Lower Gel Buffer：1.5M Tris-HCl,pH 8.8,0.4％SDS

8、4x Upper Gel Buffer：0.5M Tris-Cl,pH 6.8,0.4％SDS

二、实验结果：

1、PVDF膜：

(1)不同pH比较：

如图1所示，PVDF膜封闭后首先检测第一种抗体(例如ERK1/2抗体)，经过不同pH值的洗脱液洗脱后，再孵育第二种抗体(例如GAPDH抗体)。随着pH≥13.0，第一次孵育的ERK1/2抗体信号可以彻底被清除，而不影响第二次孵育的GAPDH抗体信号的检测。以上实验结果表明，采用pH≥13.0的抗体洗脱液(组成为20mM的Tris-HCl、137mM的NaCl和0.05％Tween-20)可以高效彻底的清除抗体，取得了很好的清洗效果。明显优于酸性条件下的洗脱。

(2)不同洗膜时间比较(pH＝13.0)：

由图2的实验结果表明，比较本发明方法配制的抗体洗脱液与国产洗脱液(碧云天Western一抗二抗去除液(酸性)，货号：P0025S)和进口洗脱液(Abcam Harsh Stripping Buffer)的有效洗脱时间。使用本发明方法配制的抗体洗脱液(pH＝13.0)仅洗脱5分钟，就可以显著洗脱第一次孵育残留的ERK1/2抗体信号，洗脱10分钟则完全清除ERK1/2抗体信号。而现有技术的国产洗脱液(碧云天Western一抗二抗去除液(酸性)，货号：P0025S)和进口洗脱液(Abcam Harsh Stripping Buffer)的两种洗脱液即使洗脱延长洗脱时间至30分钟也不能将ERK1/2抗体信号清除掉。因此本发明相比现有技术的洗脱液，具有非常优异的洗脱效果。

2、NC膜：

由图3的实验结果表明：本发明方法配制的新型洗脱液(pH＝13.0，洗脱10分钟)同样适用于NC膜的抗体洗脱。洗膜后可以彻底清除第一次孵育的ERK1/2信号，而不影响第二次的GAPDH抗体信号检测。同时当将此膜再次孵育ERK1/2抗体时，仍可以检测到ERK1/2抗体，证明本新型洗脱液只特异的洗脱掉抗体，而不影响转移到膜上的蛋白抗原，相比现有技术取得了非常好的技术效果。

本发明通过大量实验筛不同浓度的原料组成，优选得到pH值为12～14的Tris-HCl 20mM、137mM的NaCl以及0.05％Tween-20洗脱液，洗脱效果和洗脱效率高，是一种优异的蛋白印记膜抗体的洗脱液。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。