专利名称：涉及α6β4整联蛋白的人胃肠上皮肿瘤抗原的抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有在人胃肠上皮肿瘤细胞中和细胞表面上以及正常人胃肠上皮细胞亚群中展示的靶结构的结合结构的抗体、或其衍生物或片段；并且涉及展示在肿瘤细胞中或表面上的靶结构、疫苗组合物、药物组合物以及与人恶性疾病相关的方法。
背景技术：
外科手术是结肠癌的主要治疗方案，根据Dukes Stage A到C的肿瘤进程状态，导致五年存活率为90％到40％。包括放疗和化疗的传统的辅助治疗已经能够进一步降低死亡率大约30％(1)。尽管有这些进步，结肠癌和直肠癌仍是人类癌症死亡的主要原因之一。已经广泛尝试了免疫治疗。然而，结肠癌通常对免疫治疗有抗性并且被认为是低免疫原性的。结肠癌病人对白细胞介素-2治疗和过继转移体外培养的肿瘤浸润淋巴细胞没有反应，而这些对免疫原性恶性疾病如黑素瘤患者有效。然而，最振奋的是，Riethmuller等报道Dukes Stage C结肠癌经原发癌切除后用针对肿瘤和正常上皮相关抗原(Ep-CAM)的裸鼠单克隆抗体(mAb)治疗，七年死亡率下降了32％(2)，表明其它免疫治疗模式也会有效。
辅助免疫治疗及更高阶段癌症的治疗的显著改进需要提供比裸mAb更有效力的效应机制。原则上，需要提高导向抗体的肿瘤选择性来提高效力。
使用从人肿瘤异种免疫得到的杂交瘤产生的鼠mAbs已经发现了目前所定义的有限数目的结肠癌相关抗原(3)。
使用大的噬菌体展示文库来鉴定新的肿瘤相关抗原预期能显著加快发现对肿瘤免疫治疗和诊断有用的靶分子的进程。可以通过在培养的肿瘤细胞和组织块上选择和筛选抗体噬菌体文库来这样鉴定靶分子以产生定义体内外表达抗原的特异试剂(4)。噬菌体展示技术已经成为产生针对各种纯化抗原的单克隆抗体试剂的有效工具，并且在几项研究中已经描述了从免疫的、原初的和合成的抗体噬菌体文库来的构建和成功的筛选结果(5)。
考虑到其普遍应用，非免疫文库是有利的，使得针对每一个单一靶标的独特文库是不必要的。在另一方面，足够大的和高质量的非免疫文库难于构建，并且，使用这些文库发现靶子的过程在基于复合抗原时需要有效的消减筛选法。
现在已经用复合人抗原免疫的近人灵长类构建了更适度容量的噬菌体文库。这代表了利用体内预选择库的方案。对异种抗原反应背景降低时应该富集对肿瘤特异性表位有特异性的该种文库(6)。进一步，与鼠相比，与人抗体有接近的序列同源性的灵长类抗体在人中应无免疫原性(7)。
现在已经鉴定了噬菌体文库来的限定选择性表达的结肠癌相关抗原的新的灵长类抗体。治疗潜力(由T细胞介导的对包被了两种与工程化超抗原融合的该抗体的培养结肠癌细胞的杀伤所证明)和与结肠癌相关抗原例如EP-CAM特异的鼠Fab片段融合的超抗原是相当的，该超抗原先前在实验系统中确定了其治疗能力。
本发明还提供了噬菌体抗体的有效的正向和消减细胞筛选法，其应能够促进将来用从大噬菌体文库来的抗体鉴定包括肿瘤相关抗原在内的新的表型特异性抗原。
发明概述本发明第一方面涉及具有在人胃肠上皮肿瘤细胞中和人胃肠上皮肿瘤细胞细胞表面上及正常人胃肠上皮细胞亚群中展示的靶结构的结合结构的抗体、或其衍生物或片段，所述结合结构含有轻链中基本地包含SEQID NO2所示氨基酸序列的第23-33(CDR1)、49-55(CDR2)、88-98(CDR3)位氨基酸的互补决定区(CDR)序列，和重链中基本地包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的第158-162(CDR1)、177-193(CDR2)和226-238(CDR3)位氨基酸的CDR序列，或者所述结合结构可以是有相似独特结合特性的其它结合结构。
在一个实施方案中，抗体是噬菌体选择的。在另一个实施方案中，所述序列起源于Macaca fascicularis。本发明的另一个实施方案是所述抗体的衍生物，该衍生物起源于人。优选地，该序列与人来源的相应序列有至少84％的同一性。优选地，抗体在人中是低免疫原性的或无免疫原性。
在另一个实施方案中，通过在基因上连接到其它多肽、和/或通过化学偶联到有机或无机化学分子和/或通过二聚化、寡聚化或多聚化来衍生该抗体。
在另一个实施方案中，所述抗体在基因上连接或化学偶联到细胞毒性多肽或细胞毒性有机或无机化学分子。
在另一个实施方案中，所述抗体在基因上连接或化学偶联到生物学活性分子。
在另一个实施方案中，所述抗体在基因上连接或化学偶联到免疫活化分子。
在另一个实施方案中，已改变所述抗体以提高或降低其抗体亲抗原性(avidity)和/或其亲和力(affinity)。
在另一个实施方案中，已改变所述抗体以提高其产率。
在另一个实施方案中，已改变所述抗体以影响其药代动力学特性。
在另一个实施方案中，已改变所述抗体以赋予其新的药代动力学特性。
在另一个实施方案中，所述抗体被标记，并且其结合被未标记形式的所述抗体抑制而不被其它结合结构抑制，而且不抑制有其它特异性的其它结合结构的结合。
另一个实施方案是抗体，其结合结构识别非还原形式的α6β4整联蛋白。
在另一方面，本发明涉及展示于肿瘤细胞中或表面上的靶结构，所述靶结构a)能被权利要求1-14之中任意一项所限定的抗体的结合结构、和有相似结合特异性的其它结合结构特异地阻断并能特异地阻断它们，b)展示于人胃肠上皮细胞中和表面上，
c)与α6和/或β4整联蛋白链或其变异体基本同源，代表共有的或独特的表位，d)在肿瘤细胞表面上高表达，并且e)是细胞毒性效应机制的靶子。
上文中“基本同源”意为与靶结构中与抗体结合有关的那些部分的同源性。
在所述靶结构的一个实施方案中，结合结构被标记并且其结合被所述结合结构的未标记形式抑制而不被其它结合结构所抑制，并且不抑制有其它结合特异性的其它结合结构的结合。
在所述靶结构的另一个实施方案中，所述结合结构含有基本地包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列第23-33、49-55、88-98、158-162、177-193和226-238位氨基酸的一个或更多个互补决定区(CDR)序列，或是有相似独特结合特性的其它结合结构。
在所述靶结构另一实施方案中所述结合结构是抗体，该抗体在另一实施方案中含有基本地包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列第1-109位氨基酸的轻链可变区，和基本地包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列第128-249位氨基酸的重链可变区。
在另一实施方案中，所述靶结构在人结肠上皮细胞中均一地表达，在胰腺管和胆管细胞中表达较低。
在另一实施方案中，所述靶结构的表达与胃肠上皮分化相关联。
在另一实施方案中，所述靶结构包含α6β4整联蛋白的氨基酸序列，其中α6部分如SEQ ID NO3所示并且β4部分如SEQ ID NO4所示。靶结构的另一个实施方案包含所述α6β4整联蛋白和/或其所述一个或更多片段和/或变异体和/或亚单位的同型的或异型的单体或同型或异型的多聚体。优选地，所述靶结构非还原形式的表观分子量为90-140kDa，最优选80-160kDa。
在另一实施方案中，靶结构含有基本地包含SEQ ID Nos5-51所示氨基酸序列之任意一个的肽或多肽，或者含有与所述多肽复合的分子。
对包含来自α6β4整联蛋白的氨基酸序列的靶结构，所述靶结构在另一实施方案中可在其非还原形式下被上述抗体包含的结合结构唯一或不唯一地识别。
在另一方面本发明涉及结合以上定义的靶结构的物质，该物质是有机化学分子或肽。在一个实施方案中，所述物质是所述靶结构的抗独特型。所述抗独特型可被对所述靶结构有相似结合特异性的结合结构特异地阻断并特异地阻断之。
在另一方面本发明涉及阻断以上定义靶结构的功能的物质，该物质是有机分子或肽。
在另一方面，本发明涉及识别以上定义靶结构、并有有机化学特性的结合结构。
在另一方面，本发明涉及包含以上定义的抗体、以上定义的靶结构或以上定义的物质作为有效成份的药物组合物。
在另一方面，本发明涉及包含以上定义的抗体、以上定义的靶结构或以上定义的物质作为有效成份的疫苗组合物。
在另一方面，本发明涉及基于抗血管扩张机制(anti-angiotenicmechanism)治疗疾病的治疗方法，其中将以上定义抗体、或以上定义靶结构或以上定义物质施用给人实施对象。
在另一方面，本发明涉及治疗人转移性疾病的方法，其中将以上定义抗体施用给实施对象人。
在另一方面，本发明涉及人恶性疾病体外组织病理诊断和预后的方法，其中将样品与以上定义的抗体和指示剂接触。
所述方法的实施方案包含肿瘤分型、肿瘤筛选、肿瘤诊断和预后以及监测恶化前疾病。
在另一方面，本发明涉及人恶性疾病体外诊断和预后的方法，其中测定体液中包含以上定义的靶结构的抗原、或以上定义的所述靶结构的抗独特型的浓度。
在另一方面，本发明涉及人恶性疾病体外诊断和预后的方法，其中测定体液中以上定义抗体的浓度。
在另一方面，本发明涉及人恶性疾病体外诊断和预后的方法，其中测定体液中a)包含以上定义的靶结构的抗原或以上定义的所述靶结构的抗独特型，和b)以上定义的抗体的复合物的浓度。
在另一方面，本发明涉及人恶性疾病体内诊断和预后的方法，其中确定实施对象人中以上定义的抗体在肿瘤沉积物(tumour deposits)的定位。优选地所述抗体在确定前施用给该实施对象。在一个实施方案中，所述抗体在肿瘤沉积物中积累。在另一实施方案中，所述方法是定量性的。
在另一方面，本发明涉及人恶性疾病的治疗方法，其中将以上定义抗体施用给实施对象人。在该方法的一个实施方案中，已通过在基因上连接到赋予联合分子改变的药代动力学特性的分子改变了所述抗体。在另一实施方案中，已通过衍生改变了所述抗体。
发明详述鉴定新的肿瘤相关抗原(TAAs)对肿瘤免疫治疗和诊断领域的进步很关键。基于流式细胞术评估和使用由连接了不同抗生素抗性标记物的特异抗体克隆组成的微小文库，在本发明中首创了利用完整细胞作为抗原来源的噬菌体抗体的正向和消减筛选(positive and substractiveselection)法。从用混合的人结肠癌免疫的灵长类动物(Macacafascicularis)构建了scFv噬菌体文库(2.7×107)。通过结合到Colo205结肠腺癌细胞、蛋白质水解洗脱和随后的噬菌体扩增进行三轮文库筛选。
用免疫组化鉴定了与结肠癌有反应的并且只与少数几种正常上皮组织有有限反应的几个抗体。一个克隆，A3 scFv，识别在所研究的11/11结肠癌和4/4胰腺癌中均一表达的表位，并且正常组织的表达局限于胃肠道上皮亚型。A3 scFv的总表观亲和力比A3 Fab高约100倍，表明scFv同型二聚体的结合。基于Fab结合计算的A3表位的细胞表面密度特别地高，接近每个细胞3,000,000个。
还证明了T细胞介导的对包被有融合了A3 scFv的低II类MHC结合超抗原突变体SEA(D227A)的结肠癌细胞的有效杀伤。因此所鉴定的A3分子是一种TAA，其特性预示了其在结肠癌和胰腺癌免疫治疗中的用途。
讨论在本发明中开发了用于从大噬菌体文库中鉴定细胞表型特异性抗体片段的有效的噬菌体筛选方案。作为范例应用的靶特异性是针对结肠癌相关抗原的。
首先使用此处提供的用于噬菌体增殖的噬菌粒构建体分析了在噬菌体群中pIII-scFv融合蛋白表面展示的频率。与以前的报道相比，获得了更高水平的C215 scFv展示。这有利于消减筛选效率，但是也提高了从文库中亲和力筛选低亲和性抗体的可能性。
清楚地证明了C215 scFv噬菌体结合到Colo205结肠腺癌细胞的特异性。使用能特异性切割噬菌体蛋白III和scFv抗体之间的靶序列的蛋白酶Genenase能够有效地洗脱结合的噬菌体并使洗脱后细胞完整。无论其结合亲和力如何，这种非化学性洗脱方法应该同样有效地洗脱噬菌体抗体，和仅通过scFv相互作用结合的噬菌体，增加了该过程的特异性。
使用该筛选方案在Colo205细胞(500000×)上三轮筛选后获得的富集与其它研究人员报道的对复合抗原的筛选相似。
证实了各种方法步骤的效果后，将此联合技术应用于使用Colo205细胞的文库筛选。
用人肿瘤免疫的近人物种构建文库。在对广泛分布的正常人组织抗原的有限异种反应性背景下，该方式产生的抗体库可能包括针对肿瘤特异性抗原的亲和力成熟抗体(6)。所鉴定的抗体识别在正常组织中有限分布的肿瘤和组织分化抗原。在初级筛选中筛选出的鉴定为结肠癌组织反应性的所有抗体在流式细胞仪上也与活的Colo205细胞反应。这种对细胞表面特异性的限制反映了筛选过程而不是文库的组成，因为用于免疫的是肿瘤组织成分混合物悬液。
在以往相似的研究中，在相同方式产生并用组织块作为抗原来源筛选出的抗黑素瘤文库中鉴定了细胞外和细胞内的特异性(4)。与流式细胞术筛选相比，在初级筛选中使用术后人结直肠肿瘤和正常结肠(在相同孔中封固)的组织切片用免疫组化法确保选出的特异性的临床相关性、提高效率和获得更高质量的信息。
根据其对不同器官上皮的反应性模式来区分，筛选出的抗体可分为四个抗体特异性组(见实施例1，表1)。在这些特异组中，A3scFv识别了大多数的肿瘤选择性抗原。在原发的和转移的结肠癌和胰腺癌样品中该A3 TAA的表达高、均一和频繁。而且，用A3 Fab融合蛋白(3百万表位/细胞)确定其细胞表面表达水平特别地高，并且允许细胞表面介导的细胞毒性效应。
所定义的频繁表达的人肿瘤抗原很少(如果有的话)是肿瘤特异性的，但是通常涉及组织分化，例如A3和Ep-CAM。然而，这些抗原在肿瘤中上调的表达提供了治疗有效剂量窗口的基础。由于有限的毛细管通透性和体内表达位点(例如暴露给循环抗体的肠上皮细胞顶面非常有限)，正常组织区室表达抗原的有效循环也许更局限。
全上皮Ep-CAM反应性17-1A mAb的临床经验支持鉴定有效无毒抗体剂量的可行性。该工作中筛选出的所有scFv克隆在上皮中的限制性表达，表明原则上能认为这些克隆是与17-1A(例如全长mAbs)相似的用于免疫治疗的侯选者。然而与Ep-CAM相比，A3 TAA的特别优势是在大多数正常上皮例如肺和肾上皮中缺乏表达，尽管在结肠中的表达是相似的。
在源于胃肠道的肿瘤亚型中的选择性表达支持正常上皮亚型的组织分布(见实施例2，表2)。
与A3表位相比，以前熟知的几个结肠癌相关抗原(CEA，CA50，CA19-9，CA242，Tag-72)(3)在正常组织中表达相同或更局限。然而，与A3和C215 Ep-CAM相反，它们在肿瘤中的表达更不均一。
使用Ep-CAM抗体已经证明了好的临床结果，包括在辅助背景下结肠癌患者的存活优势(2)。为了在甚至更高阶段的患者中诱导肿瘤应答，引入与该抗体连接的有效的效应分子将有望克服在用裸17-1A mAb治疗时所见的“正常组织抗性”。临床使用前，这能够用毒素偶联的鼠源该抗原的特异抗体或人结肠癌相关抗原的转基因动物在模式系统中进行研究。
以往，应用抗体免疫毒素成功地治疗了带有表达异源(人)肿瘤抗原(其在鼠组织中不表达)的转移性生长的肿瘤的小鼠模型(10)。然而，所用TAAs是真正肿瘤特异性，并且该模型不反映对正常组织靶向毒性的潜力。
在以前的研究中我们报道了作为免疫刺激毒素的超抗原在肿瘤免疫治疗中的潜力(8)。抗体介导的超抗原的靶向吸引大量细胞毒性的和产生细胞因子的T细胞到肿瘤部位。突变为MHC II类低结合亲和力的超抗原SEA(D227A)，被遗传连接到肿瘤靶向性抗体。该“肿瘤选择”剂用于征集肿瘤中不依赖于MHC表达的T细胞，因此解决了代表其它主动免疫治疗方法重大障碍的MHC下调和多态性的问题。
所建立的“肿瘤选择性”1F scFv噬菌体、“广泛反应的”C215噬菌体和非特异性D1.3噬菌体抗体克隆的微小文库(mini-library)是研发有效的消减细胞筛选法重要的工具。由于不展示噬菌体颗粒的频率高，该筛选原则需要在噬菌体拯救和扩增前先负选择再正选择。或者，通过选择性蛋白水解(G.Winter，pers.comm.)，可以使不展示的噬菌体成为无感染性的。该技术可允许产生“无作用文库”，例如广泛地负向预选择的文库(例如针对静息状态细胞或可转染的亲代细胞)。
总之，对每一轮筛选，能从噬菌体群中选择性地减去约100位的“不需要的”模型噬菌体特异性。将来的消减筛选法联合使用该研发方案和非免疫的大噬菌体文库以鉴定细胞表面差异表达抗原将证明该方法是否优于本研究中我们使用的策略，即使用体内预选择免疫库的正向筛选法，包括限制性和偏向性如免疫优势(4)。与A3scFv融合蛋白相比，A3 Fab结合肿瘤细胞的低亲和力和高的表位密度，表明形成了与在细胞表面聚集的表位相互作用的scFv多聚体。应该研发更高亲和力的A3 Fab单价变体或者是稳定二价构建体例如与推断的A3的低免疫原性相容的全长的A3Fv嫁接mAbs。该构建体将适于将适宜的效应分子靶向高度表达的该胃肠肿瘤相关抗原。
本发明在本说明书以下非限制性实验部分中进一步阐述。
实验部分材料与方法动物瑞典斯德哥尔摩传染病控制研究所(Swedish Institute forInfectious Desease Control(SIIDC)，Stockholm)饲养并免疫猕猴Macaque(Macaca fascicularis)。总能自由地得到食物和水。用2ml在含10％正常猕猴血清的PBS中的结肠癌组织粗悬液皮下接种四只猴子。第21、35和49天时给予加强免疫剂量。在两只接种了与明矾佐剂混合的抗原的猴子中证实了抗体反应。按照瑞典立法饲养动物并且当地道德委员会认可实验。
组织和细胞从Lund University Hospital和Malm General Hospital，Sweden得到人肿瘤和正常组织样品。人结肠细胞系Colo205、人B细胞淋巴瘤细胞系Raji和鼠B16黑素瘤细胞系获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)。以前描述了用含有Ep-CAM-1基因(C215)的表达载体pKGE839转染的鼠黑素瘤B16-C215+细胞。
人细胞培养于补充了10％热灭活胎牛血清(Gibco)和0.1mg/ml硫酸庆大霉素(Biological Industries，Kibbutz Beit Haemek，以色列)的RPMI 1640(Gibco，Middlesex，UK)培养基中。鼠细胞培养于额外补加了1mM谷氨酰按(Hyclone，Cramlington，UK)、5×10-5Mβ-巯基乙醇(ICN，Costa Mesa，CA)、0.2％ NaHCO3(Seromed Biochrome，Berlin，德国)、1×10-2M HEPES(HyClone，UT)和1×10-3M丙酮酸钠(Hyclone)的培养基中。用Gene-Probe Mycoplasma T.C.test(San Diego，CA)反复测试细胞的支原体污染。
噬菌粒载体和噬菌体文库构建从一只对应的猴子用Promega的RNA分离试剂盒(Mannheim，Germany)抽提脾脏总RNA。用PE Biosystems(Stockholm，Sweden)RNA PCR试剂盒扩增cDNA。以前报道了用于λ轻链和重链基因的cDNA合成和组装这些基因到scFv基因的引物(4)。scFv cDNA连接进噬菌粒载体(4)与M13基因III的249-406位残基融合。scFv gIII基因由phoA启动子表达并且所导致的蛋白由大肠杆菌热稳定毒素II的信号肽引导。
用有scFv基因插入的7ug文库载体重复电穿孔在最小化琼脂平板上得到2.7×107个原始转化的大肠杆菌TG-1菌落。从平板上刮下菌落并在2×YT中在以150rpm 37℃生长1小时。培养物用50倍过量M13K07辅助噬菌体(promega)超感染。加入终浓度为100mg/l氨苄青霉素、让培养物再生长1小时。加入终浓度为70mg/l的卡那霉素，培养物以250rpm在30℃生长15小时。用PEG/NaCl重复沉淀二次以从培养上清中收获噬菌体颗粒。沉淀的噬菌体溶解于含1％ BSA的PBS中。
Western印迹分析scFv-C215噬菌体颗粒的两倍比稀释系列(来自PEG沉淀/浓缩的噬菌体的未稀释原种)在含1％ SDS和2％ β巯基乙醇的12％还原性聚丙烯酰胺凝胶上分离。蛋白质通过电泳转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad，Hercules，CA)上。用5％低脂牛奶(Semper AB，Stockholm，Sweden)封闭膜。再用偶联到匙孔血蓝蛋白上针对蛋白III衍生肽序列(AEGDDPAKAAFNSLQASATEC)的兔抗血清孵育。用偶联了辣根过氧化物酶(HRP)的二级羊抗兔抗体(Bio-Rad)孵育30分钟。所有步骤间在PBS/0.5％ Tween 20中洗膜，洗3次，每次5分钟。膜在底物(AmershamPharmacia Biotech，Little Chalfon Buckingham-shire，UK)中孵育1分钟。光敏感胶片(ECL hyperfilm，Amersham)爆光到膜上并显色0.5-5分钟。
相似地，为分析纯化Fab(A3，包括猕猴CH1和Clambda区域)、scFv-和Fab(包括鼠CH1和Ckappa)-SEA(D227A)融合蛋白(按照以前描述(9)生产)的完整性，进行12％ SDS-PAGEs。用纯化的多克隆兔抗-SEA抗体孵育含转移蛋白的膜，随后是以上描述的试剂步骤。
模型和噬菌体文库在细胞上的筛选1012个在100μl PBS/1％BSA中的λ轻链文库(或者是模型噬菌体)噬菌体悬液，用3,000,000个Colo205细胞在冰上孵育1小时。细胞用2ml PBS/1％BSA洗3遍，每次洗时孵育10分钟。向细胞沉淀加入50μl的33μg/ml的Genenase洗脱噬菌体，并且孵育15分钟。Genenase，枯草芽孢杆菌素BPN-突变体，S24C/H64A/E156S/G169A/Y217L，由Dr.PoulCarter(San Francisco，CA)慷慨提供。离心后，上清转移到新管，加入250μl含1％BSA的PBS。为拯救和扩增选出的文库(和多代实验中的模型噬菌体颗粒)，使洗脱的噬菌体颗粒感染1ml大肠杆菌DH5αF-(OD600nm＝1.0)。感染的细菌培养物用补充了适当抗生素的2×YT稀释100倍，并且培养直到OD＞1.0(直到2天)。
最终，为产生可溶性scFv，大肠杆菌的琥珀抑制株HB2151用从第二轮和第三轮筛选出的文库感染。在含有氨苄青霉素的琼脂平板上生长后，在30℃在96微孔板上补充了氨苄青霉素的2×YT培养基中培养单菌落17小时。离心后，去掉上清，加入等体积的PBS/1％BSA，分析单个scFvs对人肿瘤和正常组织切片的免疫反应性。简而言之，用兔抗血清、随后用生物素标记的羊抗兔抗体(DAKO A/S，Copenhagen，Denmark)和StreptABComplex HRP(DAKO A/S)检测C-末端标签ATPAKSE(见“免疫组织化学”)。
免疫组织化学冰冻切片(8μm)在载玻片上空气干燥，-20℃丙酮固定10分钟并在含20％胎牛血清的PBS(FBS)中重新水化。内源性生物素用亲和素(1/6稀释)封闭15分钟再用生物素(1/6稀释)孵育15分钟(VectorLaboratories，Burlingame，CA)。5μg/ml亲和纯化和生物素标记的兔抗-SEA抗体孵育30分钟，随后用1/110稀释于50mM Tris pH7.6中的StreptABComplex HRP(DAKO A/S，Copenhagen，Denmark)孵育30分钟。所有步骤间，切片在TBS中洗3次。在0.5mg/ml 3，3’二氨基联苯胺四盐酸盐(Sigma)(溶解于含0.01％ H2O2的Tris pH7.6)中进行染色反应8分钟。在0.5％甲基绿中复染10分钟，载玻片在自来水下冲洗10分钟，在70-99％乙醇和二甲苯中逐渐脱水，再在DPX介质(Sigma)中封固。
流式细胞术用0.02％ w/v EDTA解离并用PBS洗Colo205结肠癌细胞。为跟踪猴子的抗体反应进程，用稀释血清、生物素标记的兔抗人IgG抗体(SouthernBiotechnology Ass.Inc.，Al，USA)、最终用抗生物素蛋白-PE(BectonDickinson，Mountain View，CA)连续4℃分别孵育细胞1小时、30分钟和30分钟。
用兔-抗-M13抗体(用M13颗粒免疫兔子产生)和FITC偶联的驴抗兔抗体(Amersham Pharmacia Biotech)分析模型噬菌体和细胞的结合。用生物素标记的兔抗SEA抗体和亲和素-PE检测融合到SEA(D227A)的抗体的结合。所有试剂稀释于PBS/1％ BSA。噬菌体颗粒结合后，用试剂孵育三次，每次10分钟，再用PBS/1％ BSA洗两次细胞。
用FACSort流式细胞仪(Becton Dickinson)进行流式细胞分析。
在培养细胞上确定亲和性按照Bolton Hunter描述用碘标记A3 scFv-SEA(D227A)、A3Fab-SEA(D227A)和1F scFv SEA(D227A)融合蛋白，每种蛋白80μg，比活性为10-15μCi/μg。Colo205细胞和Raji细胞，30,000个/样品，与两倍比系列稀释于1％ BSA中的碘标记融合蛋白(100μl/管)孵育1小时。再在PBS中洗3次，然后测定结合活性。加入的和结合的融合蛋白的浓度用于斯卡查得分析(Scatchard analysis)。减去与Raji细胞的背景结合以计算与Colo205细胞的特异结合。
细胞毒性实验用51Cr-标记的Colo205细胞作为靶细胞，人T细胞作为效应细胞在标准的4小时铬释放试验中测定超抗原融合蛋白的T细胞依赖的细胞毒性(超抗原抗体依赖的细胞的细胞毒性，SADCC)(9)。特异性裂解的百分比计算为 实施例1结合肿瘤的猕猴单克隆抗体的产生每隔一周用人结肠癌悬液免疫猕猴，Macaca fascicularis(4只)，重复四次。猴子中抗体反应的逐渐形成通过使用系列稀释的免疫前和免疫血清，流式细胞染色培养的结肠细胞Colo205来跟踪。仅仅当使用明矾沉淀的肿瘤组织悬液时引发IgG抗体反应(2个个体)。
用免疫前血清抗体有最高免疫结合水平的猴子用于构建大的大约2.7×107(由原始转化体数目估计)的联合scFv噬菌体文库。用Colo205细胞筛选灵长类噬菌体文库。经三轮连续筛选，总噬菌体产量(洗脱的/加入的噬菌体数目，计算为集落形成单位，CFU)由1.9×10-7、1.4×10-5到1.2×10-3逐渐增加。流式细胞术证明三轮筛选后从噬菌体文库产生的5％(12/246)单克隆可溶性scFvs结合人结肠癌组织块和完整的Colo205细胞。根据用1％琼脂糖凝胶电泳分析的Hinf I限制性图谱，证明所有选择的抗体分别有独特核酸序列。
用5μl细菌培养物和互补于噬菌粒载体中scFv基因的5’和3’区域的引物(在phoA启动子和M13基因III中的区域)用聚合酶链式反应扩增抗体基因。
选出的scFv逐个证明了与正常组织上皮的独特反应性根据其与正常组织的免疫组化反应模式，将结肠癌反应性scFv’s分为特异性组(表1)。详尽研究的抗体是A3scFv(和A3scFv-SEA(D227A))、A10 scFv、3D scFv和1D scFv。通过其对不同器官上皮的精细特异性和其与白细胞的结合能相互区分代表性抗体。1DscFv与肠上皮强烈反应，并且是与有多形核粒细胞形态细胞反应的唯一抗体。通过对肾小管和收集管的管腔表面染色，1D scFv能够与其它抗体区分，然而A10 scFv与这些上皮细胞均一地(非极性)反应，并且3D scFv和A3scFv为阴性反应。1D、A10和3D，而非A3scFv，也与肺中巨嗜细胞样细胞反应。
第五组抗体未广泛评估，因而不包括在表1中，其与结肠上皮和白细胞及肝中枯否细胞反应。A3scFv突出地显示与所用的正常组织组最大限制性地反应。A3最显著的正常组织反应性是正常结肠上皮的染色。在胰腺小管和肝胆管及小肠上皮的亚结构中也检测到弱染色。两个胃样品的其中一个的表面上皮被A3抗体强烈染色。
用融合蛋白A3scFv-SEA(D227A)证实了A3scFv的反应模式。该模式允许使用多克隆兔抗-SEA抗体以便免疫组化检测，其与使用针对scFvsC-末端肽标签ATPAKSE的二级抗体比较，是更为敏感的检测系统，显示低的反应背景和组织交叉反应性。表1对来自选出的结直肠癌噬菌体文库的可溶性scFv片段对正常人组织的免疫组织化学反应性ScFv克隆名称组织/亚结构 n*A3**A103D 1D食管1 0 ND ND ND/上皮组织/非上皮组织 0 ND ND ND结肠5 ++ + +++/上皮/非上皮组织 0 0 0粒细胞 ++小肠2 (+)不均一地 + +不均一地 (+)/绒毛上皮/基底腺 + + +++/非上皮组织 0 0 00Ventricle 2 0，++ 0 0，+ ++/表面上皮/腺上皮 0 +，++ 0++/非上皮组织 0 0 00胰腺1 0 (+)+++/腺泡/小管 (+) (+)+++/大管 0 (+)+++/非上皮组织 0 0 00/内分泌 0 0 00肝 2 0 ND ND ND/肝细胞/枯否氏细胞 0 ND ND ND/胆管 (+) ND ND ND肾 1 0 + 0腔表面 ++/近端小管/远端小管 0 + 0腔表面 ++/收集管 0 + 0腔表面 ++/肾小球 0 0 00/非上皮组织 0 0 00膀胱1 0 ND ND ND/上皮组织/非上皮组织 0 ND ND ND前列腺 1 0 ++ +和分泌物质++/上皮组织/非上皮组织 0 0 00肺 1 0 (+)(+) 0/支气管上皮/肺泡上皮 0 (+)(+) 0/非上皮组织 0 巨嗜细胞 + 巨嗜细胞 粒细胞 +++巨嗜细胞 +CNS 1 0 ND ND ND/灰质/白质 0 ND ND ND骨骼肌 1 0 ND ND ND
表1注解0＝阴性，(+)＝弱，+＝中等，++＝强，ND＝未测*检查的组织样品数目**已用A3 scFv(D227A)融合蛋白确证A3 scFv的反应性。
实施例2A3肿瘤相关抗原在结直肠癌和胰腺癌中均一地和频繁地表达A3 scFv-SEA(D227A)融合蛋白用于上皮来源的各种肿瘤的免疫组织化学染色(表2和图1)。该融合蛋白均一地和强烈地染色原发结肠癌组织的11/11样品和取自卵巢、淋巴结和肝中的4/4转移结肠癌样品。胰腺癌的4/4样品均呈强烈阳性。与之相反，胃的、前列腺的、乳腺的和非小细胞性肺癌的组织样品呈阴性。
表2.A3 scFv SEA(D227A)的肿瘤组织反应性肿瘤组织 n反应性结肠癌， 11 所有肿瘤细胞被强烈原发肿瘤和均一地染色结肠癌在淋巴结、肝和卵巢中的转 4同上移癌胰腺癌 4同上心室癌 2阴性前列腺癌 2阴性乳腺癌 2阴性肺癌(非小细胞) 2阴性恶性黑素瘤 2阴性实施例3A3 TAA在结肠癌细胞表面上表达很高。
来自几个确定亲和性的斯卡查德图(Scatchard plot)的结果，根据融合蛋白A3scFV-SEA(D227A)，A3 Fab和1F scFv-SEA(D227A)(1F分类为A3特异群)对Colo250细胞的结合，总结于表3。从对Colo250细胞的结合减去对不表达A3和A3 TAAs的细胞系B细胞杂交瘤Raji细胞的非特异性结合，计算出特异性结合。用线性回归计算Scatchard图中外推直线的斜率和截距。与A3 Fab(每个细胞约300万个结合位点)融合蛋白相比，A3 scFV-SEA(D227A)融合蛋白在每个细胞的饱和结合位点约少10倍，显示对scFV涉及二价(多价)结合。与A3 Fab(580-780nM)相比A3scFV融合蛋白的总亲和力(3.6-5.5nM)高100倍支持这个观点。
用1F scFv-SEA(D227A)融合蛋白进行的单一实验，证明了与A3scFv-SEA(D227A)融合蛋白相似的结合亲和力和结合位点的饱和。
表3结合到Colo205细胞的碘标记的融合蛋白的斯卡查德分析融合蛋白 n* Kd(nM) 百万位点/细胞A3 Fab-SEA(D227A) 2 580-780 3.0-3.9A3 ScFv-SEA(D227A)3 3.6-5.5 0.11-0.391F ScFv-SEA(D227A)1 4.2 0.18*进行的实验次数实施例4A3和1F scFv-SEA(D227A)介导对Colo250细胞的T细胞裂解检查和比较了两种融合蛋白A3和1F scFv-SEA(D227A)与阳性对照C215 Fab-SEA(D227A)和阴性对照D1.3 scFv-SEA(D227A)融合蛋白介导对Colo250细胞的超抗原抗体依赖性细胞毒(SADCC)的能力。A3scFv-SEA(D227A)融合蛋白滴度在这个4小时实验中达到与C215 Fab-SEA(D227A)融合蛋白相似的最大裂解平台，约50％，虽然以高10倍的浓度(图2)。与A3 scFv-SEA(D227A)相比，1F scFv-SEA(D227A)以稍高的浓度介导相似水平的细胞毒性。
阴性对照D1.3 scFv-SEA(D227A)融合蛋白不介导任何细胞毒性。
实施例5纯化结肠癌反应性抗体A3所识别的肿瘤相关抗原从异种移植肿瘤细胞系Colo250中制备肿瘤抽提物。将抽提物加样到用C215 Fab-SEAm9偶联的前置柱和用A3scFv-SEA m9偶联的柱上。在加样时将柱子串联，但在碱性条件洗脱前将柱子分离。
洗脱时通过紫外分光光度计检测到一个单峰(图3)。收集、中和并浓缩后一个A3柱来的该洗脱组分，然后在非还原条件下SDS-PAGE分折(图4)。通过银染可看到两条表观分子量大约为90-140kDa的条带(图4中标记的I和II)，将其切下并用标准的肽作图法检查。这两条带对应于Western印迹中被A3检测的条带，见实施例8。从条带I得到47条分离的胰化肽质量(序列和对应的质量见SEQ ID NO3、表4、和图5)，其完全匹配人α6整联蛋白或β4整联蛋白的MALDI-TOF(分别见SEQ ID NOs5-51和3-4，和分别见图3A和B，在图3A中下划线部分对应于图3B/SEQ ID Nos5-51所示的肽)确定的不同胰化肽质量。从条带II得到22条分离的胰化肽质量，其完全匹配β4整联蛋白不同的胰化肽质量(数据未出示)。数据显示可用A3-亲和柱特异性分离α6β4整联蛋白异型二聚体。表4源于人α6β4整联蛋白的肽/多肽和其质量
材料与方法肿瘤组织的溶解由瑞典医院提供表达A3抗原的人结肠癌组织，并且在ABR组织银行将其冻存于-70℃。冰冻的结肠癌组织用解剖刀切并转移到含有冷的等渗的蔗糖缓冲液(0.25M蔗糖，10mM KCl，1.5M MgCl2，50mM Tris-HClpH7.4在25℃)并补充了1％(v/v)Nonidet P-40(NP-40)和蛋白酶抑制剂(CompletetTM蛋白酶抑制剂鸡尾酒片，Boehringer Mannheim)的管子中。用Ultra-Turrax匀浆器匀浆组织并置于0℃溶解。溶解的制备物在11,000rpm(Hettich centrifuge Universal 30RF转子)离心，去除细胞碎片。上清进一步在108,000g 4℃离心(Beckman Ultracentrifuge Ti-60转子)，并且最终通过0.2μm Minisart plus滤膜(Sartoriuis AGGottingen Germany)过滤。
组织抗原的亲和纯化按照生产者建议偶联A3scFv-SEAm9到NHS活化的HiTrap柱(Pharmacia Biotech Uppsala Sweden)。用C215Fab-SEAm9偶联对照和前置柱，并且对照、前置柱和柱子串联安装。用预洗缓冲液(20mM Tris HClpH7.5，4℃，0.2％NP40)洗所有柱子。抽提物以0.1ml/min加载到柱子上，流穿物再循环。柱子再用起始缓冲液洗涤。结合的抗原在二乙胺的pH从7.5到11.0的pH梯度中洗脱。收集2.5ml的洗脱物并浓缩为75μl。用AKTA FPLC(Amersham Pharmacia Biotech Uppsala Sweden)系统在4℃进行纯化。洗脱的蛋白用SDS PAGE和银染分析。切下各个带，用胰蛋白酶消化并且采用Protana A/S(Odense，Denmark)的MALDI-TOF仪器确定肽质量。在SWISSPROT数据库为每一个蛋白通过计算机搜索比较所有胰化肽质量，Protana A/S(Odense Denmark)提供这种服务。
实施例6A3scFv-SEAm9检测新的α6β4整联蛋白表位人α6整联蛋白和β4整联蛋白商业化抗体与A3在正常和恶性结肠切片上比较。反应性，如图6所示，证明了A3限制于结肠上皮(图6[i])，和肿瘤中恶性细胞(图6[ii])。对α6整联蛋白的商业化抗体NKI-GoH3也对正常结肠(图6[iii])和结肠癌(图6[iv])反应。反应见于结肠的上皮细胞和恶性细胞(箭头)，也见于血管(BV)，某些基底成分和粘膜肌层(mm)。用商业化ASC-3抗-β4整联蛋白抗体观察到的反应在正常结肠(v)和结肠癌(vi)中与用抗-α6抗体观察到的相似但是较弱。
材料与方法抗体A3scFv选自M fascicularis文库。来源于此的VH和VL基因用限制性内切酶消化释放并融合到葡萄球菌内毒素AE嵌合突变体(D227A)以产生A3scFv-SEAm9。这证明了非常低水平的非特异性结合并使得可用二级抗体敏感地检测。ASC-3抗人β4整联蛋白抗体和NKI-GoH3抗人α6整联蛋白抗体来自Becton Dickinson(Copenhagen，Denmark)。
免疫组化肿瘤和正常组织样品获自Lund Hospital外科。这些样品在异戊烷中冻存，其已在液氮中预冷。样品在切片前储存于-70℃。冰冻切片后，切片空气干燥过夜，在冷丙酮中固定并用亲和素/生物素(VectorBurlingame CA)封闭。加入一级抗体到切片1小时。
二级抗体孵育30分钟，随后用链霉亲和素-生物素/HRP(DakopattsCopenhagen Denmark)再孵育30分钟。在所有步骤间用50mM Tris pH7.6，0.15M NaCl充分洗涤。二氨基联苯胺(DAB)用作色原，并且切片在0.5％甲基绿中复染。对照包括非组织反应性Fab和SEA-D227A或无一级抗体。所有抗体使用的终浓度为5μg/ml。结果表述为阴性、弱的、中等的或强的染色。
实施例7A3肿瘤相关抗原与α6和β4整联蛋白抗体在捕获ELISA中反应粗肿瘤抽提物或用A3亲和层析(见实施例5)纯化的A3抗原用捕获ELISA分析。对β4整联蛋白特异性的商业化抗体ASC-3用作捕获抗体，施加不同稀释度的粗肿瘤抽提物。这再用A3scFv-SEAm9示踪。结合的A3scFv-SEAm9再用抗SEA-HRP检测(图7A)。在图7B中商业化的抗α6整联蛋白抗体NKI-GoH3用于捕获不同稀释度的浓缩A3亲和纯化洗脱物。以图7A相似的方式捕获的抗体用A3scFv-SEAm9示踪，并用抗-SEA-HRP检测。在两个实验中，检测到浓度依赖的信号。结果证实了A3对α6β4整联蛋白异二聚体的特异性，其也显示在实施例5中从A3亲和柱特异性分离。
材料与方法商业化的抗体NKI-GoH3或ASC-3(Becton Dickinson CopenhagenDenmark)100μl用于在0.05M NaHCO3PH9.6中包被E.I.A./R.I.A.平板(Costar)的孔。允许反应4℃过夜，随后平板在DPBS+0.05％ Tween 20中洗4次。孔再用200μl在DPBS+0.05％ Tween20中的3％脱脂奶粉在室温(RT)中摇晃封闭1-2小时。按以上定义的再次冲洗孔并施加100μl稀释于含3％脱脂奶的DPBS+0.05％ Tween 20中的抗原提取物，室温摇动2小时。再次洗涤各孔(4×DPBS+0.05％ Tween 20)，之后加入100μl稀释于含3％脱脂奶粉的DPBS+0.5％ Tween 20中的一级抗体，室温摇动孵育2小时。再按以上定义的洗孔，并将100μl稀释于含3％脱脂奶的DPBS+0.05％ Tween 20中的二级抗体加到每孔中，室温摇动1小时。再次按以上定义的洗孔，加入100μl过氧化物酶底物(Sigma Fast OPDPeroxidase Substrate Tablet Set P-9187)显色。使反应在室温黑暗中继续30分钟，并摇动，然后加入50μl 3M H2SO4终止反应。在490nm读吸光度值。
实施例8A3肿瘤抗原的Western印迹分析A3亲和纯化的肿瘤抗原抽提物用SDS-PAGE分离并转移到膜上做Western印迹分析。抽提物直接用或加热到100℃5分钟或在巯基乙醇(BME)存在下加热到100℃5分钟(图8)。膜再用A3scFv-SEAm9和抗SEA-HRP或抗人α6整联蛋白或抗人β4整联蛋白抗体探测。抗β4整联蛋白抗体不与膜上的任何蛋白反应(图8[ii])。抗人α6整联蛋白与在A3亲和纯化的肿瘤抗原抽提物中表观分子量在90-140kDa的主要种类反应(图8[iii])。同样的种类也用A3scFv-SEAm9检测到，其也在加热后检测到，但在还原条件下弱得多(有BME在)(图8[i])。在90-140kDa区间检测到的主要带对应于在实施例5中的带，用肽作图分析并发现包含α6整联蛋白和β4整联蛋白。
材料与方法ASC-3抗人β4整联蛋白抗体和NKI-GoH3抗人α6整联蛋白抗体来自Becton Dickinson(Copenhagen，Denmark)。样品用SDS-PAGE在0.25Mtris-甘氨酸pH8.9和0.1％SDS在100V经过上层胶，再170V经过分离胶进行分离。所有胶上都有分子量标准(Biorad宽范围，Biorad)。分离的样品在转移缓冲液(10mM Tris碱，2M甘氨酸，40％(v/v)甲醇)中在100V1小时转移到硝酸纤维素膜(Biorad)上。膜用5％(w/v)BSA/TBS在4℃封闭至少2小时，再与稀释于5％BSA/TBS/0.2％叠氮化物的适当抗体孵育。让反应在室温持续至少2小时，随后用TBST-T充分洗膜。结合的抗体通过与稀释于含有5％奶粉的TBS-T中的HRP偶联的抗体孵育1小时来检测。膜再用增强化学发光(ECL)检测试剂(RenaissancEeNEN Life ScienceProducts，Boston MA)孵育1分钟并曝光到胶片上至1小时。
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图1A3肿瘤-相关抗原在原发肿瘤和转移肿瘤中的均一表达使用70nM A3 scFv-SEA(D227A)和C215 Fab-SEA(D227A)对冷冻和丙酮固定的人肿瘤组织切片的免疫组化染色。A3 scFv融合蛋白与从肿瘤患者切除的原发结肠癌和胰腺癌都能强烈地均一地反应。原发结肠癌对C215 Fab-SEA(D227A)的代表性染色示于(A)中，对A3 scFv-SEA(D227A)的代表性染色示于(B)中。A3 scFv-SEA(D227A)染色的结肠癌肝转移瘤和原发胰腺癌分别示于(C)和(D)中。
图2T细胞能有效地杀死A3 scFv-SEA(D227A)包被的Colo250肿瘤细胞A3 scFv-SEA(D227A)介导的对Colo250细胞的超抗原抗体依赖的细胞毒(SADCC)与抗-Ep-CAM融合蛋白C215 Fab-SEA(D227A)一样达到相同的最大细胞毒，但所用浓度高10倍。D1.3 scFv-SEA(D227A)介导的细胞毒缺乏证明在融合蛋白中需要肿瘤导向的抗体部分。
图3A3scFv-SEA m9偶联柱上肿瘤抽提物的免疫亲和层析。彻底地洗脱A3偶联柱上的结合蛋白，然后按实施例5“材料和方法”中的描述洗脱。洗脱组分用紫外分光光度计(箭头)检测并检测到一单峰。如X所示，用pH梯度洗脱样品。
图4在非还原SDS-PAGE上分离并银染A3抗原制备品。以前Western分析确定了据信A3抗原所处的分子量范围。切下该区域(标记的I和II)中的明显条带用于肽作图分析。
图5A和5B上皮整联蛋白α6β4α6完整的一级结构和β4的变体形式(前体)(Tamura等，J.Cell Biol.1111593-1604(1990))。在发表的人α6(图5A)整联蛋白和β4(前体)(图5B)整联蛋白序列中对SEQ IDNos5-51所示的对应肽加有下划线。
图6使用A3scFv和商业化的抗人α6和β4整联蛋白单克隆抗体所进行的正常和恶性化结肠的免疫组化。
图7A和7B捕获ELISA。图7A中β4整联蛋白特异的单克隆抗体ASC-3用作捕获抗体，向其施加不同稀释度的肿瘤抽提物。图7B中抗-α6整联蛋白单克隆抗体NKI-GoH3用于捕获不同稀释度的浓缩A3-亲和纯化洗脱液。然后用A3scFv-SEA m9都成功地检测到图7A和7B中的捕获的整联蛋白抗原。
图8A和8BWestern印迹分析A3-亲和层析洗脱物。使用的一级抗体是(i)和(ii)A3scFv-SEA m9，(iii)ASC-3抗-人-β4整联蛋白抗体和(iV)NKI-GoH3抗-人-α6整联蛋白抗体。道A-洗脱液直接应用，道B-洗脱液100℃加热5分钟，和道C-洗脱液在巯基乙醇存在下100℃加热5分钟。显示了分子量标准的位置。
序列表<110>Active Biotech AB<120>新化合物<130>2002163<150>SE 9903895-2<151>1999-10-28<160>51<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>747<212>DNA<213>Macaca fascicularis<221>CDS<222>(1)..(747)<223>编码序列 VL(1-109)-修饰的Huston接头(110-127)-VH(128-249)<400>1tct tct gag ctg act cag ggc cct gca ttg tct gtg gcc ttg gga cat 48Ser Ser Glu Leu Thr Gln Gly Pro Ala Leu Ser Val Ala Leu Gly His1 5 10 15aca gtc agg atg acc tgc caa gga gac agc ctc aaa acc tat tat gca 96Thr Val Arg Met Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Lys Thr Tyr Tyr Ala20 25 30agc tgg tac cag cag aag cca ggc cag gtc cct gtg ctg gtc atc tat 144Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Val Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45ggt aac aac tac cgg ccc tca ggg atc cca ggc cga ttc tct ggc tcc 192Gly Asn Asn Tyr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60tgg tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act gcg gct cag gtg gaa 240Trp Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Ala Ala Gln Val Glu65 70 75 80gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc tgg gac agc agc ggt acc cat 288Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Trp Asp Ser Ser Gly Thr His85 90 95ccg gta ttc ggc gga ggg acc cgg gtg acc gtc cta ggt caa gcc aac 336Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Thr Val Leu Gly Gln Ala Asn100 105 110ggt gaa ggc ggc tct ggt ggc ggg gga tcc gga ggc ggc ggt tct gag 384Gly Glu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu115 120 125gtg cag ttg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta aag cct ggg ggg tcc 432Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser130 135 140ctg aga ctc tct tgt gta gcc tct ggg tcc atc ttc agt agc tct gtt 480Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Ser Val145 150 155 160atg cac tgg gtc cgc cag gct cca gga aag ggt ctg gag tgg gtc tca 528Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser165 170 175gtt att agt gaa aat ggg cgt acc att aac tac gca gac tct gtg aag 576Val Ile Ser Glu Asn Gly Arg Thr Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys180 185 190ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tca ctg ttt ctg 624Gly Arg Phe Thr Ile 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5 10<210>33<211>9<212>PRT<213>人<223>SEQ ID NO3第990-998位氨基酸<400>33Leu Pro Asn Ala Gly Thr Gln Val Arg1 5<210>34<211>12<212>PRT<213>人<223>SEQ ID NO4第178-189位氨基酸<400>34Val Ser Val Pro Gln Thr Asp Met Arg Pro Glu Lys1 5 10<210>35<211>13<212>PRT<213>人<223>SEQ ID NO4第192-204位氨基酸<400>35Glu Pro Trp Pro Asn Ser Asp Pro Pro Phe Ser Phe Lys1 5 10<210>36<211>13<212>PRT<213>人<223>SEQ ID NO4第205-217位氨基酸<400>36Asn Val Ile Ser Leu Thr Glu Asp Val Asp Glu Phe Arg1 5 10<210>37<211>12<212>PRT<213>人<223>SEQ ID NO4第301-312位氨基酸<400>37Thr Gln Asp Tyr Pro Ser Val Pro Thr Leu Val Arg1 5 10<210>38<211>12<212>PRT<213>人<223>SEQ ID NO4第402-413位氨基酸<400>38Arg Gly Glu Val Gly Ile Tyr Gln Val Gln Leu Arg1 5 10<210>39<211>18<212>PRT<213>人<223>SEQ ID NO4第414-431位氨基酸<400>39Ala Leu Glu His Val Asp Gly Thr His Val Cys Gln Leu Pro Glu Asp1 5 10 15Gln Lys<210>40<211>14<212>PRT<213>人<223>SEQ ID NO4第432-445位氨基酸<400>40Gly Asn Ile His Leu Lys Pro Ser Phe Ser Asp Gly Leu Lys1 5 10<210>41<211>16<212>PRT<213>人<223>SEQ ID NO4第446-461位氨基酸<400>41Met Asp Ala Gly Ile Ile Cys Asp Val Cys Thr Cys Glu Leu Gln Lys1 5 10 15<210>42<211>15<212>PRT<213>人<223>SEQ ID NO4第531-545位氨基酸<400>42Tyr Glu Gly Gln Phe Cys Glu Tyr Asp Asn Phe Gln Cys Pro Arg1 5 10 15<210>43<211>16<212>PRT<213>人<223>SEQ ID NO4第631-646位氨基酸<400>43Ser Cys Val Gln Cys Gln Ala Trp Gly Thr Gly Glu Lys Lys Gly Arg1 5 10 15<210>44<211>28<212>PRT<213>人<223>SEQ ID NO4第675-702位氨基酸<400>44Asp Glu Asp Asp Asp Cys Thr Tyr Ser Tyr Thr Met Glu Gly Asp Gly1 5 10 15Ala Pro Gly Pro Asn Ser Thr Val Leu Val His Lys20 25<210>45<211>12<212>PRT<213>人<223>SEQ ID NO4第845-856位氨基酸<400>45Gln Glu Val Glu Glu Asn Leu Asn Glu Val Tyr Arg1 5 10<210>46<211>15<212>PRT<213>人<223>SEQ ID NO4第916-930位氨基酸<400>46Val Ala Pro Gly Tyr Tyr Thr Leu Thr Ala Asp Gln Asp Ala Arg1 5 10 15<210>47<211>13<212>PRT<213>人<223>SEQ ID NO4第946-958位氨基酸<400>47Val Pro Leu Phe Ile Arg Pro Glu Asp Asp Asp Glu Lys1 5 10<210>48<211>14<212>PRT<213>人<223>SEQ ID NO4第990-1003位氨基酸<400>48Asp Val Val Ser Phe Glu Gln Pro Glu Phe Ser Val Ser Arg1 5 10<210>49<211>12<212>PRT<213>人<223>SEQ ID NO4第1061-1072位氨基酸<400>49Leu Leu Glu Leu Gln Glu Val Asp Ser Leu Leu Arg1 5 10<210>50<211>19<212>PRT<213>人<223>SEQ ID NO4第1196-1214位氨基酸<400>50Val Cys Ala Tyr Gly Ala Gln Gly Glu Gly Pro Tyr Ser Ser Leu Val1 5 10 15Ser Cys Arg<210>51<211>9<212>PRT<213>人<223>SEQ ID NO4第1273-1281位氨基酸<400>51Val Leu Val Asp Asn Pro Lys Asn Arg1 权利要求
1.抗体、衍生物或其片段，具有展示于人胃肠上皮肿瘤细胞中和人胃肠上皮肿瘤细胞细胞表面上及正常人胃肠上皮细胞亚群中的靶结构的结合结构，所述结合结构含有轻链中基本地包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列第23-33(CDR1)、49-55(CDR2)、88-98(CDR3)位氨基酸的互补决定区(CDR)序列，和重链中基本地包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列第158-162(CDR1)、177-193(CDR2)和226-238(CDR3)位氨基酸的CDR序列，或者有相似独特结合特性的其它结合结构。
2.根据权利要求1的抗体，其是噬菌体选择的。
3.根据权利要求1的抗体，其中该序列是Macaca fascicularis来源的。
4.根据权利要求1的抗体的衍生物，其是人来源的。
5.根据权利要求1的抗体，其中该序列与相应的人来源的序列有至少84％的同一性。
6.根据权利要求1的抗体，其在人中有低免疫原性或无免疫原性。
7.根据权利要求1的抗体，其已通过基因上连接到其它多肽，和/或通过化学偶联到有机或无机化学分子，和/或通过二聚化、寡聚化或多聚化被衍生化。
8.根据权利要求1的抗体，其在基因上连接到或化学偶联到细胞毒性多肽或细胞毒性有机或无机化学分子上。
9.根据权利要求1的抗体，其在基因上连接到或化学偶联到生物学活性分子上。
10.根据权利要求1的抗体，其在基因上连接到或化学偶联到免疫活化分子上。
11.根据权利要求1的抗体，其已被改变以提高或降低其抗体亲抗原性和/或亲和力。
12.根据权利要求1的抗体，其已被改变以提高其产率。
13.根据权利要求1的抗体，其已被改变以影响其药代动力学特性。
14.根据权利要求1的抗体，其已被改变以赋予其新的药代动力学特性。
15.根据权利要求1的抗体，其被标记，并且其结合被非标记形式的所述抗体抑制而不被其它结合结构抑制，并且不抑制有其它结合特异性的其它结合结构的结合。
16.根据权利要求1的抗体，其中所述结合结构识别非还原形式的α6β4整联蛋白。
17.展示于肿瘤细胞中或表面上的靶结构，所述靶结构a)能被权利要求1-14之任意一项限定的抗体的结合结构和有相似结合特性的其它结合结构特异地阻断，并能特异地阻断之，b)展示于人胃肠上皮细胞中和表面上，c)与α6和/或β4整联蛋白链或其变异体基本同源，代表共有的或独特的表位，d)在肿瘤细胞表面上高表达，并且e)是细胞毒性效应机制的靶子。
18.根据权利要求17的靶结构，其中该结合结构被标记并且其结合被非标记形式的所述结合结构抑制而不被其它结合结构抑制，并且不抑制有其它结合特异性的其它结合结构的结合。
19.根据权利要求17的靶结构，其中所述结合结构含有基本地包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列第23-33、49-55、88-98、158-162、177-193和226-238位氨基酸的一个或更多个互补决定区(CDR)序列，或有相似独特结合特性的其它结合结构。
20.根据权利要求17的靶结构，其中所述结合结构是抗体。
21.根据权利要求20的靶结构，其中所述抗体含有基本地包含SEQ IDNO2所示氨基酸序列第1-109位氨基酸的轻链可变区，和基本地包含SEQID NO2所示氨基酸序列第128-249位氨基酸的重链可变区。
22.根据权利要求17-21之任意一项的靶结构，其在人结肠上皮细胞中均一地表达，在胰腺管和胆管细胞中表达较低。
23.根据权利要求17-22之任意一项的靶结构，其表达与胃肠上皮分化相关联。
24.根据权利要求17-23之任意一项的靶结构，其基本地包含SEQ IDNO3所示α6整联蛋白和/或SEQ ID NO4所示β4整联蛋白的氨基酸序列，和/或其一个或更多个片段，和/或变体或拼接变体，和/或亚单位。
25.根据权利要求24的靶结构，其包含所述α6β4整联蛋白和/或其所述的一个或更多个片段和/或变体和/或亚单位的同型或异型单体或同型或异型多聚体。
26.根据权利要求24的靶结构，其在非还原形式下的表观分子量为90-140kDa，最优选为80-160kDa。
27.根据权利要求24的靶结构，其含有基本地包含SEQ ID Nos5-51所示氨基酸序列之任一个的肽或多肽，或含有与所述多肽复合的分子。
28.根据权利要求24-27之任意一项的靶结构，其在还原形式被权利要求1-16之任意一项所定义的抗体包含的结合结构唯一或不唯一地识别。
29.一种物质，其与权利要求17-28之任意一项所定义的靶结构结合，该物质是有机化学分子或肽。
30.一种物质，其是权利要求17-28之任意一项所定义的所述靶结构的结合结构的抗独特型。
31.根据权利要求30的物质，该抗独特型被对所述靶结构有结合特异性的结合结构特异地阻断并特异地阻断之。
32.一种物质，其阻断权利要求17-28之任意一项所定义的靶结构功能，该物质是有机化学分子或肽。
33.一种结合结构，其识别权利要求17-28之任意一项所定义的靶结构，并且其具有机化学性质。
34.一种药物组合物，其包含权利要求1-16之任意一项中所定义的抗体作为有效成分。
35.一种药物组合物，其包含权利要求17-28之任意一项中所定义的靶结构作为有效成分。
36.一种药物组合物，其包含根据权利要求29-32之任意一项所定义的物质作为有效成分。
37.一种疫苗组合物，其包含权利要求1-16之任意一项中所定义的抗体或权利要求17-28之任意一项所定义的靶结构或权利要求29-32之任意一项所定义的物质作为有效成分。
38.一种基于抗血管扩张机制治疗疾病的治疗方法，其中将权利要求1-16之任意一项中所定义的抗体或权利要求17-28之任意一项中所定义的靶结构或权利要求29-32之任意一项中所定义的物质施用给实施对象人。
39.一种治疗人转移性疾病的方法，其中将权利要求1-16之任意一项中所定义的抗体施用给实施对象人。
40.一种人恶性疾病体外组织病理诊断和预后的方法，其中将样品与权利要求1-17之任意一项中所定义的抗体和指示剂接触。
41.根据权利要求40的方法，该方法包括肿瘤分型。
42.根据权利要求40的方法，该方法包括肿瘤筛选。
43.根据权利要求40的方法，该方法包括肿瘤诊断和预后。
44.根据权利要求40的方法，该方法包括监测恶化前疾病。
45.一种人恶性疾病体外诊断和预后的方法，其中测定体液中包含权利要求17-28之任意一项所定义的靶结构的抗原的浓度。
46.一种人恶性疾病体外诊断和预后的方法，其中测定体液中权利要求1-16之任意一项所定义的抗体的浓度。
47.一种人恶性疾病体外诊断和预后的方法，其中测定体液中a)包含权利要求17-28之任意一项所定义的靶结构的抗原或权利要求29-32之任意一项所定义的结构，和b)权利要求1-16之任意一项所定义的抗体的复合物的浓度。
48.一种人恶性疾病体内诊断和预后的方法，其中确定权利要求1-16之任意一项所定义的抗体在实施对象人体内肿瘤沉积物(tumourdeposits)中的定位。
49.根据权利要求48的方法，其中所述抗体在确定前施用给该对象。
50.根据权利要求48的方法，其中所述抗体在肿瘤沉积物中积累。
51.根据权利要求48-50之任意一项的方法，其是定量性的。
52.一种治疗人恶性疾病的方法，其中将权利要求1-16之任意一项所定义的抗体施用给实施对象人。
53.根据权利要求52的方法，其中所述抗体通过在基因上连接到这样的分子上而被改变，该分子赋予联合分子改变的药代动力学性质。
54.根据权利要求52的方法，其中所述抗体通过衍生而被改变。
全文摘要
描述了具有靶结构的结合结构的抗体、衍生物或其片段。抗体展示于人胃肠上皮肿瘤细胞中和细胞表面上以及正常人胃肠上皮细胞亚群中。所述结合结构含有轻链中SEQ ID NO:2所示氨基酸序列第23－33(CDR1)、49－55(CDR2)、88－98(CDR3)位氨基酸的互补决定区(CDR)序列,和重链中基本地包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列第158－162(CDR1)、177－193(CDR2)和226－238(CDR3)位氨基酸的CDR序列,或者有相似独特结合特性的其它结合结构。本发明还描述了展示于肿瘤细胞中或表面上的靶结构、疫苗组合物、药物组合物以及与人恶性疾病相关的方法。
文档编号A61K39/395GK1384840SQ0081488
公开日2002年12月11日 申请日期2000年10月26日 优先权日1999年10月28日
发明者T·N·布罗丁, P·J·卡尔斯特罗姆, L·G·奥尔森, M·J·特德森, P·P·奇尔尼, B·H·K·尼尔森 申请人:活跃生物技术股份公司