专利名称：用于具有抗血管发生活性的抑制剂的生物标志的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于通过使用某些鉴定的生物标志来评估整联蛋白抑制剂和小分子 ATP位点定向多激酶抑制剂对血管发生的作用的方法。此方法对测定主要用于治疗血管发生相关疾病如癌症的整联蛋白抑制剂和小分子ATP位点定向多激酶抑制剂的功效尤其有益。尤其是，本发明涉及与血管发生相关的生物标志，其优选是在体液中可及的，并因此允许以无损伤的方式分析靶调节。还公开了该生物标志在筛选具有整联蛋白抑制活性的化合物中的用途。
背景技术：
血管发生广泛适用于从已有的血管系统(casculature)形成新的血管。经历 DNA合成的内皮细胞增殖是生成血管的微血管血管芽(vaseularsprout)的共同标志，而广泛的芽主要需要内皮细胞迁移。血管发生是由一系列血管发生因子和抑制剂安排的基本过程。内皮细胞增殖和迁移的激活剂主要是受体酪氨酸激酶配体，如血管内皮生长因子 (VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)和表皮生长因子(EGF)， 但也可以具有非常不同的来源，如溶血磷脂来源(LPA) (Berger等QO(^)Nature Reviews 3，401-410页)。EGF上调VEGF、FGF和白细胞介素_8 (IL-8)，而LPA上调VEGF水平。最先描述的血管发生抑制剂是血小板反应蛋白-1，其调节内皮细胞增殖和游动性。显著地，许多抑制分子(如抑制素)衍生自对血管发生无作用的更大的蛋白质；例如制管张素(结合ATP合酶和膜联蛋白III的纤维蛋白溶酶原片段)，以及内皮抑制素、tumstatin和canstatin (与整联蛋白结合的胶原蛋白片段)。一般而言，激活剂和抑制剂的水平指定内皮细胞处于静止状态或血管发生状态。据信，血管发生平衡中的改变介导血管发生的转换。其生理作用在于细胞、组织和器官的发育、再生和修复。病理血管发生是肿瘤及其转移生长超过微观尺寸所必需的，且它可以引起出血、血管渗漏和组织破坏。病理血管发生的结果可以直接或间接导致与广范围的血管发生相关疾病相关的症状、失能或死亡。这类疾病的实例包括肿瘤障碍、自身免疫病、黄斑变性和动脉粥样硬化(atheriosclerosis)寸。关于肿瘤进展，取决于肿瘤类型和环境，血管发生转换可以发生在肿瘤进展途径的不同阶段。但是，新血管形成通常是肿瘤进展的先决条件。几条信号传导途径涉及血管发生的过程。VEGF在血管生成(vasculogenesis)和血管发生(angiogenesis)中发挥关键作用；在所有血管发生因子中，VEGF最频繁地与肿瘤进展和转移相关。初步的证据表明，多种同种型的过量表达可以对肿瘤具有不同的作用。肿瘤相关的血管发生中的关键步骤包括由肿瘤细胞分泌VEGF，其与它的受体 VEGFR2和内皮细胞上的神经粗蛋白结合(Folkman 2007，Nature Reviews,6, 273-286 页)。最常见的是来自肿瘤的至少6种其他促血管发生因子(pro-angiogenic factor) 0 从肿瘤细胞，但还由VEGF刺激的细胞释放基质金属蛋白酶(MMP)。MMP动员来自基质的促血管发生蛋白质，但还在血管壁中从胶原蛋白18切割血管发生抑制剂内皮抑制素，并参与从循环纤维蛋白溶酶原切割血管发生抑制剂制管张素。肿瘤细胞分泌血管发生素 (angiopoetin)2(ANGPT2)，其与ANGPTl竞争结合内皮TIE2受体。由许多细胞表达的血管发生素(angiopoietin) 1 (ANGPTl)与内皮TIE2 (也称为TEK)受体结合，并在血管中帮助维持正常化状态。ANGPT2增加血管基膜的降解和内皮细胞的迁移，从而便于芽形成。由许多肿瘤分泌的PDGF可以上调其自身在内皮细胞上的受体(PDGFR)。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)由其他肿瘤分泌。响应生长调节剂如VEGF和bFGF，内皮细胞上调某些整联蛋白。整联蛋白是细胞表面黏附分子，其便于内皮与胞外环境结合，该结合为细胞保持生存力和对生长调节蛋白的反应性所需。内皮细胞是最具贴壁依赖性的细胞。认为整联蛋白在向肿瘤迁移和提高它们对生长调节剂如VEGF和bFGF的敏感性所需的间歇脱附过程中维持内皮细胞生存力。整联蛋白在肿瘤血管发生和转移，及几种其他血管发生依赖性人疾病如牛皮癣和类风湿性关节炎中发挥关键作用(Mousa SA, Drugs of theFuture 1998 ；23(1) :51-60)。 它们是将胞外环境与细胞骨架偶联的细胞表面黏附分子(Geiger B.等，Nat Rev Mol Cell Biol 2001 ；2 =793-805) 0除其结构功能外，它们还是用于传递对细胞黏附、迁移、增殖和存活重要的信号的受体。由整联蛋白诱导的信号发放事件是多样的，且依赖于细胞背景。与胞外整联蛋白结构域结合的配体诱导构象变化和整联蛋白成束，导致信号发放级联的激活和将多蛋白复合体招募至黏着斑(Geiger B.等，Nat Rev MolCell Biol 2001 ；2 :793-805)。通过包括 Ras,MAP 激酶(MAPK)、黏着斑激酶(FAK)、Src、Rac/Rho/cdc42GTP 酶、PKC 和 PI3K 的多种胞内蛋白激酶和衔接分子传递信息。通过这些分子，整联蛋白信号发放紧密，而协调地与受体酪氨酸激酶信号发放相互作用来调节存活、增殖、黏附和迁移(Giancotti FG.等，Science 1999 ；285 (5430) :1028-32)。整联蛋白形成由α和β两个亚基组成的异二聚体(Hynes R0. TrendsCell Biol 1999 ；12 :33-37)。它们有差别地表达在多种细胞类型上，并识别胞外基质蛋白质的多个配体，如胶原蛋白、玻连蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白。包括α (ν) β (3)和α (ν) β (5)的整联蛋白亚型识别其配体中的共有基序RGD序列，该序列存在于诸如玻连蛋白、纤连蛋白、凝血因子 I 的配体中(Ruoslahti E. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 1996. 12 :697-715)。α νβ 5整联蛋白特异性结合玻连蛋白，而α νβ 3还结合临时ECM的其他大分子。 α νβ 3结合例如包括血纤蛋白、凝血因子I、层粘连蛋白、血小板反应蛋白、玻连蛋白、von Willebrand因子、osteospontin和骨唾液酸蛋白I的配体。这些整联蛋白在组织中的许多细胞相互作用中所发挥的具体的细胞黏附作用仍处于研究中，但清楚的是，存在具有不同生物功能的不同整联蛋白。α νβ 3在活化的内皮细胞，如肿瘤内皮细胞上，而不在静息内皮细胞和大多数正常器官系统上高表达，这使其成为用于抗血管发生疗法的适宜靶标(Brooks PC等，Science 1994 ；264 :569-71)。最初作为恶性黑素瘤的进展依赖性标志在癌症中注意到了 α νβ 3。 它增强了黑素瘤的体内生长和体外存活。α νβ 3阻断剂逆转了这些作用。随后，在包括成胶质细胞瘤、肾癌、卵巢癌等的其他肿瘤中发现了 ανβ3。在许多恶性肿瘤中，ανβ3 还广泛地过量表达于EC中。在体外，由肿瘤衍生的生长因子激活的血管发生模型在出芽 (sprouting)的血管系统上过量表达且需要ανβ3，而ανβ3和α ν β 5阻断可抑制血管发生表型。还显示α ν β 5支持由一些肿瘤衍生的生长因子诱导的新血管形成。抑制α ν β 5 可以触发肿瘤细胞的凋亡。已提出将整联蛋白抑制剂作为尤其是用于预防和治疗主要与血管发生相关的障碍的人和兽药中的药物有效成分。它们可以用于治疗和预防循环、血栓形成、心肌梗塞、动脉硬化、炎症、中风、心绞痛、肿瘤障碍、溶骨障碍尤其是骨质疏松症、血管发生和血管发生引起的障碍，例如眼睛的糖尿病性视网膜病、黄斑变性、近视、眼组织胞浆菌病、类风湿性关节炎、骨关节炎、虹膜红变性青光眼、以及溃疡性结肠炎、克罗恩氏病(Crohn'sdisease)、多发性硬化、牛皮癣和血管成形术后再狭窄。有几种处于临床开发中的用于治疗癌症、关节炎和牛皮癣的整联蛋白抑制剂，如西仓吉肽(cilengitide)、abegrin(vitaxin，MEDI-522)、CNT095、DI-17E6 和 volociximab (Nemeth JA 等，Cancer Invest. 2007 ；25 (7) :632-646)。它们拮抗整联蛋白与胞外基质(ECM)相互作用，并扰乱内皮和肿瘤细胞的功能。该整联蛋白抑制剂表征为不同的特异性和作用机制。abegrin、volociximab、DI-17E6和CNT095是单克隆抗体拮抗剂。西仑吉肽是模拟RGD基序的拮抗环肽(环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)) (EP 0770622)。西仑吉肽靶向α ν-整联蛋白，尤其是ανβ3和ανβ5。US6521593公开了用西仑吉肽作为α νβ 3/ α νβ 5整联蛋白抑制剂抑制脑中肿瘤生长的方法。该发明包括该整联蛋白抑制剂显示依赖于抗血管发生的抗肿瘤发生作用。此外， 该整联蛋白拮抗作用可以诱导不依赖于抗血管发生的直接的肿瘤细胞死亡。W002/41910涉及西仑吉肽作为α νβ 3/ α νβ 5整联蛋白抑制剂在治疗由血管发生引起的患者眼睛的疾病中的用途。单克隆小鼠抗体17Ε6特异性抑制具有人整联蛋白受体的细胞的α ν-整联蛋白亚基。例如 Mitjans 等(1995 J. Cell Sci. 108,2825)及专利 US5, 985，278 和 EP 719 859 描述了小鼠IgGl抗体。鼠17E6产生自用纯化并固定在琼脂糖上的人ανβ3免疫的小鼠。将来自免疫的小鼠的脾淋巴细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，得到的杂交瘤克隆之一产生单克隆抗体17Ε6。DI-17Ε6 (CAS No :1105038-73-0)是这样的抗体，其具有单克隆小鼠抗体17E6的生物学特征，但尤其是就在人中的免疫原性而言具有改进的特性。此修饰的抗体的完整的可变和恒定氨基酸序列显示于
图1中和W02009/01(^90中。已在将它们用于抗血管发生疗法的范围内发展了例如针对VEGF和VEGFR的酪氨酸激酶抑制剂。VEGFR的酪氨酸激酶抑制剂是低分子量、模拟ATP的蛋白质，其与VEGFR酪氨酸激酶结构域的ATP结合催化位点结合，导致胞内信号发放的阻断(Morabito等2006The Oncologistll =753-764) 0这些药剂中的几种目前处于临床开发的不同阶段。大规模的随机化II期试验已显示了舒尼替尼(sunitinib)和索拉非尼(sorafenib)分别在治疗患有用标准疗法难治的胃肠道间质肿瘤(GIST)和肾癌的患者中的功效。舒尼替尼(SU011M8)是显示有效的抗血管发生和抗肿瘤活性的口服小分子酪氨酸激酶抑制剂(0'Farrell AM等，2003. Blood 101 :3597-3605)。它是小分子ATP位点定向竞争性抑制剂。诸如SU6668和STO416 (semaxanib)的酪氨酸激酶抑制剂显示差的药理学特性和有限的功效；因此，针对其高生物利用率及其对抗血管发生的受体酪氨酸激酶(RTK) (血管内皮生长因子受体(VEGFR)和血小板衍生生长因子受体(PDGFR))的纳摩尔范围效力合理地设计和选择了舒尼替尼。舒尼替尼抑制其他酪氨酸激酶，包括KIT、FLT3、集落刺
6激因子I(CSF-I)和RET，这些酪氨酸激酶涉及许多恶性肿瘤，包括小细胞肺癌、GI间质肿瘤(GIST)、乳腺癌、急性髓细胞白血病、2A和2B型多发性内分泌瘤病及家族性甲状腺髓样癌。舒尼替尼在临床前研究中显示强健的抗肿瘤活性，在结肠癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、肾癌和鳞状细胞癌的模型中不仅导致肿瘤生长抑制，还导致肿瘤消退，这与VEGFR和PDGFR磷酸化的抑制相关。在II期研究中在神经内分泌癌、结肠癌和乳腺癌中显示了临床活性，而在晚期肾细胞癌中和在伊马替尼(imatinib)难治的GIST中已显示了明确的功效，导致美国食品与药品管理局(US Food and DrugAdministration)批准将舒尼替尼用于治疗这两种疾病。在多种肿瘤类型中调查舒尼替尼单独和与化学疗法组合的研究正在进行中。RTK 的split激酶结构域家族成员的此小分子抑制剂的临床基准确定将导致关于生物学、潜在的生物标志和在肿瘤、间质和内皮腔隙中靶向多条信号传导途径的药剂的临床效用的其他认知。索拉非尼是最初发展作为Raf激酶信号发放的特异性抑制剂的新的双芳基尿素 (Morabito等2006The Oncologist 11:753-764)。随后的研究已显示，此化合物还抑制涉及肿瘤进展的几种其他酪氨酸激酶，包括VEGFR。如通过抗CD-31免疫染色所测量，用索拉非尼处理的结肠癌、乳腺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)的异种移植模型显示肿瘤血管发生的显著抑制。用索拉非尼在患有不同类型肿瘤的患者中进行了大规模的II期随机化试验。已报道了 202名患有晚期肾细胞癌的患者的结果。随后的随机化、安慰剂对照的III期试验确认了索拉非尼在细胞因子难治的晚期肾癌患者中的功效。索拉非尼被很好地耐受，具有可管理的副作用疹(34% )、腹泻(33% )、手足皮肤反应(27% )、疲劳( % )和高血压 (11% )。基于这些结果，FDA于2005年12月宣布批准将索拉非尼用于患有晚期肾癌的患者。此外，欧洲委员会(European Commission)最近批准了索拉非尼用于治疗肝细胞癌的孤儿药品地位。在II期试验中，用索拉非尼治疗的43%的患者经历了持续至少4个月的稳定疾病，且另外9%的患者经历了肿瘤缩小。目前，III期临床试验正在评价索拉非尼在肝细胞癌、转移性黑素瘤和NSCLC中的功效；此外，正在用索拉非尼与几种化疗剂(伊立替康 (irinotecan)、达卡巴嗪(dacarbazine))或分子靶向剂(吉非替尼(gefitinib))组合在晚期实体瘤中进行几项其他I/II期研究，以最大化该药物的治疗潜能。抗血管发生疗法主要靶向例如肿瘤中活化的血管内皮细胞。它可以通过经上文所述的整联蛋白抑制防止内皮细胞对环境反应来直接达到此目的。抗血管发生疗法还可以通过如贝伐单抗所做的中和血管发生因子来起作用(见下文)。例如血管发生因子的遗传变异对血管发生相关疾病的临床治疗具有重要影响。例如，由于内皮抑制素前体基因的额外拷贝，患有唐氏综合症(Down syndrome)的个体具有比正常个体高1.6倍的内皮抑制素水平。他们似乎是所有人中最不受癌症影响的。因此，应在抗血管发生疗法中考虑由遗传变异引起的血管发生中的差异。最优地，抗血管发生疗法可以需要将内皮细胞暴露于稳定状态的血液抑制剂水平。因此，对于环状多肽抑制剂如西仑吉肽，经常施用可以是最优的。但是，由于持久的抗体，可以按更大的间隔施用单克隆抗体，如D7E16。肿瘤可以变得用抗血管发生疗法难治，尤其是如果单一的抗血管发生疗法仅靶向一种血管发生蛋白质(例如VEGF)。使用抗VEGF疗法(如抗VEGF的抗体(贝伐单抗))，早期肿瘤的血管系统减少，且肿瘤生长受限制。但是，在回顾性分析中，用贝伐单抗持续对转移
7性肿瘤进行抗血管发生治疗未产生益处。虽然高达60%的人肿瘤表达VEGF，但大部分肿瘤还可以表达5至8种其他血管发生蛋白质。在长时间抑制该表达时，可以出现另一血管发生蛋白质的表达(Dorrell 等 Q007)Proc. Natl. Acad. Scidoi :10. 1073/pnas. 0607542104)。因此，由于上述原因，说明所关联的信号途径的一系列敏感和特异的生物标志可以辅助选择抗血管发生疗法。此外，甚至在可以在解剖学上对其进行定位之前，它们即可以支持微观复发肿瘤的诊断。此外，可通过显著低于高度血管化的肿瘤所需的血管发生抑制剂的剂量来抑制弱血管化的肿瘤。这些肿瘤可表达其自身的血管发生抑制剂，并可以对更低剂量的血管发生抑制剂反应。例如广范围的肿瘤类型及其发展中的遗传变异和多样的血管发生过程尤其需要一系列提供信息的生物标志来优化和个性化抗血管发生疗法。还可能用基于血管发生的生物标志来监测某些非瘤的(non-neoplastic)血管发生依赖性疾病的进展或消退。这些疾病包括例如动脉粥样硬化、子宫内膜异位症、克罗恩氏病和类风湿性关节炎等。发明_既述本发明基于抗血管发生治疗需要提供信息的分子生物标志的多种经验 (Bertolini F 等 Drug Discov Today. 2007 ； 12 (19-20) :806-12)。该生物标志可以优选用于例如(1)测量分子靶标状态和药物对靶标的药物作用的药效(PD)终点；(2)鉴定血管发生相关途径；(3)找到对个体患者而言最适合的抗血管发生药物；(4)提供靶标调节的概念证据；(5)测试潜在的假设；(6)提供抗血管发生疗法的剂量和方案的合理选择；(7)解释或预测临床结果。虽然分子癌症治疗有许多成功如曲妥珠单抗(trastuzumab)和伊马替尼，但只有少数进入临床的肿瘤学药物获得上市批准。分子生物标志的使用应降低此高水平的损耗， 从而降低药物开发成本和提高为癌症患者赢得创新和活性药物的可能性。这些分子生物标志可以补充由细胞生物标志提供的信息。细胞生物标志是例如不同的内皮细胞群体，如用作血管发生标志的循环内皮细胞和循环内皮祖细胞。分子生物标志可以弥补细胞生物标志的不足，如内皮细胞群体的主观计数。该细胞生物标志的使用需要肿瘤相关内皮的表征中更多的工作(Bertolini等Q007)Drug discovery today 12,806-812) ο此外，对于常规应用，诸如动态增强磁共振成像(dynamic contrast resonanceimaging(DCE-MRI))的成像技术作为测量血管发生的方法具有一些强的限制。这些技术很昂贵，并限于具有充足仪器的中心。本发明涉及评估治疗剂或药物的作用、功效、安全性、预后和/或施用的方法，该治疗剂或药物是血管发生抑制剂，优选用于治疗患有血管发生相关疾病，优选肿瘤的患者的整联蛋白抑制剂或小分子ATP位点定向多激酶抑制剂(small molecule ATP site directed multi—kinase inhibitor)。
本发明还涉及评估血管发生抑制剂，优选整联蛋白抑制剂或小分子ATP位点定向多激酶抑制剂对这样的血管发生的作用的方法。本发明还涉及用于在基于细胞的模型中筛选整联蛋白调节化合物的方法。在第一方面，本发明涉及用于利用具体的提供信息的分子生物标志来评估血管发生抑制剂，优选整联蛋白或ATP位点定向多激酶抑制剂对血管发生的作用的方法。因此，本发明尤其基于评估优选在抗血管发生疗法的背景中应当应用于个体的血管发生抑制剂的功效的需要。为了治疗背景部分中所述的血管发生相关疾病，将应用该抗血管发生疗法。在另一方面，本发明涉及该提供信息的分子生物标志在患有血管发生，优选整联蛋白相关疾病的患者的诊断和治疗中测定和预测这类抑制剂的功效中的用途。在提供信息的分子生物标志的建立中存在必须考虑的不同注意事项，应评估在抗血管发生疗法的背景中对个体施用的血管发生抑制剂的功效。例如，由于可以对患有不同类型的血管发生相关疾病，且不同类型的组织和/或器官受该疾病影响的个体施用抗血管发生疗法，很难或由于医疗原因甚至不可能获得足够的活检组织来进行分子生物标志的分析。此外，若用血管发生抑制剂例如靶向个体中转移的肿瘤，则为了分析该抑制剂的作用，多种靶组织的不同活检组织可以是必需的。因此，用血管发生抑制剂处理引起的血管发生依赖性肿瘤进展的评价需要某些不同的组织样品。此外，由于血管发生依赖于新血管的形成，且许多血管发生步骤涉及循环中的蛋白质，不可以通过分析分子生物标志在某种组织中的出现或消失来评价抗血管发生疗法的成功。因此，循环蛋白质作为生物标志的用途可以提供关于抗血管发生疗法的成功的信息。该循环蛋白质可以是可在体液中检测的，因此，它们对克服所讨论的注意事项可以是有利的。已在施用某些抗血管发生疗法后在血浆中分析了单个选择的血管发生生长因子 (angiogenic growth factor)，如 VEGFΛ bFGF 禾口 PLGF (Jubb 等 2006，Nature Reviews，6， 626-63 。但由于来自血小板和其他细胞的许多生长因子的活跃摄取，血浆中血管发生生长因子的有意义的评价是受限制的。此外，肿瘤细胞表达不同水平的该血管发生生长因子。 此外，由于血管发生的复杂性和蛋白质循环的复杂性，样品中少数单个生物标志的评价不足以评价抗血管发生疗法。因此，优选隶属于不同蛋白质家族和以不同方式涉及血管发生或相关信号传导途径的一系列某些分子生物标志可以补充抗血管发生药物监测中足够工具的缺乏。本发明涉及由于对个体施用血管发生抑制剂和由于其与它的选择性靶标的结合而优选从组织细胞分泌进入其环境中的某些分子生物标志。优选地，这些分子生物标志可以从组织细胞分泌进入其环境中，且作为其结果，它们可以是可在体液中检测的。因此，优选将来自通过该血管发生抑制剂处理的个体的体液用于分析该分子生物标志。按照本发明发现其对血管发生相关受体，优选ATP位点定向多激酶整联蛋白，及这些受体的抑制剂反应的生物标志是以下生物标志ADAMTS1, ADAMTS9, SERPINB2, SERPIND2, STCl， ADAMl5, SRPX, COROIC, PBEFl， LTB4DH, IL15RA, ENPP4, PLAUR, LAMA5, TNFRSF1A, CLU, T0R3A, ILlRLl，ILlRl，TCN2, VEGFC, LMNA, CTSL, PTX3, NCL, GUSB, CLEC3B, IL8, GPX3, CXCLl，SDFRl，STATl，CDCA7, DAF, HYAL2, CD40, NOTCHl，INHBA,EDNl，MCPl，MMPlO，AUTS2，LIPG,PDGFB，BMP4，MGP，HTRAl，FBLN5，HHIP，C0L4A1, GALNT, MMP2, IL13RA1, MFAP2, NTN4, DKK3. SERPINE2, C0L5A1, CHSTl，PGF, EFNA4, BCHE, ENG，R0R1，ANGPTL4，ESM1，CUBN，IGFBP7, CYR61，FLT4，SPOCK, C0L12A1，LTBPl，MMP28， TMEM4, CTSB, C0L1A2, GRP124, SPARC, FST, DKK4, PHLDB2, PVR, CYR61, MERTK, FSTL3, APLN, PTX3, CTGF，NRG1，DKK3, CD44, BCHE，BDNF，FBX04, EFEMP1，STC2, IL-6，CRP、CD40 配体和 / 或 MMP9。就它们对一些具体的血管发生抑制剂的处理的反应性而言，本发明优选的生物标志是 ADAMTS1、STCl、EDNl、MCPl、IL8、PDGF-BB、CRP、CD40 配体和 IL6。本发明最优选的生物标志是ADAMTS1、STCl、EDm和IL8，或其组合。在优选实施方案中，可以在体液，如血液和血浆、淋巴、液体(liquor)和/或尿液中检测该分子生物标志。在尤其优选的实施方案中，可以在血液和/或尿液中检测该分子生物标志。在这种情况下，可以容易地调查该分子生物标志，因为可以以无损伤的方式获取血液和尿液。在本发明的优选实施方案中，该血管发生抑制剂选自整联蛋白抑制剂。在更优选的实施方案中，该整联蛋白抑制剂选自α (ν)整联蛋白抑制剂。在尤其优选的实施方案中，该整联蛋白抑制剂选自DI-17E6或其衍生物和/或西仑吉肽为了这样做，将在获自个体的体液中分析该分子生物标志，已用假定的治疗有效量的DI-17E6或其衍生物和/或西仑吉肽处理了该个体。在另一优选实施方案中，该整联蛋白抑制剂在内皮细胞上与整联蛋白特异性结合。优选地，该分子生物标志将在该内皮细胞中上调，并以更高的量分泌进入该内皮细胞的环境中。在另一种情况下，该生物标志的分泌由于用该抑制剂处理而起始。内皮细胞的环境包括血管腔和邻近组织。在尤其优选的实施方案中，该分子生物标志在其从内皮细胞分泌后到达血流。在本发明的另一优选实施方案中，由于该整联蛋白抑制剂与内皮细胞的特异性结合，该分子生物标志在该内皮细胞中下调，并以更低的量分泌进入该内皮细胞的环境中。在另一种情况下，该生物标志的分泌由于用该抑制剂处理而停止。在本发明的一个实施方案中，由于用整联蛋白抑制剂处理而可以在某些体液中检测的该分子生物标志是蛋白质。优选地，该蛋白质是血清的可溶性蛋白质或包含于血浆中的蛋白质。在本发明的一个实施方案中，主要可以通过基于免疫学的技术，如Western印迹、Elisa、Luminex和相关技术检测该蛋白质。为了本发明的目的，响应经整联蛋白抑制剂处理，该生物标志优选蛋白质在优选的体液中定量地提高或减少。在优选实施方案中，通过P值不超过0.01来定义在多个试验中表征的由整联蛋白抑制剂的处理引起的某种生物标志的提高或减少。在本发明的另一方面，响应用整联蛋白抑制剂处理，该生物标志优选蛋白质被修饰。这些改变可以包括该蛋白质分子大小的改变、蛋白质中的修饰如糖基化和与不同或相同的蛋白质亚基的相互作用。在本发明的另一方面，可以在RNA水平上检测该生物标志的改变的基因表达。因此，将从组织细胞的样品提取RNA，该样品获自响应通过整联蛋白抑制剂处理的个体。因此， 可以通过已知的基因表达谱分析技术如阵列技术来分析所表达的某些生物标志的RNA转录物。优选地，所获取的用于RNA提取的组织细胞样品衍生自内皮细胞。
优选地，用于评估整联蛋白抑制剂在抗血管发生疗法中的功效的方法首先包括对个体施用假定的治疗有效量的整联蛋白抑制剂。治疗有效量的假定和测定基于例如之前的临床前和临床研究。其次，通过本发明的方法评估施用假定的治疗有效量的该整联蛋白抑制剂的功效。内收(adduct)该评估的评价，以在改变的条件下重复其他轮次的血管发生疗法。根据本发明的一个实施方案，优选该生物标志是已与血管发生相关，且可以涉及与该整联蛋白受体相关的信号途径的候选者。更优选地，该生物标志可以在施用整联蛋白抑制剂后涉及阻断血管发生。另一方面涉及本发明的生物标志组的多样性。优选地，它们不可以由于高序列同源性而分组在一个蛋白质家族中，且不可以由于其生理相关性而分组在功能组中，如血管发生因子VEGF、EGF和PLGF等。在本发明的另一方面，为了评估抗血管发生药物的作用，可以分开、与本发明的不同生物标志或与本发明之外测定的其他血管发生生物标志组合使用生物标志。此外，通过测定样品，如体液中的蛋白质水平获得的分子生物标志评价结果可以通过通过测定样品，如内皮细胞中的RNA水平获得的基因表达结果来实现。该比较可以是有用的，因为蛋白质转录物形式的分子生物标志可以例如由于某些生理环境而在血液或尿液中不稳定。在本发明的第二方面，本发明涉及用于通过分子生物标志来评估血管发生抑制剂的作用的方法，该方法包括以下步骤在施用血管发生抑制剂之前从个体获得组织样品，其中从所获取的组织样品制备细胞，优选内皮细胞。在确定的实验室条件下体外培养该细胞， 然后用血管发生抑制剂处理。由于用血管发生抑制剂处理，可以改变该生物标志的表达和分泌。可以在细胞培养基中跟踪该改变的分泌。详细地，这些分子生物标志由于用血管发生抑制剂处理而从该细胞分泌进入其环境，即培养基中。结果，可在该细胞培养基中检测它们。在这种情况下，可以容易地调查和监测该分子生物标志，因为易于获得和处理培养细胞的该细胞培养基。在优选实施方案中，该分子生物标志将在该内皮细胞中上调，并以更高的量分泌进入该内皮细胞的培养基中。在另一种情况下，该生物标志的分泌由于用该抑制剂处理而起始。在本发明的另一优选实施方案中，该分子生物标志在该内皮细胞中下调，并以更低的量分泌进入该内皮细胞的培养基中。在另一种情况下，该生物标志的分泌由于用该抑制剂处理而停止。表征为该步骤的方法包括优选选自整联蛋白抑制剂的血管发生抑制剂。在更优选的实施方案中，该整联蛋白抑制剂选自α (ν)整联蛋白抑制剂。在尤其优选的实施方案中，该整联蛋白抑制剂选自DI-17E6或其衍生物和/或西仑吉肽。为了这样做，将在获自用假定的有效量的DI-17E6或其衍生物和/或西仑吉肽处理的内皮细胞的细胞培养基中分析该生物标志。在本发明的一个实施方案中，由于通过整联蛋白抑制剂的处理而可以在上清中检测的该生物标志是前一部分中所述的蛋白质。为了本发明的目的，响应通过整联蛋白抑制剂的处理，该生物标志优选蛋白质在内皮细胞样品的上清中定量地提高或减少。在优选实施方案中，通过P值不超过0.01来定义在某些试验中表征的由整联蛋白抑制剂的处理引起的某种生物标志的提高或减少。
在本发明的另一方面，在该细胞培养基中检测的该分子生物标志优选蛋白质按前一部分中所述被修饰。在本发明的另一方面，可以通过从内皮细胞提取RNA来在RNA水平上检测由通过整联蛋白抑制剂的处理引起的该生物标志的基因表达的改变。因此，可以通过已知的基因表达谱分析技术如阵列技术来分析所表达的某些生物标志的RNA转录物。用于在上一部分中所述的该细胞培养系统中评估整联蛋白抑制剂对血管发生的作用的方法首先包括对内皮细胞施用假定的治疗有效量的整联蛋白抑制剂。假定的治疗有效量的测定基于例如之前的临床前和临床研究。其次，通过本发明中所述的分子生物标志来分析施用假定的治疗有效量的该整联蛋白抑制剂的作用。内收该评估的评价来测定或重复抗血管发生疗法。在另一方面，用于在上一部分中所述的该细胞培养系统中评估整联蛋白抑制剂对血管发生的影响的方法首先包括对内皮细胞施用探究量(explorative amount)的整联蛋白抑制剂。探究量的测定基于例如之前的临床前和临床研究。其次，通过本发明中所述的分子生物标志来分析施用探究有效量的该整联蛋白抑制剂的作用。内收该分析的评价进行进一步的临床前或临床研究。根据本发明的一个实施方案，在该细胞培养基中测定的该分子生物标志优选是前一部分中所述的候选者。在本发明的另一方面，为了评估抗血管发生药物的作用，可以分开、与本发明的不同生物标志或与本发明之外测定的其他血管发生生物标志组合使用生物标志。此外，通过测定细胞培养基中的蛋白质水平获得的分子生物标志评价结果可以通过测定细胞培养物细胞的RNA水平获得的基因表达结果来实现。此外，可以通过获自用整联蛋白抑制剂处理的个体的组织样品或体液与上文所述的通过整联蛋白抑制剂处理的细胞培养物样品或其细胞培养基的组合分析来进行利用分子生物标志的血管发生抑制剂作用评估。在另一方面，本文所述的评估整联蛋白抑制剂的抗血管发生作用和该抑制剂对血管发生相关疾病的功效的方法还可以应用于评估小分子ATP位点定向多激酶抑制剂的抗血管发生作用和该抑制剂对血管发生相关疾病的功效。在优选实施方案中，该小分子ATP位点定向多激酶抑制剂结合并模拟靶激酶的 ATP结合位点，其中该ATP结合位点定位在该靶激酶的催化活性位点中。该多激酶抑制剂的靶激酶优选包括不同的受体酪氨酸激酶，如VEGFR、PDGFR、KIT、 FLT3、CSF-I和RET，以及丝氨酸/苏氨酸胞内激酶RAF。在尤其优选的实施方案中，该小分子ATP位点多激酶抑制剂是舒尼替尼和/或索拉非尼。此外，本发明利用分子生物标志评估血管发生抑制剂的作用的所有方法及其用途可以是对预防和治疗背景部分中所述的血管发生相关疾病有益的。在另一方面，本发明涉及通过本发明的分子生物标志的使用来评估广范围的抗血管发生药物的作用的方法。该生物标志可以用于评估其他抗血管发生药物对血管发生的作用，该其他抗血管发生药物不包含于本发明的抗血管发生药物，或与本发明的抗血管发生药物不相关。
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在另一方面，除了该生物标志在血管发生疗法背景中评估血管发生药物的用途外，它们还可以是在早期发现中有益的。本文指定的方法可以按以下方式提供关于抗血管发生疗法的成功的信息。该方法可以用于发现和优化对患有血管发生相关疾病的患者施用的抗血管发生药物的有效剂量和/或有效方案。详细地，可以通过本发明的方法来评估抗血管发生疗法的功效，该抗血管发生疗法包括例如按假定有效的起始剂量用抗血管发生药物例如整联蛋白抑制剂处理患有血管发生相关疾病的患者。若该血管发生疗法的功效看起来例如低，则可以对该患者应用改变的条件，如改变剂量和/或施用的方案和/或抗血管发生药物的选择。由于改变的抗血管发生疗法条件，可以重复其他轮次的本发明的方法，直至找到对该患者而言最适合的个体疗法。在另一优选方面，若通过本发明的方法将对患有抗血管发生疾病的患者施用的抗血管发生药物的起始剂量评估为有效，则改变的条件可以包括降低剂量或延长该方案。降低对个体施用的化合物、组合物、药剂和治疗的剂量的益处包括与更高的剂量相关的副作用的发生率的降低。由于要求并在实施例中更详细地描述的方法的结果，该疗法可以是改变当前的药物，并用引起更显著的生物标志模式的其他药物取代它。该生物标志还可以广泛用于调查内皮细胞稳态或血管发生。该生物标志的评价可以在具有获得对该生理过程更好的理解的范围的实验中提供信息。根据本发明的另一方面，本发明提供用于筛选具有可能的整联蛋白调节活性的化合物的方法。该方法包括(a)在体液和/或组织样品中测定至少一种选择的生物标志的基线浓度和/或修饰状态，其中该样品获自尚未用该抑制剂处理的个体；(b)在已用该抑制剂处理的(a)的样品中测定该选择的生物标志的浓度和/或修饰状态；(c)计算通过步骤(a)和(b)获得的选择的生物标志的浓度和/或修饰状态之间的差异；(d)从该差异的评价或预测是对血管发生具有作用和/或对血管发生相关疾病具有抗血管发生功效的整联蛋白调节分子的指示；在优选实施方案中，为了获得处理的细胞，按估计处于可能的整联蛋白调节活性范围内的不同剂量对细胞优选内皮细胞进行目的化合物的施用。在优选实施方案中，获取该处理的细胞的细胞培养基进行前一部分中所述的分析。在优选实施方案中，响应用该筛选化合物处理，在细胞培养基中分析和监测的该生物标志是前一部分中所述的蛋白质。在优选实施方案中，通过ρ值不超过0.01来定义在某些试验中表征的由筛选化合物的处理引起的某个生物标志的提高或减少。在本发明的另一方面，响应用前一部分中所述的该筛选化合物处理，该生物标志优选蛋白质被修饰。在本发明的另一方面，可以通过从通过筛选化合物处理的细胞提取RNA来在RNA 水平上检测该生物标志基因表达的改变。因此，可以通过已知的基因表达谱分析技术如阵列技术来分析表达的某些生物标志的RNA转录物。因此，概括而言，本发明更详细地涉及以下 用于利用至少一种选择性生物标志来评估血管发生抑制剂对血管发生的影响和/或该抑制剂对血管发生相关疾病的功效的离体方法，其中该生物标志选自基因产物， 该基因产物选自ADAMTS1, ADAMTS9, SERPINB2, SERPIND2, STCl， ADAMl5, SRPX, COROIC, PBEFl， LTB4DH, IL15RA, ENPP4, PLAUR, LAMA5, TNFRSF1A, CLU, T0R3A, ILlRLl，ILlRl，TCN2, VEGFC, LMNA, CTSL, PTX3, NCL, GUSB, CLEC3B, IL8, GPX3, CXCLl，SDFRl，STATl，CDCA7, DAF, HYAL2, CD40, NOTCHl，INHBA, EDNl，MCPl，MMP10，AUTS2，LIPG, PDGFB,BMP4，MGP，HTRAl，FBLN5，HHIP， C0L4A1, GALNT, MMP2, IL13RA1, MFAP2, NTN4, DKK3. SERPINE2, C0L5A1, CHSTl，PGF, EFNA4, BCHE, ENG, R0R1，ANGPTL4，ESM1，CUBN，IGFBP7, CYR61，FLT4，SPOCK, C0L12A1，LTBPl，MMP28， TMEM4, CTSB, C0L1A2, GRP124, SPARC, FST, DKK4, PHLDB2, PVR, CYR61, MERTK, FSTL3, APLN, PTX3, CTGF，NRG1，DKK3, CD44, BCHE，BDNF，FBX04, EFEMP1，STC2、IL-6、CRP、CD40 配体和 / 或MMP9，该方法包括步骤(a)在体液或组织样品中测定至少一种选择的生物标志的基线浓度和/或修饰状态，其中该样品获自尚未用该抑制剂处理的个体；(b)在获自已用该抑制剂处理的个体的样品中或在随后的步骤中通过该抑制剂处理的(a)的样品中测定(a)中该选择的生物标志的浓度和/或修饰状态；(c)计算通过步骤(a)和(b)获得的该选择的生物标志的浓度和/或修饰状态之间的差异；(d)从该差异评估或预测该抑制剂的一个或多个以下特性-对分子靶标和对与该分子靶标相关的各信号传导途径的药效；-对血管发生的作用；-在患有血管发生相关疾病的患者中的治疗功效和临床结果。 相应的离体方法，其中所获取的体液样品是血液、血浆、血清、淋巴、尿液、泪、滑液、创伤液(would fluid)和/或脑脊液。 相应的方法，其中该组织样品包含患病组织或健康组织。 相应的方法，其中该组织样品选自癌组织、皮肤组织和/或滑膜组织。 相应的离体方法，其中从所获取的组织样品制备内皮细胞。 相应的方法，其中在已从个体获得并从组织样品制备该内皮细胞后将它们培养在实验室条件下，其中从该细胞培养基或来自该细胞的提取物测定至少一种生物标志。 相应的方法，其中该血管发生抑制剂是整联蛋白抑制剂。 相应的方法，其中该血管发生抑制剂是小分子ATP位点定向多激酶抑制剂。 相应的方法，其中该整联蛋白抑制剂是α (ν)整联蛋白的抑制剂。 相应的方法，其中该α (ν)整联蛋白抑制剂是抗体或其衍生物或小的化学分子或RGD肽。 相应的方法，其中该α (ν)整联蛋白抑制剂是DI-17E6或西仑吉肽。 相应的方法，其中该小分子ATP位点定向多激酶抑制剂是舒尼替尼和/或索拉非尼。
相应的方法，其中该内皮细胞和/或体液样品衍生自健康个体和/或患有肿瘤障碍和/或其他血管发生相关疾病的患病个体。 相应的方法，其中该血管发生相关疾病是肿瘤或其各疾病或障碍。 相应的方法，其中该生物标志由于施用该血管发生抑制剂而在其水平中和/或在修饰状态中下调或上调。 相应的方法，其中该生物标志选自 ADAMTS1、STCl、MCP-I、IL-8、EDN1、PDGF-BB、 INHBA、IL-6、CRP、CD40 配体和 / 或 MMP9。 相应的方法，其中生物标志ADAMTS1和/或STCl由于施用至少一种指定的整联蛋白抑制剂而上调。 相应的方法，其 中生物标志MCP1、INHBA, EDNl和/或PDGF-BB由于施用一种指定的整联蛋白抑制剂而下调。 相应的方法，其中生物标志IL8由于施用西仑吉肽或索拉非尼而下调，且由于施用DI-17E6或舒尼替尼而上调。 相应的方法，其中生物标志IL6和/或CRP由于施用DI-17E6而上调。 相应的方法，其中生物标志⑶40配体由于施用DI-17E6而下调。 相应的方法，其中生物标志STCl由于施用指定的小分子ATP定向多激酶抑制剂而下调。 相应的方法，其中生物标志EDm由于施用指定的小分子ATP定向多激酶抑制剂而上调。 用于利用至少一种选择性生物标志来在基于细胞的模型中筛选整联蛋白调节化合物的离体方法，其中该生物标志选自基因产物，该基因产物选自ADAMTS1, ADAMTS9, SERPINB2, SERPIND2, STCl, ADAMl5, SRPX, COROIC, PBEFl, LTB4DH, IL15RA, ENPP4, PLAUR, LAMA5, TNFRSF1A, CLU, T0R3A, ILlRLl，ILlRl，TCN2, VEGFC, LMNA, CTSL, PTX3, NCL, GUSB, CLEC3B, IL8, GPX3, CXCLl，SDFRl，STATl，CDCA7, DAF, HYAL2, CD40,NOTCHl，INHBA,EDNl，MCPl，MMP10，AUTS2，LIPG,PDGFB,BMP4，MGP，HTRAl，FBLN5，HHIP， C0L4A1, GALNT, MMP2, IL13RA1, MFAP2, NTN4, DKK3. SERPINE2, C0L5A1, CHSTl，PGF, EFNA4, BCHE, ENG, R0R1，ANGPTL4，ESM1，CUBN，IGFBP7, CYR61，FLT4，SPOCK, C0L12A1，LTBPl，MMP28， TMEM4, CTSB, C0L1A2, GRP124, SPARC, FST, DKK4, PHLDB2, PVR, CYR61, MERTK, FSTL3, APLN, PTX3, CTGF，NRG1，DKK3, CD44, BCHE，BDNF，FBX04, EFEMP1，STC2、IL-6、CRP、CD40 配体和 / 或 MMP9，该方法包括步骤(a)在体液和/或组织样品中测定至少一种选择的生物标志的基线浓度和/或修饰状态，其中该样品获自尚未用该抑制剂处理的个体；(b)在已用该抑制剂处理的(a)的样品中测定该选择的生物标志的浓度和/或修饰状态；(c)计算通过步骤(a)和(b)获得的该选择的生物标志的浓度和/或修饰状态之间的差异；(d)从该差异评估或预测指示整联蛋白调节分子对血管发生具有作用和/或对血管发生相关疾病具有抗血管发生功效的特性。
包含含有用于至少一种 选自以下的生物标志的检测系统和允许应用该方法的指定的血管发生抑制剂的诊断试剂盒ADAMTS1, ADAMTS9, SERPINB2, SERPIND2, STCl， ADAMl5, SRPX, COROIC, PBEFl， LTB4DH, IL15RA, ENPP4, PLAUR, LAMA5, TNFRSF1A, CLU, T0R3A, ILlRLl，ILlRl，TCN2, VEGFC, LMNA, CTSL, PTX3, NCL, GUSB, CLEC3B, IL8, GPX3, CXCLl，SDFRl，STATl，CDCA7, DAF, HYAL2, CD40, NOTCHl，INHBA, EDNl, MCP1, MMP10, AUTS2, LIPG, PDGFB, BMP4, MGP, HTRAl, FBLN5, HHIP, C0L4A1, GALNT, MMP2, IL13RA1, MFAP2, NTN4, DKK3. SERPINE2, C0L5A1, CHSTl，PGF, EFNA4, BCHE, ENG, R0R1，ANGPTL4，ESM1，CUBN，IGFBP7, CYR61，FLT4，SPOCK, C0L12A1，LTBPl，MMP28， TMEM4, CTSB, C0L1A2, GRP124, SPARC, FST, DKK4, PHLDB2, PVR, CYR61, MERTK, FSTL3, APLN, PTX3, CTGF，NRG1，DKK3, CD44, BCHE，BDNF、FBX04、EFEMP1、STC2、IL-6、CRP、CD40 配体和 / 或 MMP9。參优选选自 ADAMTS1、STCl、EDNl、MCPl、IL8、PDGF-BB、CRP、CD40 配体和 IL6 的生
物标志基因或其基因产物的用途，其用于评估和预测整联蛋白抑制剂或小分子ATP位点定向激酶抑制剂在基于细胞的测定中对血管发生的作用，或这类抑制剂在离体条件下的功效和/或剂量。參优选选自 ADAMTS1、STCl、EDNl、MCPl、IL8、PDGF-BB、CRP、CD40 配体和 IL6 的生物标志基因或其基因产物的用途，其用于制备用于在对这些生物标志中的至少一种反应的患者中治疗癌症的整联蛋白抑制剂或小分子ATP位点定向激酶抑制剂。发明详述术语“血管发生相关疾病”促进大量疾病或障碍，该疾病或障碍直接由失调的 (deregulated)血管发生引起或在失调的血管发生的间接作用中偏向。这些大量疾病包括肿瘤障碍、心血管疾病、炎症、自身免疫病、变性障碍、眼睛障碍。失调的血管发生可以由多种病理刺激诱导。术语“抗血管发生作用”意指阻断或至少抑制血管发生。在本发明的背景中，优选将抗血管发生药物或物质用于通过限制新血管的病理性形成(血管发生)来对抗血管发生相关疾病，且由血管发生介导的疾病症状由于施用抗血管发生药物而缓解。术语“生物标志”指用作生物学状态的指示物的物质。它是作为正常生物学过程、 致病过程或对治疗干预的药理反应的指示物客观地测量和评价的特征。在本发明中，优选将术语生物标志用作分子生物标志，其包括基因转录物，如RNA和蛋白质。该生物标志可以定量地以及定性地改变。优选地，在本发明中，分子生物标志定量地改变，即它们在其水平中减少或提高，其中在相同条件下在某些试验中表征所检查的生物标志的可靠性的P值不超过0.01的值。术语“体液”包括见于个体中的流体(fluid)。它们包括从身体排泄或分泌的流体，以及正常情况下不排泄或分泌的流体。这些各种流体包括房水、血液、血清、组织液、淋巴、黏液、胸膜液(pleural fluid)、唾液、血浆、尿液、泪、滑液、创伤液和/或脑脊液。优选地，将包括血清和血浆的血液及尿液用于本发明。术语“癌症”和“肿瘤/肿瘤障碍”指或描述哺乳动物中的生理条件，其通常表征为未调节的细胞生长。可以利用本发明的药物组合物治疗肿瘤，如乳腺、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头和颈、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨骼、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、宫颈和肝脏的肿瘤。术语“基于细胞的模型/测定”在本文中指衍生自动物或人组织和/或器官，且最优选在用于筛选血管发生调节化合物之前将其培养在实验室条件下的细胞。基于细胞的模型还包括细胞系。抗体的“衍生物”表示抗体的衍生形式。术语“诊断试剂盒”优选包含具有定量和/或定性评价本发明的生物标志必需的不同包装的诊断抗体和/或基因芯片阵列和/或试剂的检测系统，且通常包含使用该试剂、 诊断抗体或基因阵列的说明。可以作为液体、粉末、片剂、悬液提供该抗体以及该试剂。可以以适合于按照本方法分开应用的分开的包装提供该抗体，即基因阵列和试剂。本发明的试剂盒还含有该包装中所包含的材料的“使用说明”。术语“修饰状态”指基因产物中的修饰的改变，如分子大小或蛋白质糖基化的改变。此外，它还指与不同的蛋白质或与相同的蛋白质亚基的相互作用的改变。“个体”包括患有疾病/障碍和/或健康的作为对照先证者的人和动物。此外，还包括实验室动物。“受体”或“受体分子”是可溶的或膜结合/相关的蛋白质或糖蛋白，其包含配体与之结合形成受体-配体复合物的一个或多个结构域。该受体通过结合该配体(其可以是激动剂或拮抗剂)而活化或失活，并可以起始或阻断信号发放途径。“组织样品”意指为了优选以细胞的方式将此材料用于分析和评估物标志而从个体取出的活检组织。在本发明中，可以在活组织检查后直接将组织样品用于分析生物标志。 在本发明的另一方面，可以在某些实验室条件下培养从该活检组织材料提取的细胞，并在随后的时间分析其生物标志。在本发明中，优选使用内皮细胞。术语“治疗有效量=TED”指对在哺乳动物中治疗疾病或障碍有效的药物，例如治疗性抗体的量。在癌症的情况下，药物的治疗有效量可以减少癌细胞数目；减小肿瘤大小； 抑制(即在某种程度上减慢和优选终止)肿瘤细胞浸润入外周器官；抑制(即在某种程度上减慢和优选终止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上减轻与癌症相关的一种或多种症状。在药物可以阻止生长和/或杀死已有的癌细胞的程度上，它可以是抑制细胞的和/或细胞毒素的。对于抗肿瘤疗法，例如可以通过评估疾病进展时间 (TTP)和/或测定反应率(RR)来测量功效。术语“反应”或“反应性”指可以用指示对患者的益处的任意终点评估的条件，其非限制性地包括疾病进展在某种程度上的抑制，包括减慢完全抑制；疾病发作次数和/或症状的减少；针对所应用的抑制剂药物的自身免疫应答的减少；治疗后无疾病呈现的 长度的增加；和在治疗后的给定时间点的降低的死亡率。该术语指可测量的反应，包括完全反应 (CR)和部分反应(PR)。在本发明的背景中，鼠、嵌合或人源化形式的抗体包括等同的抗体或衍生物，其中按照鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体的定义取代抗体的部分。在此研究中，鉴定了与整联蛋白抑制剂和小分子ATP位点定向多激酶抑制剂的抗血管发生活性相关的生物标志，其是在体液中可及的，并因此可以允许以无损伤的方式分析靶标调节。为此，采取了两种不同的策略。首先，分析了内皮细胞基因表达谱响应药物处理的全基因组改变。其次，进行了用体内血管发生模型来鉴定受药物调节的血浆生物标志的候选者蛋白质组驱动的方法。1.用基因表达谱鉴定生物标志为了鉴定与处理相关的生物标志，用西仑吉肽或DI-17E6处理了 HUVEC。Western 印迹分析揭示，对于西仑吉肽和DI-17E6，处理后分别抑制了 FAK和MAPK的磷酸化。从每个条件重复测试三次的实验产生基因表达谱。为此，从处理的细胞和对照细胞提取RNA，并与全基因组Affymetrix寡核苷酸微阵列杂交来产生基因表达谱。用GCRMA算法(WuZ，Journal American Statistical Association 2004 ；99 :909_917)预处理后，过滤 Affymetrix GeneChip数据，以排除具有低变异性、低信号或弱探针标记(annotation)的探针集。特异性过滤基因，以获得可以在人的体液中检测和可以在患者中以无损伤的方式监测的分泌的候选者。通过每个探针集的表达数据的线性模型分析来鉴定在药物处理的细胞和未处理或对照处理的细胞之间差异表达的基因，然后进行中等t检验(moderated t-test) (Smyth GK, Stati stical Applications in Genetics and Molecular Biology2004 ；3 Article 3)。响应 DI-17E6 而上调的基因包括 ADAMTS1, ADAMTS9, SERPINB2, SERPIND2, STCl, ADAMl5, SRPX, C0R01C, PBEFl，LTB4DH，IL15RA, ΕΝΡΡ4, PLAUR, LAMA5, TNFRSF1A, CLU, T0R3A, ILlRLl，ILlRl，TCN2，VEGFC, LMNA, CTSL, ΡΤΧ3, NCL, GUSB, CLEC3B, IL8, GPX3, CXCLl，SDFRl， STAT1，CDCA7.。响应西仑吉肽而上调的基因包括 ADAMTS9、DAF、STC1、ADAMTS1、LAMA5、TCN2、SRPX、 ADAMl5、GUSB、HYAL2、PLAUR、CD40、NOTCHl、ENPP4。响应 DI-17E6 而下调的基因包括 INHBA、EDN1、MCP1、MMP10，AUTS2, LIPG, PDGFB, BMP4，MGP，HTRAl，FBLN5，HHIP，C0L4A1，GALNT，MMP2，IL13RA1，MFAP2，NTN4，DKK3. SERPINE2, C0L5A1, CHSTl，PGF, EFNA4, BCHE, ENG, RORl，ANGPTL4, ESMl，CUBN, IGFBP7, CYR61, FLT4, SPOCK，C0L12A1, LTBP1，MMP28, TMEM4, CTSB，C0L1A2, GRP124，SPARC.。响应西仓吉肽而下调的基因包括 INHBA、EDNl、FST、DKK4，BMP4, MCPl，HHIP，NTN4, PHLDB2, PVR, CYR61, AUTS2, MERTK, FSTL3, APLN, PTX3, ANGPTL4, CTGF，SPOCK, IL8, NRGl， DKK3, CD44, BCHE, BDNF, FBX04, EFEMPl，STC2.。在给定的条件下显示超常的反应/反应变化/反应性的基因有下划线。按照本发明的定义，该基因的基因和基因产物还包括引出相同功能活性的同源序列；尤其涉及与该原始序列具有超过80%，优选超过90%和尤其是超过95%同源性的序列。因此，具有以下同源性的序列是本发明的主题80%、81%、82%、83%、84%、85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 和 99%。在蛋白质水平上分析了在RNA水平上受任一整联蛋白抑制剂高度显著调节的基因。由于分泌的生物标志是相关的，在整联蛋白抑制剂处理的细胞的上清中分析了个体候选者。用DI-17E6或西仑吉肽处理HUVEC。在不同时间后，收集培养物上清，并通过Western 印迹、ELISA或Luminex分析不同的生物标志候选者。与对照细胞相比较，评价了药物诱导的生物标志调节。在不同的候选者中，发现响应整联蛋白抑制剂而调节了 ADAMTS1、STC-1、 MCP-I、IL-8、内皮缩血管肽-1、激活蛋白A和PDGF-BB。Western印迹分析揭示，具有1型血小板反应蛋白基序的ADAM金属肽酶(ADAMTS1)和司腺钙蛋白-I(STC-I)响应用DI-17E6或西仑吉肽处理而上调(图2_4)。 ADAMTS1是存在于胞外间隙中的金属蛋白酶。使用不同的生物系统，已显示了 ADAMTS1抑制血管发生(Vazquez F.等，J Biol Chem 1999 ；274 (33) :23349_57)。STC-1 是分泌糖蛋白，最初在硬骨鱼中将其描述为涉及钙和磷酸盐稳态的激素。它在包括血管发生的许多生理过程中发挥作用，并已针对STC-I描述了促血管发生和抗血管发生活性二者(FilvarofT EH.等，Endocrinology 2002 ；143 3681-90 ；Zlot C.等，J BiolChem. 2003 ；278 (48) 47654-9)。通过Luminex分析了单核细胞趋化蛋白_1 (MCP-1/CCL2)和白细胞介素-8(IL_8/ CXCL8)。MCP-I响应DI-17E6和西仑吉肽而下调(图5)。相反，IL-8由两种整联蛋白抑制剂有差别地调节。IL-8响应DI-17E6而上调，而西仑吉肽诱导此趋化因子的下调(图 6)。MCP-I在巨噬细胞的招募和活化中发挥关键作用。它是将促血管发生的巨噬细胞吸引至肿瘤的关键激动剂之一。在小鼠中，MCP-I的抑制减少血管发生和肿瘤生长(KogaM等， Biochem Biophys Res Commun. 2008 ；365 (2) :279_84)。最初针对其白细胞趋化活性表征了 IL-8/CXCL8，已知它具有肿瘤发生和促血管发生特性(Xie K等，Cytokine Growth Factor Rev 2001 ； 12 (4) 375-91)。
通过ELISA分析了激活蛋白Α、内皮缩血管肽-I(EDN-I)和血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)。三种蛋白质都响应DI-17E6和西仑吉肽而下调(图7-9)。Ε·1介导包括血管发生的多种肿瘤促进活性。它调节整联蛋白偶联性激酶(ILK)(传递由整联蛋白引起的胞内信号发放的多结构域黏着斑蛋白质)(Rosano L.等，Mol Cancer Ther. 2006 ； 5(4) :833-42)。激活蛋白A(两个抑制素βΑ亚基的同二聚体)是激活蛋白/抑制素家族的成员，该家族隶属于转化生长因子-β (TGF-β)超家族。它发挥广谱的生物活性，包括发育和生殖过程、炎症、癌症和血管发生。激活蛋白A在调节血管发生中的作用是有争议的(contrive)，因为已描述了促血管发生功能和抗血管发生功能二者(Panopoulou E 等，Cancer Res. 2005 ；65 (5) 1877-86 ；Poulaki V.等，Am J Pathol. 2004 ； 164 (4) 1293-302)。PDGF-BB 是 4 个 PDGF 配体(PDGF-A、PDGF-B, PDGF-C 和 PDGF-D)之一 (Fredriksson L等，Cytokine Growth Factor Rev. 2004 ； 15 197-204)。它隶属于配体和受体的VEGF/PDGF超家族，根据它们接近的序列同源性和进化关系分组在一起。PDGF-BB常以高水平表达于多种肿瘤组织中(Nguyen Μ.等，J. Natl. Cancer Inst. 1994 ;86 :356_361)。 它是周细胞的促细胞分裂因子和趋化因子，并在血管壁组装期间在调节血管细胞中发挥重要作用(Lindahl P 等，Science 1997 ；277 :242_245)。分析了鉴定的生物标志响应其他不同的血管发生抑制剂(舒尼替尼和索拉非尼) 的调节，以确定鉴定的生物标志是否广泛地与血管发生抑制相关。两种抑制剂都是通过与激酶的结合ATP的催化位点结合，经不相关的作用机制起作用的小分子多激酶抑制剂 (Morabito A 等，Current statusand Future oncologist 2006 ； 11 :753_764)。用舒尼替尼和索拉非尼处理后，在内皮细胞上清中分析了生物标志候选者的水平。如针对整联蛋白抑制剂所观察到的，几个生物标志响应这些激酶抑制剂而调节。例如， STC-I响应任一药物而下调(图10)，而EDm上调(图11)。有趣地，针对整联蛋白抑制剂观察到了相反的调节。IL-8由任一激酶抑制剂有差别地调节。处理后，索坦(Sutent)引起此趋化因子的上调，而索拉非尼降低了蛋白质水平(图12)。在整联蛋白抑制剂的情况下，也观察到了有差别的调节。这些数据一起显示，鉴定的生物标志可以用于监测整联蛋白抑制剂以及激酶抑制剂的活性。但是，可以预期对内皮细胞稳态的不同作用，因为以不同的方式调节各蛋白质，且可以导致不同的生物学反应。由于所有药物都经不同的作用机制起作用，调节不同生物标志中所涉及的途径可能在不同抑制剂之间不同。 概括而言，已在内皮培养物的基因表达谱中鉴定了与整联蛋白抑制剂的药效相关的药物特异性生物标志。将鉴定的候选者中的几个确认为细胞上清中受药物调节的蛋白质，表明可以在体液中检测它们。这些候选者中的一些还受不相关的多激酶抑制剂调节，表明可以在广义上应用该生物标志来监测对内皮细胞稳态和血管发生的作用。2.利用体内血管发生模型鉴定受药物调节的血浆生物标志在此模型中，通过血管发生生长因子bFGF在基质胶填料(matrigelplug)中诱导血管发生。将含有bFGF的基质胶填料皮下植入健康食蟹猴(Cynomologus)的腹部，然后立即按不同的剂量对该动物静脉内注射DI-17E6。基质胶植入后，通过定量该基质胶填料中的血红蛋白含量来进行血管发生的评价。在植入基质胶填料的不同动物中测试每个条件。发现在所有剂量下，用DI-17E6处理猴都阻断了新血管的形成(图13)。为了鉴定与DI-17E6的PD作用相关的生物标志，在处理前和处理后收集血浆样品。通过与各标准比较，通过Luminex测量了不同蛋白质的绝对浓度。通过对数转化预处理原始数据，并通过在每个时间点将DI-17E6处理组与安慰剂处理的动物相比较，在t检验分析中检查了 DI-17E6的作用。显著受调节的蛋白质包括C反应蛋白(CRP)和IL-6、CD40配体和MMP9。CRP和IL-6 响应用DI-17E6处理而上调(图14)。相反，在对照组中，特异性调节了⑶40配体和MMP9。 144小时后，在安慰剂处理的动物中，⑶40配体下调，而MMP9上调(图15)。CRP是炎症的标志及急性期反应的关键介质(P印ys MB等，Adv Immunol 1983;34:141-212)。它识别损伤的细胞，通过与免疫系统相互作用起始它们的清除，并因此可以涉及去除响应DI-17E6 处理而已损伤的细胞。IL-6是与血管发生和肿瘤生长相关的多效细胞因子(Keller ET 等，Front. Biosei. 1996. 1 :340_357 和 Ancrile B 等，Genes Dev. 2007 年 7 月；21 (14) 1714-9)。IL-6响应DI-17E6处理的上调似乎与其药理学活性矛盾，但可以反映已针对其他血管发生抑制剂观察到的调节反馈环。CD40配体是结构上与肿瘤坏死因子-α相关的跨膜蛋白质。它是促进炎症、血栓形成和新血管发生的促炎症和促凝血因子(Ferroni P等， Curr Med Chem. 2007 ； 14(20) :217_80)。最后，ΜΜΡ9隶属于在介导胞外环境稳态中发挥作用的基质金属蛋白酶家族。已描述了促肿瘤发生活性和抗肿瘤发生活性二者(Egeblad M 等，Nature Rev. Cancer 2002 ；2 :161_174)。它调节新血管重建和促进肿瘤生长(Seandel M 等，Cancer Cell 2008 ； 13 (3) :181_3)。概括而言，已检测了药物特异性药效血浆生物标志，其可以在人的体液中检测， 且可以用于提供靶调节的概念证据；选择适当的剂量和方案；和潜在地解释或预测临床结果。在所鉴定的生物标志中，CRP和MMP9可以在机械上涉及在DI-17E6处理后阻断血管发生。3.总结在这两项研究中，已鉴定了整联蛋白抑制剂和多激酶抑制剂的几种PD生物标志， 其可以在人的体液中检测，且可以用于提供靶调节的概念证据；提供剂量和方案的合理选择；和潜在地解释或预测临床结果。有趣地，大部分候选者与血管发生相关，并因此可以在机械上涉及在药物处理后阻断血管发生。有趣地，一些生物标志受具有不同作用机制的不相关的药物调节，表明它们可以广泛用于监测对内皮细胞稳态和血管发生的作用，并因此适合应用于不同的药物种类，包括整联蛋白抑制剂(如西仑吉肽、DI-17E6)、VEGF抑制剂 (如Avastin)、多激酶抑制剂(如舒尼替尼、索拉非尼)。附图简述图1 显示完整的DI-17E6轻链(A)和重链(B)序列。可变区有下划线，⑶R为粗体。恒定区中的粗体序列表示修饰的IgGl铰合部及位置296和297上的突变。图2 显示DI-17E6诱导HUVEC上清中的ADAMTS1蛋白质水平。图3 显示西仑吉肽诱导HUVEC上清中的ADAMTS1蛋白质水平。图4 显示DI-17E6和西仑吉肽诱导HUVEC上清中的STC-I蛋白质水平。图5 显示HUVEC中MCP-1响应DI-17E6和西仑吉肽的调节。图6 显示HUVEC中IL-8响应DI-17E6和西仑吉肽的调节。图7 显示HUVEC中PDGF-BB响应DI-17E6和西仓吉肽的调节。图8 显示HUVEC中Ε·1响应DI-17E6和西仑吉肽的调节。图9 显示HUVEC中激活蛋白A响应DI-17E6和西仑吉肽的调节。图10 显示HUVEC中STC-I响应索坦和索拉非尼的调节。图11 显示HUVEC中EDm响应索坦和索拉非尼的调节。图12 显示HUVEC中IL_8响应索坦和索拉非尼的调节。图13 显示DI-17E6在猴中抑制基质胶填料中的血管发生。图14 显示血浆CRP和IL-6响应用DI-17E6处理的调节。图15 显示血浆⑶40配体和MMP9响应用DI-17E6处理的调节。图16 显示整联蛋白特异的信号传导途径的抑制。
实施例实施例1DI-17E6诱导HUVEC上清中的ADAMTS1蛋白质水平将HUVEC培养在玻连蛋白包被的平皿上/中，并与不同浓度的DI-17E6孵育6 小时至72小时。收集培养物上清，通过Western印迹分析ADAMTS1。A)DI_17E6介导的 ADAMTS1 (65kD 和 85kD)调节(图 2)。实施例2西仑吉肽诱导HUVEC上清中的ADAMTS1蛋白质水平将HUVEC培养在玻连蛋白包被的平皿上/中，并与不同浓度的西仑吉肽孵育6 小时至72小时。收集培养物上清，通过Western印迹分析ADAMTS1。A)西仑吉肽介导的 ADAMTS1 (65kD 和 85kD)调节(图 3)。实施例3DI-17E6和西仑吉肽诱导HUVEC上清中的STC-I蛋白质水平将HUVEC培养在玻连蛋白包被的平皿上/中，并与不同浓度的DI-17E6或西仑吉肽孵育24小时至72小时。收集培养物上清，通过Western印迹分析STC-I。A) STC-I响应DI-17E6的调节。B) STC-I响应西仑吉肽的调节(图4)。实施例4 HUVEC中MCP-I响应DI-17E6和西仓吉肽的调节将HUVEC培养在玻连蛋白包被的平皿上/中，并与不同浓度的DI-17E6或西仑吉肽孵育6小时至72小时。收集培养物上清，通过Luminex分析MCP-I。A)MCP-I响应DI-17E6 的调节。B)MCP-1响应西仑吉肽的调节(图5)。实施例5HUVEC中IL-8响应DI-17E6和西仑吉肽的调节将HUVEC培养在玻连蛋白包被的平皿上/中，并与不同浓度的DI-17E6或西仑吉肽孵育6小时至72小时。收集培养物上清，通过Luminex分析IL_8。A) IL-8响应DI-17E6 的调节。B) IL-8响应西仑吉肽的调节(图6)。实施例6HUVEC中PDGF-BB响应DI-17E6和西仓吉肽的调节将HUVEC培养在玻连蛋白包被的平皿上/中，并与不同浓度的DI-17E6或西仑吉肽孵育6小时至72小时。收集培养物上清，通过ELISA分析PDGF-BB。A)PDGF-BB响应 DI-17E6的调节。B) PDre-BB响应西仑吉肽的调节(图7)。实施例7HUVEC中EDNl响应DI-17E6和西仓吉肽的调节将HUVEC培养在玻连蛋白包被的平皿上/中，并与不同浓度的DI-17E6或西仑吉肽孵育6小时至72小时。收集培养物上清，通过ELISA分析EDm。Α)Ε·1响应DI-17E6 的调节。B) EDm响应西仑吉肽的调节(图8)。实施例8HUVEC中激活蛋白A响应DI-17E6和西仑吉肽的调节将HUVEC培养在玻连蛋白包被的平皿上/中，并与不同浓度的DI-17E6或西仑吉肽孵育6小时至72小时。收集培养物上清，通过ELISA分析激活蛋白A。A)激活蛋白A响应DI-17E6的调节。B)激活蛋白A响应西仑吉肽的调节(图9)。实施例9HUVEC中STC-I响应索坦和索拉非尼的调节将HUVEC培养在玻连蛋白包被的平皿上/中，并与不同浓度的索坦或索拉非尼孵育6小时至48小时。收集培养物上清，通过Western印迹分析STC-I。A) STC-I响应索坦的调节。B) STC-I响应索拉非尼的调节(图10)。实施例10HUVEC中EDm响应索坦和索拉非尼的调节将HUVEC培养在玻连蛋白包被的平皿上/中，并与不同浓度的索坦或索拉非尼孵育6小时至48小时。收集培养物上清，通过ELISA分析EDm。Α)Ε·1响应索坦的调节。B) EDNl响应索拉非尼的调节(图11)。实施例11HUVEC中IL-8响应索坦和索拉非尼的调节将HUVEC培养在玻连蛋白包被的平皿上/中，并与不同浓度的索坦或索拉非尼孵育6小时至48小时。收集培养物上清，通过Luminex分析IL_8。A) IL-8响应索坦的调节。 B) IL-8响应索拉非尼的调节(图12)。实施例 12DI-17E6在猴中抑制基质胶填料中的血管发生通过DI-17E6在猴中抑制基质胶填料中的血管发生。在食蟹猴中诱导含有5 μ g/ mL bFGF的皮下基质胶植入物中的血管发生。按100、30、10或3mg/kg作为单次输注提供 DI-17E6。6天后，通过测量基质胶填料中的血红蛋白含量来定量血管发生。*表示ρ值 < 0. 05，**表示 ρ 值< 0. 01 (图 13)。实施例13血浆CRP和IL-6响应用DI-17E6处理的调节将含有bFGF的基质胶填料植入食蟹猴，并用不同浓度的DI-17E6处理6天。收集血浆，通过Luminex分析CRP和IL-6。A) CRP的调节。B) IL-6的调节(图14)。实施例14血浆⑶40配体和MMP9响应用DI-17E6处理的调节A)将含有bFGF的基质胶填料植入食蟹猴，并用不同浓度的DI-17E6处理6天。 收集血浆，通过Luminex分析⑶40配体和MMP9。A)⑶40配体的调节。B)MMP9的调节(图 15)。实施例15整联蛋白特异的信号传导途径的抑制除生长因子刺激外，整联蛋白介导的与胞外基质的黏着对促进细胞增殖、存活和迁移也是重要的。通过整联蛋白连接而诱导广范围的胞内信号发放事件，包括Ras、MAPK、 FAK,Src,Rac/Rho/cdc42GTP酶的活化。为了在血管发生期间支持内皮细胞的存活，整联蛋白α (ν) β (3)/(5)与FAK—起为MAPK级联(即ERK1/2)的持续活化所需。在此研究中，已分析了两种整联蛋白抑制剂DI-17E6和西仑吉肽对内皮细胞中整联蛋白介导的信号传导途径的作用。为了此目的，将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种在玻连蛋白上，以活化α (ν) β (3)整联蛋白，然后用培养基或不同浓度的DI-17E6或西仑吉肽处理。处理24小时后，制备细胞裂解物并通过Western印迹分析。为了解释细胞脱附引起的潜在作用，通过比较各信号发放分子的磷酸化水平与总水平之比来评价对信号传导途径的作用。如所见，浓度从 0. 01 μ g/mL至10 μ g/mL的DI-17E6和浓度从0. 01 μ M至10 μ M的西仑吉肽以剂量依赖的方式阻断FAK和ERK1/2的活化(图16)。
权利要求
1.用于利用选自ADAMTSU STCU EDNU MCPU IL8、PDGF-BB, CRP、CD40 配体和 IL6 的至少一种选择性生物标志基因或其基因产物来测量整联蛋白抑制剂、VEGF抑制剂或小分子 ATP位点定向多激酶抑制剂对血管发生的作用，和/或这类抑制剂对血管发生相关疾病的治疗功效的离体方法，所述方法包括步骤(a)通过技术手段和/或装置在体液和/或组织样品中测量至少一种所选生物标志的基线浓度和/或修饰状态，其中所述样品获自尚未用所述抑制剂处理的个体；(b)通过技术手段和/或装置在获自已用所述抑制剂处理的个体的样品中或在随后的步骤中通过所述抑制剂处理的(a)的样品中测量的(a)中所选生物标志的浓度和/或修饰状态；(c)通过技术手段和/或装置测量由步骤(a)和(b)获得的所选生物标志的浓度和/ 或修饰状态之间的差异；(d)从步骤(c)获得的所述差异测定所述抑制剂的一个或多个以下特性或参数-对所述分子靶标和对与所述分子靶标相关的各信号传导途径的药效；-对血管发生的作用；-在患有血管发生相关疾病的患者中的治疗功效和临床结果；和可选地(e)重复步骤 (a)至(d)，直到获得希望的特性/参数；从而允许在个体中评估就对血管发生的作用或治疗功效、安全性、预后或所述抑制剂的剂量或血管发生相关疾病而言的临床测量结果和活性。
2.权利要求1的离体方法，其中所述获取的体液样品是血液、血浆、血清、淋巴、尿液、 泪、滑液、创伤液和/或脑脊液。
3.权利要求1的方法，其中所述组织样品包含患病组织或健康组织。
4.权利要求1的方法，其中所述组织样品选自癌组织、皮肤组织和/或滑膜组织。
5.权利要求1的离体方法，其中从所述获取的组织样品制备内皮细胞。
6.权利要求5的方法，其中在已从个体获得并从组织样品制备所述内皮细胞后，将它们培养在实验室条件下，其中从细胞培养基或来自所述细胞的提取物测定至少一种生物标
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述整联蛋白抑制剂是α(ν)整联蛋白抑制剂， 且是重组单克隆抗体或RGD肽。
8.权利要求7的方法，其中所述抑制剂是mAbDI-17E6或RGD肽西仑吉肽。
9.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述小分子ATP位点定向多激酶抑制剂是舒尼替尼和/或索拉非尼。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述内皮细胞和/或体液样品衍生自健康个体和/或患有肿瘤障碍和/或其他血管发生相关疾病的患病个体。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述血管发生相关疾病是癌症或癌症相关疾病。
12.权利要求1-11的方法，其中所述生物标志由于施用所述整联蛋白抑制剂或小分子 ATP位点定向多激酶抑制剂而在其水平中和/或在修饰状态中下调或上调。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述生物标志是ADAMTS1和/或STCl或其基因产物，且由于施用所述整联蛋白抑制剂而上调。
14.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述生物标志是MCP1、INHBA、EDNl和/或 PDGF-BB或其基因产物，且由于施用所述整联蛋白抑制剂而下调。
15.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述生物标志是IL8或其基因产物，且由于施用西仑吉肽或索拉非尼而下调，并由于施用DI-17E6或舒尼替尼而上调。
16.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述生物标志IL6和/或CRP由于施用 DI-17E6而上调。
17.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述生物标志⑶40配体由于施用DI-17E6而下调。
18.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述生物标志STCl由于施用小分子ATP定向多激酶抑制剂而下调。
19.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述生物标志EDm由于施用小分子ATP定向多激酶抑制剂而上调。
20.用于利用选自ADAMTSU STCl、EDNl、MCPl、IL8、PDGF-BB, CRP、CD40 配体和 IL6 的至少一种选择性生物标志或其基因产物在基于细胞的模型中筛选整联蛋白调节化合物的方法，所述方法包括步骤(a)通过技术手段和/或装置在体液或组织样品中测量至少一种所选生物标志的基线浓度和/或修饰状态，其中所述样品获自尚未用所述整联蛋白调节化合物处理的个体；(b)通过技术手段和/或装置在获自已用所述整联蛋白调节化合物处理的个体的样品中测量(a)中所选生物标志的浓度和/或修饰状态；(c)通过技术手段和/或装置测量通过步骤(a)和(b)获得的所选生物标志的浓度和 /或修饰状态之间的差异；和(d)从步骤(c)获得的所述差异测定在所述细胞测定中影响血管发生的调节的整联蛋白调节化合物的特性或参数。
21.选自ADAMTSU STCl、EDNl、MCPl、IL8、PDGF-BB, CRP、CD40 配体和 IL6 的生物标志基因或其基因产物的用途，其用于评估和预测整联蛋白抑制剂、VEGF抑制剂或小分子ATP 位点定向激酶抑制剂在基于细胞的测定中对血管发生的作用，或这类抑制剂在离体条件下的功效和/或剂量。
22.选自ADAMTSU STCU EDNU MCPU IL8、PDGF-BB, CRP、CD40 配体和 IL6 的生物标志基因或其基因产物的用途，其用于制备整联蛋白抑制剂或小分子ATP位点定向激酶抑制剂，所述整联蛋白抑制剂或小分子ATP位点定向激酶抑制剂用于在对这些生物标志中的至少一种反应的患者中治疗癌症。
全文摘要
本发明涉及用于通过使用某些鉴定的生物标志来评估整联蛋白抑制剂和小分子ATP位点定向多激酶抑制剂对血管发生的作用的方法。此方法对测定主要用于治疗血管发生相关疾病如癌症的整联蛋白抑制剂和小分子ATP位点定向多激酶抑制剂的功效尤其有益。尤其是，本发明涉及与血管发生相关的生物标志，其优选是在体液中可及的，并因此允许以无损伤的方式分析靶调节。还公开了该生物标志在筛选具有整联蛋白抑制活性的化合物中的用途。
文档编号G01N33/574GK102265156SQ200980152028
公开日2011年11月30日 申请日期2009年12月14日 优先权日2008年12月23日
发明者J·拜伦斯 申请人:默克专利有限公司