鉴定和设计细胞表面受体抑制剂的方法

专利名称：鉴定和设计细胞表面受体抑制剂的方法
技术领域：
本发明涉及鉴定和设计细胞表面受体抑制剂的方法，特别是整联蛋白抑制剂。
关于政府资助研究的申明本研究得到国家卫生部(NIDDK和NHLBI)授予的基金号DK48549和HL70219的资助。
背景技术：
整联蛋白是在形态形成、组织重建和修复过程中，介导重要的双向信号的粘附受体(在参考文献2中综述)。整联蛋白是由α亚基和β亚基通过非共价结合形成的异二聚体，α亚基和β亚基都是具有大细胞外片段的I型膜蛋白。在哺乳动物中，18种α亚基和8种β亚基组装成24种不同的受体。整联蛋白借助于二价阳离子结合到其细胞外的配体上。虽然这些配体在结构上是不同的，但是在整联蛋白识别过程中，它们都能够利用酸性残基。然后可以通过额外地与整联蛋白接触，确定对特定配体的特异性。整联蛋白对配体的高亲合性结合通常不是组成型的，但是在对细胞“活化”信号(所谓的由“内-外”地发送信号)反应时被激发，使整联蛋白配体有反应能力(making the integrin ligand-competent)，这些活化信号改变细胞外区域的三级和四级结构。接着，配体结合在整联蛋白中引起结构重排，导致由“外-内”地发送信号(在参考文献4中综述)。
根据是否存在约180个氨基酸的A型结构域(αA或者I结构域；参见参考文献18)，可以将整联蛋白分成两类。在含有9个βA的整联蛋白(βA-整联蛋白)中，βA是主要的配体结合位点。因此，分离的βA以二价阳离子依赖的方式直接结合生理性配体，具有与各个配体-感受态的异二聚体(ligand-component heterodimer)相同的亲合性。18处于“配体化的(liganded)”(高亲合性)和“未配体化的(unliganded)”(低亲合性)构象中的分离αA结构域的结构已经显示该结构域是如何与配体相互作用。19，30通过保守的5个氨基酸基序，即金属离子依赖的附着位点(MIDAS)，金属离子被配位在βA的配体结合界面上，金属配位是通过配体上的谷氨酸盐来实现的，在缺乏谷氨酸盐时，通过水分子来实现。19，20，29本发明人认为，在缺乏βA的整联蛋白中，配体识别是通过存在于所有整联蛋白β亚基中的αA样结构域(αA)来维持的。19α亚基也被认为参与配体识别；最近，本发明人确定了原型配体(prototypical ligand)RGD的结合位点。23发明概述本发明特征在于用于鉴定结合和调节整联蛋白的化合物的方法。通过本发明鉴定的化合物能够以在此称作为“死拴抑制”(deadbolt inhibition)的方式抑制整联蛋白。参与死栓抑制的区域包括βA结构域链-F/α7环，其与未配体化的整联蛋白(unliganded integrin)(例如，αVβ3)的β尾部结构域(βTD)的CD环接触。βA结构域和βTD之间的接触区域作为可调节的死栓，通过防止与α1螺旋的活化起始向内移动相关的链-F/α7环的移动，将βA结构域锁定在失活状态。通过βTD和杂合结构域之间的同一侧面上的其它接触，以及通过ADMIDAS阳离子的离子键，将死栓接触稳定在适当位置上，将链-F/α7环连接到βA的α1螺旋上。本发明的方法所鉴定的化合物(例如，该环的模拟物、ADMIDAS阳离子模拟物或者βTD/βA接触模拟物)起稳定CD环的作用，将整联蛋白锁定在被灭活的状态。
本发明的特征在于评价一种化合物的潜力的方法，该化合物与包含整联蛋白βA结构域的非配体结合位点的分子或分子复合物结合，该方法包括(a)采用计算方法进行化合物与未配体化的整联蛋白(例如，αVβ3)的链β-F/α7环的尾部结构域(βTD)的接触区之间的拟合操作(fitting operation)；和(b)分析拟合操作的结果，量化所述的结合潜力。在一些实施方案，化合物模拟肽与整联蛋白的βA结构域的链-F/α7环的相互作用，该肽包含氨基酸序列C663VVRFQYYE671D672S673S674G675KSILYVVEEPEC687或其片段，或者K618KFDREPYMTENTCNR633YCRD或其片段。
在另一个方面，本发明的特征在于用于鉴定整联蛋白的活性的候选的选择性调节物(selective modulator)的方法，该方法包括(a)用整联蛋白的βA结构域的原子结构模型对检测化合物建模，该化合物从空间上并且优先拟合到感兴趣的整联蛋白的βA结构域的非配体结合位点上，其中分子结构模型是用包含C663VVRFQYYE671D672S673S674G675KSILYVVEEPEC687或其片段，或者K618KFDREPYMTENTCNR633YCRD或其片段的氨基酸序列来生成；(b)在整联蛋白活化的生物分析中筛选测试化合物，特征在于将测试化合物结合到整联蛋白的βA结构域的非配体结合位点上；和(c)鉴定选择性地调节整联蛋白的活性的测试化合物，和可选择地，(d)在生物分析中，筛选所鉴定的测试化合物通过所鉴定的测试化合物结合到整联蛋白的βA结构域的非配体结合位点上阻止βA结构域与βTD结构域的相互作用的能力，和(e)从测试化合物的组中，鉴定所筛选的测试化合物为能够可选择地调节整联蛋白活性的化合物。在各种实施方案中调节包括抑制整联蛋白的活性，调节包括抑制配体结合到整联蛋白上。
在另一个方面，本发明的特征在于鉴定整联蛋白活性的候选抑制剂的方法，该方法包括(a)将定义整联蛋白的βA结构域的非配体结合位点的信息输入到合适的计算机程序中，该信息包括由表1和表2中基于坐标系的原子(coordinate atoms)定义的构象，其中该程序展示该构象的三维结构；(b)在计算机程序中建立测试化合物的三维结构；(c)将测试化合物的模型叠加到整联蛋白的βA结构域的非配体结合位点的模型上；和(c)评价测试化合物的模型是否在空间上与非配体结合位点吻合。在一个实施方案中，这些原子包括表3和表4中的那些原子。
在另一个实施方案中，本发明的特征在于鉴定候选的整联蛋白调节化合物的方法，该方法包括(a)生成非配体结合的整联蛋白的βA结构域的链-F/α7环的βTD接触区的三维结构；(b)将三维结构应用于设计或者选择候选的整联蛋白调节化合物，和(c)通过从步骤(a)和(b)中获得的数据，鉴定所述候选的整联蛋白调节化合物。在一个实施方案中，该方法还包括(d)合成整联蛋白调节化合物；和(e)通过将调节化合物与整联蛋白接触，确定整联蛋白抑制剂结合整联蛋白的能力。
在另一个实施方案中，本发明的特征在于鉴定候选的整联蛋白调节化合物的方法，该方法包括(a)表达含有βA结构域和βTD结构域的重组整联蛋白片段和(b)在筛选分析中，利用这两个结构域的蛋白质-蛋白质相互作用来鉴定βA结构域和βTD结构域相互作用的调节物。该方法还可以包括(c)合成整联蛋白调节化合物；(d)通过测量调节化合物与整联蛋白的相互作用，确定整联蛋白调节物结合整联蛋白的能力；和(e)将调节化合物作为药物设计的基础。
本发明的特征还在于一种抑制整联蛋白活化的方法，该方法包括将化合物与整联蛋白接触，从而将整联蛋白的βA结构域结构锁定为不可活化的形式。在各种实施方案中，在与整联蛋白相互作用中，该化合物模拟一种链内配体，该链内配体包含SEQ ID No1或其片段，或者SEQ ID No.2或其片段的序列；并且链内配体是抑制素家族的成员。
在另一个方面，本发明的特征在于鉴定整联蛋白调节物的方法，包括(a)用表1和表2的三维结构坐标进行合理的药物设计，筛选可能的抑制剂，其中筛选是结合计算机建模来进行的；(b)将可能的抑制剂与整联蛋白结构域接触；和(c)检测可能的抑制剂抑制整联蛋白的能力。在各种实施方案中，在步骤(c)中，采用配体结合分析来检测可能的抑制剂抑制整联蛋白的能力；在步骤(c)中，采用细胞分析来检测可能的抑制剂抑制整联蛋白的能力；而且该方法还包括(d)培育辅助晶体(supplemental crystal)，该辅助晶体包含由整联蛋白结构域与来自步骤(a)的第一种可能的抑制剂之间形成的复合物，以超过4.0A的分辨率，有效地X射线衍射复合物的原子坐标；(e)确定辅助晶体的三维结构；(f)用确定的辅助晶体的三维结构进行合理药物设计，选择第二种可能的抑制剂，其中筛选是结合计算机建模来进行的；(g)将第二种可能的抑制剂与整联蛋白的结构域接触；和(h)检测第二种可能的抑制剂抑制整联蛋白的能力。
在本发明中还有通过本发明的方法鉴定的化合物，只要该化合物不是洛伐他汀(lovastatin)，和包含这种化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明的特征还在于调节、抑制或者刺激配体或者相关蛋白质结合到整联蛋白上的方法，通过改变整联蛋白βA结构域结构(βA)与β尾部结构域(βTD)的相互作用。在一些实施方案中，整联蛋白选自如下αVβ1，αVβ3，αVβ5，αVβ6，αVβ8，α3β1，α4β1，α5β1，α6β1，α6β4，α7β1，α9β1，α4β7，gp3b3a，α1β1，α2β1，α10β1，α11β1，LFA-1，MAC-1，或者α150β95；用计算机技术或者生物化学方法或者生物物理学方法，研究βA与βTD的相互作用；βA、βTD或者两者作为计算机方法或者生物化学方法或者生物物理学方法的结构基础。
本发明的特征还在于发现药学上的相关物质的方法，这些物质包括抗体、小分子、多肽、肽和肽模拟物，它们能够扰乱或者刺激整联蛋白的βA结构域结构(βA)与β尾部结构域(βTD)的相互作用。在一些实施方案中，药学上相关的物质调节(例如，抑制)天然的整联蛋白与其配体或者辅助因子的相互作用。
定义如在此所用，“整联蛋白”和“整联蛋白受体”可以互换使用。“整联蛋白”和“整联蛋白受体”是指许多细胞表面受体蛋白的任何一种，也被称作为粘附受体，其结合到细胞外基质配体或者其它细胞粘附蛋白配体上，从而介导细胞-细胞以及细胞-基质的粘附过程。整联蛋白由属于基因超家族的基因编码，通常由含有α亚基和β亚基的异二聚跨膜糖蛋白组成。整联蛋白亚家族含有与不同α亚基结合的β亚基，形成具有不同特异性的粘附蛋白受体。整联蛋白分成两类，含有αA结构域的和不含αA结构域的。这两类都含有βA结构域。
“ 化合物”是指一种化学实体，包括肽或多肽，包括抗体、噬菌体展示抗体及其生物学活性片段，小分子(例如，化学合成的或者天然来源的)，或者合成的肽或多肽(例如非天然存在的多肽，例如类肽(peptoid)或者肽模拟物(peptidomimetic))。化合物能够结合到整联蛋白的βA结构域的非配体结合位点上。“整联蛋白的βA结构域的非配体结合位点”包括β亚基的尾部结构域β(βTD)的CD环用以结合到未结合配体的整联蛋白的β亚基的βA结构域中的链-F/α7环上的位点。如此，配体是指结合整联蛋白实现其生理功能的天然存在的配体。所述位点区别于配体结合位点。化合物包括β尾部结构域(βTD)的CD环或者CD环的片段的合成的以及天然存在的模拟物，βTD接触未结合配体的整联蛋白的βA结构域中的链-F/α7环，接触α1/链-A环或者该环的片段(其与未结合配体的整联蛋白的杂交结构域接触)，以及接触未结合配体的整联蛋白的βA结构域中的ADMIDAS配位位点(coordinate site)。“模拟物”与其所模拟的实体具有结构相似性或者具有类似的结合特性。化合物包括或者由模拟物组成。按照本发明，“化合物”优选是指如上所述的化学实体，选自a)天然存在的多肽，优选小于160kDa的天然存在的多肽，特别地小于100kDa，但是优选大于32kDa；b)合成多肽，优选小于160kDa的合成多肽，特别地小于80kDa，但是优选大于32kDa；c)小分子，优选如下描述的小分子；d)抗体，优选选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、抗体融合物等的抗体；e)抗体片段，优选d)中给出的抗体的抗体片段；和f)非肽的有机分子，优选具有大于150g/mol的分子量(formula weight)，和优选小于1500g/mol，更加优选大于250g/mol和优选小于800g/mol。
“调节”是指调节或者改变整联蛋白的活化或者配体结合。例如。一种调节物能够抑制或者促进整联蛋白的活化或者能够阻止或者促进对整联蛋白的配体结合。
“肽模拟物”是指多肽或者肽的化学变体，其中多肽或者肽的侧链实质上在受体中维持，而在至少一个肽键中，肽模拟物的化学骨架相对于多肽或者肽被改变。
“类肽”是N取代的甘氨酸的寡核苷酸。类肽可以从大量不同的N-烷基化甘氨酸中合成得到，N-烷基化甘氨酸具有与氨基酸侧链相似的侧链(例如，如Simon等人，(1992)PNAS899367-9371所描述)。可以作为制备新分子的化学多样化的文库的基序。作为天然多聚物的替代，这是可以大量合成单体的模系统。这些单体在寡聚骨架的侧链具有大量功能基团，该连接化学是高产量的并且适合于自动化。类肽中的连接对水解酶如蛋白酶具有抗性。另一个优点是该单体是非手性的。
“小分子”是具有小于32kDa的分子，例如，0.5kDa、1kDa、5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa或者32kDa。
除非另外说明，所有在此所用的科学技术术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同意义。虽然与在此所描述的那些类似或者相当的方法和材料，可以被用于实施或检测本发明，下文描述了合适的方法和材料。所有的出版物、专利申请、专利和其它在此提及的参考文献完全引入作为参考。在相互矛盾的情况下，包括定义的说明书将起决定作用。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，而不是起限制作用。
本发明的一个或多个实施方案的详细内容将在附随的附图和下文的说明书中阐述。根据说明书和附图，以及根据权利要求书，本发明的其它特征、目标和优点是显然的。
附图简介附

图1A是细胞外活性形式的αVβ3的晶体结构，具有12个结构域4个在α亚基，而8个在β亚基。附图1B是在膝节(genu)上计算伸直的αVβ3的结构(135°弯曲和120°旋转)，与整联蛋白的十分常见的水母样的早期EM图像相似。
附图2是结合到原型(prototypical)Arg-Gly-Asp(RGD)配体上的细胞外αVβ3的结构，该结构在环RGDf[N-Me]V分散到存在Mn2+23时形成的已有αVβ3晶体中后被确定。RGD序列占据螺旋样推进器(propeller)与βA结构域之间的浅裂缝(附图2A)，螺旋样推进器与βA结构域分别专一地接触Arg和Asp残基。附图2B是在配体化结构中观察到的三级和四级变化的球形和棒状的示意图。四级变化主要限制在βA，使得配体Asp通过第二个金属离子直接与βA接触。附图2C显示系统化的(schematized)较小的四级变化，在未配体化和配体化的结构在其αβ足片(leg section)(calf-1/2和βTD结构域)上叠加时，观察到这些变化在螺旋样推进器/股节界面(propeller/thigh interface)上，螺旋样推进器发生小的旋转，接着为βA和杂交结构域协作发生小旋转。此外，螺旋样推进器和βA结构域在肽结合位点上更紧密地邻近。在“邻近”结构中，一个水分子实现将金属离子(附图2D)与环2的苏氨酸和环3的天冬酰胺配位，分别与金属离子形成间接和直接的化学键。在开放的构象中(附图2E)，金属离子移动约2A，在其配位中产生微妙的变化苏氨酸直接与之接触，而天冬氨酸是通过水分子与之接触。在第6个金属配位点上，配体Glu(在附图2E以金色表示)替代水分子19，20 29；因此，αA的这一面被称作为金属离子依赖的附着位点(MIDAS)19。
附图3A是显示金属离子位置和配位改变与环1移向环22A相关的示意图。附图3B是显示在关闭和开放形式的αA中，在与金属配位中的四级变化相关的两个转换区(switch region)中，大的三级变化分别与存在于无活性和活性状态的G蛋白中的那些变化十分相似。当βA被配体化，其显示出明显的四级改变，在配体结合位点周围改变环的形状(reshape)。在数量和方向上，这些改变与由封闭转换到开放αA中所见到的那些改变类似，同样是由α1螺旋的相似运动触发(比较附图3A和3C)。附图3D是显示，当用TOP对这些结构进行重叠时，在未配体化的αA中，C末端α7螺旋相对于中心β-片层的高度和位置更加紧密地与开放α1的高度和位置匹配的示意图。
附图4显示在配体化的αVβ3上建模的α5β1-FN复合物的结构示意图，这得到在αVβ3结合肽23和FN61中，观察到RGD的晶体结构几乎相同的结果的支持。
附图5是显示在一个正好位于αA的α7螺旋后面的保守基序中，将αA连接到螺旋样推进器上的弹性14-17残基的C末端接头(C-接头)含有一个恒定的谷氨酸(CD11中的Glu320)，由于该螺旋样推进器向下运动10A，该恒定的谷氨酸可能在βA中以配体-模拟物方式，直接接触MIDAS阳离子，在αA和βA之间形成界面中心，将αA锁定在开放状态67。
附图6A是显示整联蛋白活化可以从其头部或者尾部被激发的示意图，而从尾部激发与足部和腿部的分离相关。附图6B是显示在未配体化的αVβ3中，βCD的弹性CD环与链-F/α7环(前者的Ser674与βA的Val332接触)接触的示意图，在RGD结合时，链-F/α7环是βA中发生最显著变化的区域(见附图3C)。
附图7A是显示在未结合配体的结构中，杂交结构域(hybrid domain)的D/D′环(C374LNNE；SEQ ID NO3)和D″/E(M387GLKIGD；SEQ ID NO4)环接触βCD的α1-链/A环的示意图。附图7B显示在未配体化的结构中，ADMIDAS阳离子的配位(邻近于金属离子依赖的附着位点)。
附图8是显示αMβ2整联蛋白的配体结合的图形。x轴表示在存在1mMMg2+时，逐渐升高的钙浓度，而y轴表示常规的iC3b检测配体结合的百分比。突变的膜结合整联蛋白(D141D142/A141A142)与生理性配体结合增加了1.5-2倍。在αVβ3的类似突变中，也获得了相似的结果。
附图9是αVβ3氨基酸的原子坐标(atomic coordinates)表。
附图10是αVβ3氨基酸的原子坐标表。
发明详述本发明部分地基于确定了整联蛋白的“死栓抑制”的机制，其特征在于鉴定结合整联蛋白(例如αVβ3)的化合物的方法，特别是抑制整联蛋白活化和抑制配体结合到整联蛋白上从而产生死栓抑制的化合物。附图9和10中的结构信息可以被用于鉴定整联蛋白(αVβ3)活性和配体结合的各种抑制剂。在整联蛋白(例如，αVβ3)的一个或多个体外或体内生物学分析中，用本发明的方法鉴定的优选模拟物和拮抗剂起灭活整联蛋白的作用。
本发明的方法能够鉴定具有特定结构的化合物(例如，小分子天然存在的多肽和非天然存在的肽或者多肽(例如，类肽，肽模拟物，抗体等)。该方法依赖于使用来源于x射线晶体学试验的精确的结构信息，包括整联蛋白(αVβ3)的βA结构域。这些晶体学数据可以鉴定化合物(例如，天然存在的和非天然存在的多肽、小分子等)中的原子，对于整联蛋白结合和整联蛋白调节(例如，抑制)来说，该原子是重要的。更加重要地，这些数据详细说明了重要的接触原子的三维结构排列。其它分子包括原子与那些接触原子的一些或全部具有类似三维排列的部分，可能能够结合整联蛋白并且作为整联蛋白的调节物(例如抑制剂)。该方法还可以以分离的结构域或者融合配偶体(例如，具有免疫球蛋白的Fc结构域)，利用分离的整联蛋白的βA结构，并使用基于βTD结构域与βA结构域的相互作用的抑制或刺激的常规抑制剂筛选，所述分离的整联蛋白的βA结构域是根据结构域的X射线晶体学数据或高分辩分子结构数据(例如，通过溶液NMR)，或者根据与整联蛋白αVβ3的结构同源性确定的。
一项最新的所述研究基于对溶液中的细胞外整联蛋白的负染EM(电子显微照片)图像的分析，发现Mn2+和RGD(Arg-Gly-Asp)在整联蛋白中引发整体的变化，使得整联蛋白由弯曲变为膝直形式(knee-straightened form)，而无论其腿部是否被化学束缚。24一般认为，在膝部伸直是由于杂交结构域相对于βA向外旋转，是由βA的C末端的α7螺旋下滑驱动。由于弯曲形式的细胞外或者膜结合的αVβ3(均通过基于αVβ3的原子结构导入二硫键将头部锁定在腿部产生)是无活性的，但是可以通过化学还原二硫键来激活，一般认为，这种“弹簧式”模型表明整联蛋白活化。虽然吸引人，但是这种模型不能够解释大量观察结果。第一，内-外活化十分迅速(＜1秒)并且是可逆的。弹簧式模型不能够解释该伸展的结构如何在数秒钟内折叠，特别是在细胞外基质的拥挤范围内。第二，仅仅是膝部的移动不足以伸展20成为天然无活性的αIβ3的cryoEM结构45。第三，对活性的和无活性的天然αIIbβ3的mAb表位图谱的分析表明，它们都可以是紧凑(弯曲)的形式82。第四，活化和扩张可以是分开的腿部被束缚的细胞外α5β1被解开时，会呈现出一种直的构象，但仍是无活性的。此外，由于整联蛋白的三级和四级变化是必须的，期望通过人工的二硫化物将该结构固定在其弯曲的未配体化状态，使其未配体化，并且这甚至发生在蛋白质晶格中，以使RGD配体结合(参见上文)。因此，膝部的弯曲/伸展是活化的结果，而不是活化的原因，这会引起配体结合后的事件。
在未配体化的αVβ3中，βTD的弹性CD环与链-F/α7环接触(前者的Ser674与βA中的Val332接触)(表1)(附图6B)，这是βA中在RGD结合时发生最显著变化的区域(附图3C)；在配体化结构(liganded structure)中不存在这种接触。该接触在未配体化的αVβ3中覆盖了非常小的表面积，而βTD环具有高温因子。因此，这种接触可能不会在结晶结构中产生大量稳定能量。βTD的同侧(α1-链-A环)与杂交结构域的接触面积更大(表2)。α和β亚基和/或其结构域界面在膜结合结构中发生较小重排后，βTD和βA结构域紧密邻近，产生了更实质性的接触。βTD-βA接触可以作为一种可调节或者可调控的“死栓”(deadblot)，通过防止与α1螺旋向内移动起始的活化相关的链-F/α7环的移动，将βA锁定在无活性的状态。分离整联蛋白的足部41，44，将会通过膜包埋螺旋发生活塞样的、see-saw41或者转动83的运动，引起腿部分离。这些运动能够解开βTD的“死栓”，游离βA，行使蛋白质在被配体化状态下观察到的运动，因而提供一种快速而可逆地内-外活化整联蛋白的途经。基于该原因，不要期望在活性整联蛋白中观察到广泛的接触，因为死栓在该结构中不参与。这正好是βTD的TD环具有高温因子(high temperaturefactors)的原因一定程度的活动性可能有助于其使βA结构域重新参与灭活(将死栓滑到该位置上)。在该推理的另一个支持中，洛伐他汀(lovastatin)结合到来自CD11a的αA结构域中的链-F/α7界面上，将整联蛋白锁定在无活性状态84。值得注意的是，ADMIDAS(邻近于金属离子依赖的附着位点)阳离子将活化敏感的βA的α1螺旋结合到同一结构域的链-F/α7螺旋上，该阳离子邻近于死栓位点，并且当链-F/α7环翻转时，通过未锁定的α1参与活化过程。内-外活化(inside-out activation)中的死栓的一个特别吸引人的特点在于，其可以通过两个结构域之间的直接界面，相对容易地将变化由最接近膜的βTD结构域呈递到远离膜的βA结构域。这表明了在晶体和溶液中观察到的αVβ3的弯曲构象的主要作用，并且可以解释PSI/EGF/βTD结构域以及邻近的calf-2结构域中的突变和/或活化依赖的变化的活化作用(参考16)，示例说明这可能改变βTD相对于βA的位置。
最近，在阐明未被配体化的和RGD配体化的状态下的整联蛋白的外结构域(ectodomain)的晶体结构，以及其细胞质尾“足”的NMR结构22，23，44方面取得了显著进展。该配体化的结构有助于说明阳离子依赖的配体结合特异性的基础，并且有助于开发整联蛋白与更加复杂的配体相互作用模型。未被配体化的结构与被配体化的结构之间的比较阐明了引起配体结合的三级结构变化，提供了对相关的四级结构变化的最低限度的观点。该信息产生了新的内-外活化的“死栓抑制”模型。由于失控的整联蛋白功能引起或加剧的疾病的广谱性，该结构信息给合理开发靶向这些受体的特定治疗性药物提供了丰富来源。
αVβ3结构与洛伐他汀结合位点具有惊奇的相似性。由于β3链严重折叠，在接近洛伐他汀接触CD11a处的位置上，βTD的接近的膜的环与βA结构域的远离膜的F7折叠接触。在结合RGD配体时，在βA结构域中的0.3nm的允许移动中，这种接触被破坏掉。RGD配体能够活化整联蛋白。可能这种链内接触因此解决了非αA结构域的整联蛋白的活化问题，解释了细胞内信号如何能够经由5个结构域与沿着链向23nm之外的配体结合位点传递信息。
这种机制表明，F1-F7螺旋形成的缝隙以及非αA结构域的F7褶是常用的新靶点，可以作为合理设计的药物的新分类。这些药物将会通过将βA结构域结构锁定为不可活化形式，防止整联蛋白活化。这些药物必须是完全不同的，并且通过完全不同的机制在配体结合位点上起作用，同样，由于它们是一种链内配体的模拟物，不同于对整联蛋白的α链的细胞外催化剂起作用的洛伐他汀抑制。由于A结构域作为独立的结构域被成功地结晶，可以快速地阐明来自还未表征的整联蛋白的这些结构域的结构(即，以重组蛋白生产βA结构域，确定其晶体结构)，以进行合理药物设计。
合理药物设计的起始点包括1)β3中的βTD环的氨基酸序列(C663VVRFQYYE671D672S673S674G675KSILYVVEEPEC687SEQ ID No.1，特别是中心氨基酸671-675；和K618KFDREPYMTENTCNR633YCRDSEQ ID NO.2，特别是Arg633)，2)其它相关整联蛋白β链的同源环，3)完整存在于全长的整联蛋白中或者作为含有βA结构域的链片段的βA结构域的高溶解性NMR或者X射线结晶结构，和所述链的可变片段和可以快速结晶的其它合适融合配偶体的可变片段，以及4)药物的抑制素家族的结构同源物。在高通量筛选药物候选物中，可以采用如下步骤1)基于配体结合到整联蛋白上或者重组的配体结合的整联蛋白的片段上的分析(例如玻连蛋白，纤维蛋白原或者血小板反应蛋白结合分析以及βA结构域/βTD结构域结合分析)，2)NMR信号的干扰，3)对分离的整联蛋白受体或者含有βA结构域的受体片段的干扰，或者4)通过细胞水平上的连接。
计算机建模本发明的方法采用计算机方法来鉴定具有期望结构的化合物。这些计算机方法分为两个大类数据库方法和从头进行的(de novo)设计方法。数据库方法分为两种主要类型，基于化合物(即仅仅是结合位点的配体)的方法或者基于结合位点的三维结构的方法。在前一种方法中，将感兴趣的化合物与存在于化学结构数据库中的所有化合物比较，鉴定在某种程度上结构与感兴趣的化合物类似的化合物。在后一种方法中，通过适当的计算机软件，将数据库中所有化合物放入结合位点，评价并排列它们的拟合程度。数据库中的结构是基于通过NMR或者X射线结晶学产生的试验数据建立，或者根据二维的蛋白质或者DNA序列数据建模的三维结构来建立。在从头设计方法中，结构在某种程度上与感兴趣的化合物相似的化合物的模型通过计算机程序使用来源于已知结构的信息(例如，由X射线结晶学和/或合理规则产生数据)生成。这种设计方法可以以原子-原子方式或者通过组装存储的小分子片段，建立具有期望结构的化合物。
数据库方法和从头设计方法是否能够成功地鉴定具有与感兴趣的化合物类似活性的化合物，依赖于鉴定感兴趣的化合物中的功能相关部分。对于药物来说，功能相关部分是指一种药效团。而药效团是对生物学活性来说重要的结构特性和功能基团的排列。
并非所有所鉴定的具有期望药效团的化合物都可以作为整联蛋白的调节物。真正的活性仅通过在相关的生物学分析中测定化合物的活性来最终确定。但是，本发明的方法是非常有价值的，可以被用于极大地减少需要被检测以鉴定真正的模拟物的化合物的数量。
适合从二维数据中生成预测的三维结构的程序包括Concord(TriposAssociated，St.Louis，MO)，3-D Builder(Chemical Design Ltd.，Oxford，U.K.)，Catalyst(Bio-CAD Corp.，Mountain View，CA)，Daylight(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)。
适合搜索三维数据库来鉴定具有期望药效团的分子的程序包括MACCS-3D and ISIS/3D(Molecular Design Ltd.，San Leandro，CA)，ChemDBS-3D(Chemical Design Ltd.，Oxford，U.K.)，Sybyl/3DB Unity(TriposAssociates，St.Louis，MO)。适合药效团选择和设计的程序包括DISCO(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)，Catalyst(Bio-CAD Corp.，MountainView，CA)以及ChemDBS-3D(Chemical Design Ltd.，Oxford，U.K.)。
化学结构的数据库可以从Cambridge Crystallographic Data Centre(Cambridge，U.K.)以及Chemical Abstracts Service(Columbus，OH)获得。
从头设计程序包括Ludi(Biosym Technologies Inc.，San Diego，CA)以及Aladdin(Daylight Chemical Information Systems，Irvine CA)，LEGEND(Nishibata，Y.，Itai，A.，Tetrahedron，47，8985(1991))(MolecularSimultations，Burlington，MA)和LeapFrog(可从Tripos associates，St.Louis，MO获得)。
在确定整联蛋白的三维结构时，可以单独或者组合使用多种方法中的任何一种，评价可能的调节物。这种评价可以基于在此描述的晶体的X射线坐标，在计算机屏幕上视察整联蛋白上的结合位点的三维结构示意图。可以使用本领域技术人员知晓的计算机建模技术、硬件和软件，实现评价或者建模。这还包括模型建立、模型对接(model docking)或者使用软件对蛋白质-配体相互作用的其它分析，使用的软件包括，例如QSC，GOLD(Jones等人，J.Mol.Biol.，245，43-53，1995)，FlexX(Lengauer，Rarey，1996)，Autodock(Morris等人，1998)，GLIDE，Modeler，或者Sybyl，接着用标准的分子力学力场进行能量最小化和分子动力学，包括，例如CHARMM和AMBER。未配体化的整联蛋白的三维结构信息(例如，βTD结构域的CD环与未配体化的整联蛋白中的βA结构域的链-F/α7环接触)也可以与计算机建模结合利用，生成其它未配体化的整联蛋白的计算机模型。还可以用常规方法和本领域的熟练人员熟知的技术，包括在此描述的软件包，建立未配体化的整联蛋白的结构域的计算机模型。
一旦确定包含未被配体化的整联蛋白的晶体的三维结构，或者通过NMR测定的溶液结构，通过采用对接(docking)程序，例如QSC、GOLD、FlexX或Autodock的计算机建模方法，鉴定可能的非配体位点结合物(例如模拟βA的链-F/α7环的βTD结合的结合物)，确定可能的配体的形状和化学结构与结合位点相互作用的效果如何。还可以用计算机程序估计两个结合配偶体(即，非配体结合位点与调节结合物)之间的吸引、排斥和空间位阻。通常，可能配体与变构结合位点之间较为紧密地拟合、较低的位阻以及较大的吸引力与它们之间较高的结合常数是一致的。此外，在可能的药物设计中，特异性越高，该药物与其它蛋白质相互作用的可能性越低。这可以使由于与其它蛋白质之间的不期望的相互作用产生的潜在副作用最小化。
本领域技术人员可以获得各种方法，来评价和实际上筛选适合与一种蛋白质，特别是整联蛋白相结合的分子或化学片段。这种结合可以是各种形式的，包括，例如空间相互作用、范德华力相互作用、静电相互作用、溶剂化相互作用、电荷相互作用、共价结合相互作用、非共价结合相互作用(例如氢键相互作用)、熵或焓有利的相互作用等。
众多计算机程序是可获得的，并且适合于合理药物设计，以及在此描述的方法中，对可能的调节化合物进行计算机建模、模型建立和计算化鉴定、筛选和评价处理。这些计算机程序包括，例如QSC(WO 01/98457)、FlexX、Autodock、Glide、Accelrys′Discovery Studio或Sybyl。使用软件包如QSC(WO01/98457)、Accelrys′Discovery Studio、Sybyl、ISIS、ChemDraw或Daylight，计算机“从头”设计可能的抑制剂。化合物的变形能和静电排斥可以用程序例如GAUSSIAN92、AMBER、QUANTA/CHARMM、ANDINSIGHT II/DISCOVER来评估。
有大量方法来选择填充各个结合口袋的成分。这些方法包括QUANTA[Molecular Simulations，Inc.，Burlington，Mass.，1992]、SYBYL[MolecularModeling Software，Tripos Associates，Inc.，St.Louis，Mo.，1992]、AMBER[S.J.Weiner，P.A.Kollman，D.A.Case，U.C.Singh，C.Ghio，G.Alagona和P.Weiner，J.Am.Chem.Soc.，106，765-784(1984)]或者CHARMM[B.R.Brooks，R.E.Bruccoleri，B.D.Olafson，D.J.States，S Swaminathan和M.Karplus，J.Comp.Chem.4，187-217(1983)]。在这种模拟步骤之后，用标准的分子力学力场(molecular mechanics forcefields)如CHARMM和AMBER来使能量最小化。此外，还有许多更加专业的计算机程序来在选择本发明的结合成分的过程中起辅助作用。这些程序包括1.)GRID(Goodford，P.J.A Computational Procedure for DeterminingEnergetically Favorable Binding Sites on Biologically ImportantMacromolecules.J.Med.Chem.，28，849-857(1985))。GRID可以从OxfordUniversity，Oxford，UK获得。
2.)MCSS(Miranker，A.；Karplus，M.Functionality Maps of Binding SitesA Multiple Copy Simultaneous Search Method.ProteinsStructure，Function andGenetics，11，29-34(1991))。MCSS可以从Molecular Simulations，Burlington，Mass获得。
3.)AUTODOCK(Goodsell，D.S.；Olsen，A.J.Automated Docking ofSubstrates to Proteins by Simmulated Annealing.PROTEINSStructure，Function and Genetics，8，195-202(1990))。AUTODOCK从Scripps ResearchInstitute，La Jolla，Calif获得。
4.)DOCK(Kuntz，I.D.；Blaney，J.M.；Oatley，S.J.；Langridge，R.；Ferrin，T.E.A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions.J.Mol.Biol.，161，269-288(1982))。DOCK从University of California，San Francisco，Calif获得。
5.)GOLD(Jones等人，J.Mol.Biol.，245，43-53，1995)。GOLD从Cambridge Crystallography Data Centre，Camdridge，UK获得。
6.)FlexX(T.Lengauer和M.Rarey，Computational Methods forBiomolecular Docking，Current Opinion in Structural Biology，6，402-406，1996)。FlexX从Tripos Associated，St.Louis，MO获得。
这些计算机评价与建模技术可以用任何合适的硬件来实施，包括例如，可以从Silicon Graphics、Sun Microsystems等处获得的工作台。这些技术、方法、硬件和软件包是示例性的，不是作为广泛的列举。本领域知晓的其它建模技术也可以被用于本发明。参见，例如QSC(WO01/98457)、FlexX、Autodock、Glide、Accelrys′Discovery Studio或者Sybyl以及在各个互联网上确定的软件(例如，netsci.org/Resources/Software/Modeling/CADD/ch.cam.ac.uk/SGTL/software.htmlcmm.info.nih.gov/modeling/universal_software.htmldasher.wustl.edu/tinker/zeus.polsl.gliwice.pl/～nikodem//linux4chemistry.htmlnyu.edu/pages/matbmol/software.html
msi.umn.edu/usersupport/software/MolecularModeling.htmlus.expasy.org/sisweb.com/software/model.htm)。
用三维结构(或者结构)进行合理药物设计，选择可能的整联蛋白调节物，该三维结构是为在此描述的βA结构域上βTD所接触的位点而确定的，结合或者仅通过计算机建模和上述方法。然后，可能的调节物可以购买得到或者用标准的合成技术和本领域知晓的方法学由容易获得的起始原料合成。然后，分析该可能的抑制剂，确定其调节靶点(例如，整联蛋白，例如αVβ3)和/或整联蛋白路径的能力。
还可以通过筛选化合物文库(例如，组合文库，例如质量编码(mass-coded)的组合文库)来选择可能的抑制剂。可以通过亲合筛选对化合物文库进行筛选，选择在新的非配体结合位点上与特定整联蛋白具有最大亲和力的成员。
一旦选择了合适的结合成分，可以将它们组装成单一的调节结合物。可以将各种成分连接到中心骨架上来实现这种组装。例如，可以通过视觉观察，接着进行手工建模，再使用软件如Quanta或者Sybyl，来进行该组装过程。大量其它程序也可以被用于辅助选择连接各种成分的方式。这些程序包括CAVEAT(Bartlett，P.A.；Shea，G.T.；Telfer，S.J.；Waterman，S.CAVEATA Program to Facilitate the Structure-Derived Design of BiologicallyActive Molecules.In″Molecular Recognition in Chemical and BiologicalProblems，″Special Pub.，Royal Chem.Soc.，78，182-196(1989))(可从Universityof Califomia，Berkeley，CA获得)、3D数据库系统例如MACCS-3D(MDLInformation Systems，San Leandro，CA(综述见Martin(Martin，Y.C.3DDatabase Searching in Drug Design.J.Med.Chem.，35，2145-2154(1992)))以及HOOK(可从Molecular Simulations，Burlington，MA获得)。
大量通常用于建立药物模型的技术也可以被使用(综述见Cohen，N.C.；Blaney，J.M.；Humblet，C.；Gund，P.；Barry，D.C.，″Molecular Modeling Softwareand Methods for Medicinal Chemistry″，J.Med.Chem.，33，883-894(1990))。同样，在用于特定药物设计方案的技术的化学文献中还有许多例子(综述参见Navia，M.A.和Murcko，M.A.，″The Use of Structural Information in DrugDesign″，Current Opinions in Structural Biology，2，202-210(1992))。这种特定应用的部分例子包括Baldwin，J.J.等人，″Thienothiopyran-2-sulfonamidesNovel Topically Active Carbonic Anhydrase Inhibitors for the Treatment ofGlaucoma″，J.Med.Chem.，32，2510-2513(1989)；Appelt，K.等人，″Design ofEnzyme Inhibitors Using IteratiVe Protein Crystallographic Analysis″，J.Med.Chem.，34，1925-1934(1991)；以及Ealick，S.E.等人，″Application ofCrystallographic and Modeling Methods in the Design of Purine NucleotidePhosphorylase Inhibitors″Proc.Nat.Acad.Sci USA，88，11540-11544(1991)。
多种常规技术也可以被用于各个上述的评价以及在筛选整联蛋白的调节(例如抑制)中的候选化合物中所需的评价。通常，这些技术包括特定成分的位置和结合邻近性，结合调节物(例如抑制剂)所占据的空间，特定化合物的结合的变形能以及电相互作用能量。可用于上述评价的常规技术的例子包括量子力学、分子力学、分子动力学、Monte Carlo采样、系统研究和距离几何方法(G.R.Marshall，Ann.Ref.Pharmacol.Toxicol.，27，193(1987))。已经开发出用于实现这些方法的特定计算机软件。被设计用于这种用途的程序的例子包括Gaussian92，修订版本E.2(M.J.Frisch，Gaussian，Inc.，Pittsburgh，PA1993)；AMBER，版本4.0(P.A.Kollman，University ofCalifornia at San Francisco，1993)；QUANTA/CHARMM[MolecularSimulations，Inc.，Burlington，Mass.1992]；and Insight II/Discover(BiosysmTechnologies Inc.，San Diego，Calif.1992)。可以用例如Silicon GraphicsIndigo2工作台或者IBM RISC/6000工作台型号550来执行这些程序。其它硬件和软件包是本领域技术人员知晓的，并且是可以应用的。
常规筛选本发明表明，除了计算机技术外，βTD与βA结构域结合相互作用可以被用于常规的药物文库筛选中，直接鉴定能够调节这两个结构域之间的相互作用的化合物。
这些分析可能基于结合与相互作用分析，其中一个配偶体被标记(例如，用生物素或者荧光标记)，而另一个配偶体被固定(例如，固定在96孔的ELISA平板上)。对化合物文库进行筛选，对化合物增强或者阻断固定的配偶体与添加的生物素化配偶体或者荧光配偶体之间的相互作用的能力进行筛选。通过抗生物素抗体或者与下文用于αVβ3-玻连蛋白结合分析中详细描述的方法类似的荧光光谱测定法，测量结合相互作用。许多其它标记技术可用于这种方法中(例如放射性标记、邻近分析)。
可替代地，在酵母的双-杂交系统中，用βA结构域(或者含有该结构域的更大的蛋白质片段)作为诱饵(bait)，用βTD结构域(或者含有该结构域的更大的蛋白质片段)作为捕获器(prey)，能够产生结构域之间的相互作用。检测化合物文库干扰Gal4启动子下的合适的标记基因的转录的能力。
化合物合成用于合成在此描述的调节化合物的合成化学转化和保护基方法(保护与去保护)是本领域已知的，包括例如，在R.Larock，Comprehensive OrganicTransformations，VCH Publishers(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，2nd ed.，John Wiley and Sons(1991)；L.Fieser和M.Fieser，Fieser and Fieser′s Reagents for Organic Synthesis，JohnWiley and Sons(1994)以及L.Paquette，编辑，Encyclopedia of Reagents forOrganic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)，以及它们的后续版本中描述的那些方法。
在此描述的调节化合物可以含有一个或多个不对称中心，从而形成消旋体和外消旋混合物、单一的对映异构体、单独的非对映异构体以及非对映异构体混合物。这些化合物所有同分异构体形式都清楚地包括在本发明中。在此描述的调节性化合物还可以表现为多种互变异构体形式，它们都被包括在本发明中。调节化合物还可以顺式或反式或者E-或Z-双键同分异构体形式出现。所有这些同分异构形式的这种调节化合物都清楚地包括在本发明中。
保守氨基酸取代多肽模拟化合物具有与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的多肽不同的氨基酸含量，并且作为有用的模拟物。取代突变体包括作为保守或者非保守改变的氨基酸残基(或者，其中一个以上氨基酸被改变，可能是两个)。“保守”取代是一个氨基酸残基被另一个具有类似侧链的氨基酸替代的取代。在本领域中，已经定义了包括具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱基侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有无电荷极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。本发明包括包含一个、两个、三个、五个或者更多个保守氨基酸取代的多肽，其中生成的突变多肽结合整联蛋白βA结构域的非配体结合位点(例如，未配体化的αVβ3的βA结构域中的链-F/α7环)。
可以通过本领域熟知的突变技术来制备片段或者其它突变核酸，包括那些被用于多核苷酸、细胞或者生物体的突变技术(例如，通过饱和突变，在编码SEQ ID No.1的多肽的核酸的整体或者部分上随机引入突变)，对生成的蛋白质抑制整联蛋白活化的能力进行筛选，如下面一个或多个的分析中所示。
整联蛋白抑制分析通过在下文详细描述的或者在美国专利6,489,333纯化αVβ3(人胎盘)中进一步描述的如下分析，如玻连蛋白ELISA、αVβ3-玻连蛋白结合分析、人大动脉平滑肌细胞迁移分析、体内血管生成模型、猪再狭窄模型、小鼠视网膜病模型中的一种或多种进行检测，可以评价鉴定化合物的方法的效用和本发明的化合物的效用。假设这些分析是为了适合感兴趣的整联蛋白而进行的，并且如下不是限定，而仅仅是作为实施例。如果在αVβ3-玻连蛋白结合分析的抑制中，通过本发明鉴定的化合物具有小于约10μM的IC50或Ki值，则被认为是有活性的，化合物优选具有小于约1μM的Ki值。在αVβ3-玻连蛋白结合分析以及在αVβ3受体介导的整联蛋白附着细胞分析中，本发明的被检测化合物是有活性的。通常，可以挑选更加适用于感兴趣的特定整联蛋白的分析。例如，使用适当的配体(例如，含有RGD的配体，例如纤维蛋白原、玻连蛋白、纤连蛋白、血小板反应蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、VCAM-1、ICAM-1、ICAM-2、因子X、骨桥蛋白、骨涎蛋白或者vWF)，使用适当的细胞类型，和使用适当的条件，这都是本领域技术人员容易获知的知识。下面的分析可用于检测αVβ3的抑制或调节，也可以直接用于其它整联蛋白的检测，或者被最低限度地修改以适当用于其它整联蛋白。
纯化的αVβ3(人胎盘)-玻连蛋白ELISA可以从人胎盘提取物中分离αVβ3受体，用辛基葡萄糖甙制备人胎盘提取物。该提取物经过亲合层析柱，柱中装有加到Affigel上的抗αVβ3单克隆抗体(LM609)。随后，在pH7和pH4.5的大范围内洗涤该柱，接着在pH3洗脱。通过麦胚凝集素(wheat germ agglutinin)层析浓缩生成的样本，并且通过SDS凝胶上存在两个条带来鉴定，和通过western印迹被确定为αVβ3。还可以用所述的杆状病毒表达以可溶的重组形式来制备该受体。
可以在不同水平上稀释亲合纯化的蛋白质，并且装到96孔平板上。可以用固定浓度的生物素化玻连蛋白(约80nM/孔)进行ELISA。通过凝胶(αVβ3)以及通过在ELISA中检测阻断αVβ3或αVβ5抗体的作用，确认该受体制备物中含有αVβ3，而无可检测含量的αVβ5。
根据固定浓度受体与不同浓度的生物素化玻连蛋白的浓度反应曲线，可以选择接近生物素化玻连蛋白的最大浓度的浓度。
αVβ3-玻连蛋白结合分析可以如先前所描述，测量整联蛋白-配体结合相互作用21。用包被缓冲液(20mM Tris HCl，150mM NaCl，1.0mM CaCl2，1.0mMMgCl26H2O，10.0M MnCl2.4H2O)稀释纯化的受体，并覆盖(100μL/孔)到Costar(3590)大容量结合平板上，4℃过夜。弃去包被溶液，用封闭/结合缓冲液(B/B缓冲液，50mM Tris HCl，100mM NaCl，1.0mM CaCl2，1.0mMMgCl26H2O，10.0MMnCl2.4H2O)洗涤平板一次。然后在室温，用溶于B/B缓冲液的3.5％BSA(200μL/孔)封闭受体2小时。用溶于B/B缓冲液的1.0％BSA洗涤一次，每个孔中加入生物素化的玻连蛋白(100μL)以及抑制剂r(11μL)或者B/B缓冲液w/1.0％BSA(11μL)。在室温温育平板2小时。用B/B缓冲液洗涤平板两次，并且在室温，用溶于含有1.0％BSA的B/B缓冲液中的抗生物素碱性磷酸酶(100μL/孔)温育1小时。用B/B缓冲液洗涤平板两次，加入碱性磷酸酶底物(100μL)。在室温显色。加入2N NaOH(25μL/孔)以阻断显色，在405nm读取吸收值。IC50是阻断50％玻连蛋白结合到受体上所需的检测底物的浓度。在αVβ3-玻连蛋白结合分析中，如果化合物具有小于或者等于约10μM的IC50值时，该化合物被认为是有活性的。具有小于100nM的抑制玻连蛋白的IC50值的化合物是期望的。采用上述方法，可以发现大量的本发明的化合物具有小于或者等于约10μM的IC50值，从而确认本发明的化合物可以用作有效的αVβ3整联蛋白抑制剂。
βTD-βA结构域结合分析将作为Fc-融合蛋白的纯化βTD固定，如上用于整联蛋白αVβ3-玻连蛋白结合相互作用所述，测量βTD与生物素化的βA结构域的相互作用。IC50是阻断50％βTD结合到受体上所需的检测底物的浓度。在βTD-βA结构域结合分析中，如果化合物具有小于或者等于约10μM的IC50值时，该化合物被认为是有活性的。具有小于100nM的抑制βTD-βA相互作用的IC50值的化合物是期望的。
整联蛋白细胞粘附分析在该粘附分析中，用被检测的整联蛋白的适当配体(例如纤维蛋白原、玻连蛋白、纤连蛋白、血小板反应蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、VCAM-1、ICAM-1、ICAM-2、因子X、骨桥蛋白、骨涎蛋白或者vWF)包被96孔平板，在4℃温育过夜。第二天，收集细胞，洗涤，加入荧光染料。一同加入化合物和细胞，然后立即加到包被的平板中。温育后，从平板上去除松散的细胞，然后平板(具有附着细胞)在荧光计中计数。检测化合物抑制50％细胞附着的能力表示为IC50值，表示对整联蛋白介导的结合的抑制能力的测定值。用特异于感兴趣的整联蛋白的整联蛋白相互作用分析检测化合物阻断细胞附着的能力。
血小板凝集分析从麻醉的杂种狗中采集静脉血，或者从在采集血液前至少两周不服用药物和阿司匹林的健康人供体中采集静脉血。将血液收集到柠檬酸盐Vacutainer试管中。室温，以150×g(在具有H-1000 B转子的Sorvall RT6000台式离心机为850RPM)离心血液15分钟，去除富含血小板的血浆(PRP)。在室温，以1500×g(26，780RPM)离心剩余血液15分钟，去除贫含血小板的血浆(PRP)。在PAP-4血小板凝集扩增仪中分析样本，将PPP用作空白(100％透光率)。将200μL of PRP(5×108血小板/mL)加入各个微型试管中，将透光率设定为0％。将20μL ADP(10μM)加到各个试管中，绘制凝集曲线(％透光率比时间)。在加入血小板激动剂之前，加入不同浓度的检测试剂(20μL)。结果表示为对激动剂诱导的血小板凝集的抑制的百分数(％)。
人大动脉平滑肌细胞迁移分析用于评价αVβ3-介导的平滑肌细胞迁移的方法以及抑制αVβ3-介导的平滑肌细胞迁移的试剂在Liaw等人，J.Clin.Invest.(1995)95713-724)中描述。
体内血管生成模型用于评价血管生成的定量方法和抗血管生成试剂在Passaniti等人，Laboratory Investigation(1992)67519-528中描述。
猪再狭窄模型用于评价再狭窄的方法和抑制再狭窄的试剂在Schwartz等人，J.Am.College of Cardiology(1992)19267-274中描述。
小鼠视网膜病模型用于评价视网膜病以及抑制视网膜病的试剂在Smith等人，Invest.Ophthal.&Visual Science(1994)35101-111中描述。
“死栓”的接触点下面的表1列举了βTD和βA结构域之间的接触点。下文的表2列举了杂交结构域与βTD之间的更广泛的接触点。在各个表的来源栏中列举的氨基酸表示接触点，一种调节物将被设计来结合该接触点。通过在此描述的方法鉴定的调节物通常模拟列举在靶点栏中的肽C663VVRFQYYE671D672S673S674G675KSILYVVEEPEC687(SEQ ID No.1)以及K618KFDREPYMTENTCNRYCRD(SEQ ID NO.2)的相互作用，特别是列举在表1中的那些肽，以及其它列举在表2中的那些。整联蛋白调节物将结合的重要氨基酸接触点包括如表1中的Ser673。如表2中所示，整联蛋白调节物将结合的重要氨基酸接触点包括(α1/链A环的)Arg633、Thr630、Glu628和Arg636。在未配体化的αVβ3中，βTD的弹性CD环接触链-F/α7环(前者的Ser674接触βA中的Val332)(表1)(附图6B)，链-F/α7环是在RGD结合时，βA中发生最显著变化的区域(附图3C)；在配体化结构中，失去这种接触。在未配体化的αVβ3中，该接触覆盖非常小的表面积，βTD环具有高温因子。因此，在晶体结构中，该接触可能不产生很多稳定能量。βTD的同侧也与杂交结构域发生较大的接触(表2)。在膜结合结构中，在α亚基与β亚基和/或它们的结构域界面较小重排后，βTD与βA结构域紧密接近可能产生更加实质性的接触。βTD-βA接触能够作为可调节的或者可调控的“死栓”，通过防止与活化起始的α1螺旋向内移动相关的链-F/α7环的移动，将βA锁定在无活性的状态。
有意思的是，已经发现D126D127/A126A127突变灭活ADMIDAS。生成的膜结合整联蛋白与生理配体的结合增加了1.5-2倍(附图8)。如附图4所示，假设ADMIDAS的位置与死栓相关，可能将ADMIDAS稳定(用本发明的整联蛋白调节物)在未配体化的状态也会将死栓稳定在被锁定的状态。该区域包括残基Y122SMKDD(来自α1)以及S334MDSS(来自链-F/α7环)。
表2.在4.0下，βA.pdb和βTD.pdb之间的接触列表。

表3.在4.0下，杂合体.pdb和βTD.pdb之间的接触列表。

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权利要求
1.一种用于评价化合物与分子或分子复合物结合的能力的方法，该分子或分子复合物包含整联蛋白βA结构域的非配体结合位点，该方法包含(a)使用计算机手段进行化合物与未配体化的整联蛋白(例如，αVβ3)的链-F/α7环上的β尾部结构域(βTD)接触区之间的拟合操作；和(b)分析拟合操作的结果，量化所述结合能力。
2.权利要求1的方法，其中化合物模拟一种肽与整联蛋白的βA结构域的链-F/α7环的相互作用，该肽包含氨基酸序列C663VVRFQYYE671D672S673S674G675KSILYVVEEPEC687或其片段，或者包含K618KFDREPYMTENTCNR633YCRD或其片段。
3.用于鉴定候选的针对整联蛋白活性的选择性调节物的方法，该方法包含(a)用整联蛋白的βA结构域的原子结构模型对测试化合物建模，该化合物在空间上优先地拟合到感兴趣的整联蛋白βA结构域非配体结合位点中，其中所述原子结构模型是用包含C663VVRFQYYE671D672S673S674G675KSILYVVEEPEC687或其片段，或者包含K618KFDREPYMTENTCNR633YCRD或其片段的氨基酸序列生成的，(b)在生物学分析中筛选所述测试化合物对整联蛋白的活化作用，该活化作用的特征在于所述测试化合物结合到整联蛋白的βA结构域非配体结合位点上；和(c)鉴定可选择地调节整联蛋白的活性的测试化合物，和可选择地，(d)在生物学分析中，通过被鉴定的测试化合物结合到整联蛋白的βA结构域非配体结合位点上，阻止βA结构域与βTD结构域的相互作用的能力，对被鉴定的测试化合物进行筛选，和(e)从测试化合物集合中，鉴定被筛选出来的测试化合物为能够可选择地调节整联蛋白活性的化合物，在各种实施方案中所述调节包含抑制整联蛋白的活化，以及所述调节包含抑制配体结合到整联蛋白上。
4.鉴定整联蛋白活性的候选抑制剂的方法，该方法包含(a)将定义整联蛋白βA结构域的非配体结合位点的信息导入计算机程序中，该信息包含由表1或者表2的给出坐标的原子限定的或者如附图9和10中定义的构象，其中该程序显示其三维结构；(b)在计算机程序中建立测试化合物的三维结构；(c)将测试化合物的模型叠加到整联蛋白βA结构域的非配体结合位点的模型上；和(d)评价测试化合物模型是否在空间上与非配体结合位点拟合。
5.权利要求4的方法，其中原子选自表1和表2中的那些原子。
6.用于鉴定候选整联蛋白调节化合物的方法，该方法包含(a)生成非配体结合整联蛋白的βA结构域的链-F/α7环的βTD接触区的三维结构；(b)使用三维结构来设计或者选择候选整联蛋白调节化合物，和(c)通过步骤(a)和(b)获得的数据，鉴定所述候选整联蛋白调节化合物。
7.权利要求6的方法，还包含(d)提供整联蛋白调节化合物；和(e)通过将调节化合物与整联蛋白接触，确定整联蛋白抑制剂结合整联蛋白的能力。
8.用于鉴定候选整联蛋白调节化合物的方法，该方法包含(a)表达含有βA结构域和βTD结构域的重组整联蛋白片段；和(b)在筛选分析中，使用这两种结构域的蛋白质-蛋白质相互作用来鉴定βA结构域与βTD结构域相互作用的调节物。
9.权利要求8的方法，还包含(c)提供整联蛋白调节化合物；和(d)通过测量调节化合物与整联蛋白的相互作用，确定整联蛋白调节物结合整联蛋白的能力；和(e)将调节化合物用作药物设计的基础。
10.抑制整联蛋白活化的方法，该方法包含将一种化合物与整联蛋白接触，从而将整联蛋白的βA结构域结构锁定在不可活化的形式中。
11.权利要求10的方法，其中在与整联蛋白相互作用中，所述化合物模拟链内配体。
12.权利要求10的方法，其中链内配体包含SEQ ID No1或其片段或者SEQ ID No.2或其片段的序列。
13.权利要求10的方法，其中链内配体是抑制素家族成员。
14.鉴定整联蛋白调节物的方法，包含(a)用表1或表2的或者如附图9和10所定义的三维结构坐标，进行合理药物设计来选择可能的抑制剂，其中结合计算机建模来进行所述选择；(b)将可能的抑制剂与整联蛋白结构域接触；和(c)检测可能的抑制物抑制整联蛋白的能力。
15.权利要求14的方法。其中步骤(c)用配体结合分析来进行。
16.权利要求14的方法。其中步骤(c)用基于细胞的分析来进行。
17.权利要求16的方法，还包含(d)生成包含一种复合物的辅助晶体，该复合物由整联蛋白结构域与来自步骤(a)的第一种可能抑制剂形成，所述辅助晶体以大于4.0的分辨率有效地X-射线衍射复合物的原子坐标；(e)确定所述辅助晶体的三维结构；(f)用所述辅助晶体确定的三维结构进行合理药物设计，选择第二种可能的抑制剂，其中所述选择结合计算机建模进行；(g)将第二种可能的抑制剂与整联蛋白结构域接触；和(h)检测第二种可能抑制剂抑制整联蛋白的能力。
18.通过权利要求3的方法鉴定的化合物，条件是该化合物不是洛伐他汀。
19.包含这种化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
20.用于调节、抑制或者刺激配体或者相关蛋白质结合到整联蛋白上的方法，通过改变整联蛋白βA结构域(βA)与β尾部结构域(βTD)的相互作用。
21.权利要求20的方法，其中整联蛋白选自αVβ1，αVβ3，αVβ5，αVβ6，αVβ8，α3β1，α4β1，α5β1，α6β1，α6β4，α7β1，α9β1，α4β7，gp3b3a，α1β1，α2β1，α10β1，α11β1，LFA-1，MAC-1，或者α150β95。
22.权利要求20的方法，其中βA与βTD的相互作用利用计算机方法或者生物化学方法或者生物物理学方法来研究。
23.权利要求20的方法，其中βA、βTD或者两者都作为计算机方法或者生物化学方法或者生物物理学方法的结构基础。
24.用于评价化合物与分子或者分子复合物结合的能力的方法，所述分子或分子复合物包含整联蛋白βA结构域的非配体结合位点，该方法包含(a)构建由结构坐标定义的结合位点的计算机模型，其中按照附图9和10，表1或表2的氨基酸的结构坐标之间的均方根差不超过约4.0；(b)通过选自下组的方法，选择将被评价的化合物(i)将分子片段组装成化合物，(ii)从小分子数据库中选择一种化合物，(iii)从头进行配体设计的化合物，或(iv)改变蛋白质激酶的一种已知抑制剂或其部分；(c)使用计算机手段，进行将被评价的化合物的计算机模型与结合位点之间的拟合程序操作，以提供在结合位点上的化合物的能量最小化构象；和(d)评价所述拟合操作的结果以量化所述化合物与所述结合位点之间的结合，从而评价所述化合物与所述结合位点的结合能力。
25.按照权利要求24的方法，其中结合位点进一步通过按照附图9和10确定的SEQ ID NO1-4中一个或多个氨基酸的结构坐标来定义。
26.按照权利要求24的方法，其中所述分子或者分子复合物通过按照附图9和10的SEQ ID NO1-4的氨基酸的结构坐标设定来定义。
27.权利要求24的方法，其中均方根差不超过3.0。
28.权利要求24的方法，其中均方根差不超过2.5。
29.权利要求24的方法，其中均方根差不超过2.0。
30权利要求24的方法，其中均方根差不超过1.5。
31.用于鉴定整联蛋白βA结构域的非配体结合位点的活化剂或抑制剂的方法，该方法包含(a)构建由结构坐标定义的结合位点的计算机模型，其中按照附图9和10，表1或表2的氨基酸的结构坐标之间的均方根差不超过约4.0；(b)通过选自下组的方法，选择作为可能的活化剂或者抑制剂的将被评价的化合物(i)将分子片段组装成化合物，(ii)从小分子数据库中选择一种化合物，(iii)从头进行配体设计的化合物，或(iv)改变整联蛋白的一种已知抑制剂或其部分；(c)使用计算机手段，进行将被评价的化合物的计算机模型与结合位点之间的拟合程序操作，以提供在结合位点上的化合物的能量最小化构象；(d)评价所述拟合操作的结果以量化所述化合物与所述结合位点之间的结合，从而评价所述化合物与所述结合位点的结合能力；(e)提供化合物；和(f)将所述化合物与所述分子接触，确定该化合物活化或者抑制所述分子的能力。
32.按照权利要求31的方法，其中结合位点进一步通过按照附图9和10确定的SEQ ID NO1-4中一个或多个氨基酸的结构坐标来定义。
33.按照权利要求31的方法，其中所述分子或者分子复合物通过按照附图9和10确定的SEQ ID NO1-4的氨基酸的结构坐标设定来定义。
34.权利要求31的方法，其中均方根差不超过3.0。
35.权利要求31的方法，其中均方根差不超过2.5。
36.权利要求24的方法，其中均方根差不超过2.0。
37.权利要求24的方法，其中均方根差不超过1.5。
全文摘要
在此描述的方法提供调节尤其是抑制整联蛋白活化的途经。该方法包括鉴定结合到整联蛋白的βA结构域上从而模拟CD环与βA结构域之间的接触的化合物，例如天然存在的和非天然存在的多肽和小分子。以这种方式接触βA结构域锁定了整联蛋白，使得整联蛋白不能被激活。
文档编号G01N33/48GK101084509SQ200480008570
公开日2007年12月5日 申请日期2004年1月30日 优先权日2003年1月30日
发明者M·阿明·阿内奥特, 西洛·斯特尔, 西蒙·戈德曼 申请人:通用医疗公司, 默克专利有限责任公司