专利名称：植物抗病相关蛋白xa5PG1及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种植物抗病相关蛋白xa5PGl及其编码基因和应用。
背景技术：
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米为主要食物。全球每年因水稻白叶枯病造成的水稻减产达11 % 30 %，严重时减产达40 % 50 %，甚至颗粒无收。一般认为水稻抗病品种的应用是降低水稻病害的最为经济有效和绿色环保的办 法。目前，已从水稻中至少鉴定了 30个白叶枯病抗性基因，其中有显性基因，也有隐性基因。AP2/EREBP是ー个多基因家族，其编码的蛋白因含有ー个约50-60个氨基酸残基的保守结构域。其家族成员因具有AP2/EREBP结构域而得名，按照所包含的保守结构域数目的差异，该家族成员被进一步归类到EREBP亚家族(含I个AP2/EREBP结构域)和AP2亚家族(含2个AP2/EREBP结构域)，它们的功能涉及植物生长发育调控和对逆境应答等许多方面。在不同的逆境条件下，像干旱、低温、高盐、水害、病害等，AP2类转录因子会对生物和非生物胁迫做出相应的响应。目前在多种在植物中鉴定到该家族成员，如拟南芥中有147个成员，葡萄中有132个成员，白杨中有200个成员，在水稻中有163个成员。
发明内容
本发明的目的是提供ー种植物抗病相关蛋白xa5PGl及其编码基因和应用。本发明提供的植物抗病相关蛋白(xa5PGl蛋白)，来自水稻品种IRBB5，属于AP2类转录因子，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由序列I衍生的蛋白质。
序列表中的序列I由187个氨基酸残基组成。为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表I所示的标签。表I标签的序列
标签残基序列
Poly-Arg5-6 (通常为 5 个) RRRRR
Poly-His2-10 (通常为 6 个) HHHHHH
FLAGΓ 8Γ DYKDDDDK '
Strep-tag II 8WSHPQFEK
c-myc10EQKLISEEDL上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失ー个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行ー个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表I所示的标签的编码序列得到。编码所述蛋白的基因(xa5PGl基因)也属于本发明的保护范围。所述基因可为如下I)至5)中任一所述的DNA分子I)序列表中序列2自5’末端第131至694位核苷酸所不的DNA分子； 2)序列表中序列2所不的DNA分子；3)序列表中序列3所示的DNA分子；4)在严格条件下与I)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码植物抗病性相关蛋白的DNA分子；5)与I)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物抗病性相关蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在O. I X SSPE (或O. I X SSC)，O. I % SDS的溶液中，在65°C条件下杂交并洗膜。含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它參与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可単独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体吋，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述重组表达载体具体可为在植物双元表达载体pZHOl的多克隆位点插入序列表的序列2自5’末端第131至694位核苷酸所示DNA得到的重组质粒。扩增所述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述蛋白或所述基因可用于培育抗病植物。所述植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述单子叶植物具体可为水稻(如水稻品种TP309)。所述抗病具体可为抗白叶枯病(如菲律宾小种PX086引起的白叶枯病)。所述抗病具体可为抗菲律宾小种PX086引起的病害(如白叶枯病)。本发明还保护ー种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到抗病性高于所述目的植物的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。携帯有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述单子叶植物具体可为水稻(如水稻品种TP309)。所述抗病具体可为抗白叶枯病(如菲律宾小种PX086引起的白叶枯病)。所述抗病具体可为抗菲律宾小种PX086引起的病害(如白叶枯病)。本发明利用接菌后的水稻材料进行芯片分析，在水稻品种IRBB5(含纯合隐性抗病基因xa5的抗病材料)中鉴定到xa5基因特异启动的抗病关键基因。用本发明提供的基 因构建强启动子驱动的重组质粒，并转化到感病水稻材料，可以获得抗病性明显增强的转基因水稻，打破了传统上利用隐性抗原的限制，极大地提高了隐性抗病基因的利用效率。本发明对于培育抗病水稻具有重大应用前景。
图I为芯片预测基因xa5PGl的Northern-blot图；IR24为感白叶枯病水稻，IRBB5为抗白叶枯病水稻。图2为PCR扩增xa5PGl基因电泳图。图3为重组质粒pZH01_xa5PGl的结构示意图。
图4为转基因植物的潮霉素抗性基因鉴定图。图5为转基因植物的xa5PGl基因鉴定图。图6为转基因植物的抗病表型。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。水稻品种IRBB5(抗白叶枯病水稻)菲律宾国际水稻所。水稻品种TP309:菲律宾国际水稻所。植物双元表达载体pCAMBIA1300 :购自CAMBIA(http://www. cambia. org/daisy/cambia/home, html) 水稻品种日本睛购自日本 RGRC(Centerhttp://www. rgrc.dna.afire, go. jp/index, html. en ；Rice benome Resourceノ。植物双兀表达载体pZHOl :公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；參考文献Plant Molecular Biology, 2003, 52 :957-966 ;植物双元表达载体 pZHOl 约lOOOObp，来源于 pCAMBIA1300)。农杆菌EHA105 :公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；參考文献Plant Molecular Biology, 2003, 52 :957_966。
水稻白叶枯病菌菲律宾小种PX086(菲律宾小种PX086):公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；參考文献=Mol Genet Genomics. 2006,275(4) :354_66。实施例I、植物抗病相关蛋白及其编码基因的发现I、水稻IRBB5剪叶法接菌取材料。2、提取接种白叶枯病小种PX086的水稻RNA进行芯片分析。3、获得表达水平显著上调的ー个AP2类蛋白。将序列表的序列I所不的蛋白质命名为xa5PGl蛋白。将xa5PGl蛋白的编码基因命名为xa5PGl基因，其cDNA如序列表的序列2所不(开放阅读框为序列表的序列2自5’末端第131至694位核苷酸)，基因组DNA如序列表的序列3所示。 4、对接种PX086的水稻感抗材料IR24和IRBB5进行Northeren_blot分析,确定xa5PGl的表达模式(图I)。研究发现，水稻品种日本隋中也具有序列相同的xa5PGl基因，该基因在接种PX086小种后的日本睛中的表达模式与IR24相似，不受小种特异诱导上调。实施例2、转基因植物的获得—、重组表达载体的构建I、提取水稻品种IRBB5的总RNA，反转录为cDNA。2、以步骤I的cDNA为模板，用PGl-F和PGl-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PGl-F 5/ -ctctagaATGCCTCGCCGAGCTCCGCCAC-3/ ；PGl-R 5/ -cgtcgacCTATTCCAACGGCTGGGATCTAATC-3'。PCR 扩增体系(25 μ I) :10XPCR 缓冲液 2. 5 μ 1，dNTP Mixture (2. 5mM) 2. 5 μ I,KOD 酶(5U/μ 1)0. 2 μ 1，PGl-F(IOmM)O. 25 μ 1，PGl-R(IOmM)O. 25 μ 1，模板(DNA) I μ 1，MgSO4(25mM) I. 6 μ I, DMSO I. 6 μ I, ddH20 15. I μ I。PCR扩增条件先95°C预变性5min ;然后95°C变性30s，58°C退火30s，68°C延伸Imin，共30个循环；最后68°C延伸5分钟。PCR扩增产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测，见图2。获得约600bp左右的条带。回收PCR扩增产物与pEasy-Blunt载体(购于全式金公司)连接，得到重组质粒pEasy-PGl。重组质粒pEasy-PGl的测序结果表明，在peasy-Blunt载体中插入了序列表的序列2自5’末端第131至694位核苷酸所不的DNA(564bp)。3、用限制性内切酶XbaI和SalI酶切步骤2中的pEasy-PGl质粒，回收约600bp的酶切产物。4、用限制性内切酶XbaI和SalI酶切植物双元表达载体pZHOl，回收载体骨架(约IOOOObp)。5、将步骤3的酶切产物与步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pZH01_xa5PGl。根据测序鉴定，对重组质粒pZH01-xa5PGl的结构描述如下在植物双元表达载体pZHOl的XbaI和SalI酶切位点间插入了序列表的序列2自5’末端第131至694位核苷酸所示的DNA。重组质粒pZH01-xa5PGl的结构示意图见图3 (外源DNA处于35S启动子控制下；骨架上具有潮霉素抗性基因)。ニ、转基因植物的获得
利用农杆菌EHA105介导将重组质粒pZH01_xa5PGl导入到水稻品种TP309 (转基因具体方法见Plant Molecular Biology, 2003, 52 :957-966)，得到转基因水稻。共获得了6个T0代转基因水稻株系(0E1、0E2、0E3、0E4、0E5和0E6)。三、转空载体植物的获得利用农杆菌EHA105介导，将植物双元表达载体pZHOI导入到水稻品种TP309，得到转空载体水稻，作为转基因水稻的对照。共获得了 8个Ttl代转空载体水稻株系(CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7 和 CK8)。四、转基因植物的分子水平鉴定I、潮霉素抗性基因鉴定将水稻品种TP309 (TP309)，I个Ttl代转空载体水稻株系(CKl)、6个Ttl代转基因水 稻株系((^1、(^2、(^3、(^4、(^5和(^6)分别提取基因组DNA进行潮霉素抗性基因鉴定(采用HYGF和HYGR组成的引物对，靶序列约800bp)。HYGF 5/ -GACGGTGTCGTCCATCACAGTTT-3;；HYGR 5/ -ACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAA-3'。鉴定结果见图4。6个Ttl代转基因水稻株系和I个Ttl代转空载体水稻株系都为阳性结果，水稻品种TP309为阴性結果。2、xa5PGl 基因鉴定将水稻品种TP309 (TP309)，I个Ttl代转空载体水稻株系(CKl)、6个Ttl代转基因水稻株系(0E1、0E2、0E3、0E4、0E5和0E6)分别提取总RNA，反转录为cDNA后进行xa5PGl基因表达分析(采用PGl-F和PGl-R组成的引物对，扩增靶序列约600bp)。以Actin为检测内參(采用ActinF和ActinR组成的引物对,祀序列约660bp)。ActinF 5/ -AGCAACTGGGATGATATGGA-3'；ActinR 5/ -CAGGGCGATGTAGG AAAGC-3'。鉴定结果见图5。所有植株的内參基因均为阳性結果。6个Ttl代转基因水稻株系的xa5PGl基因都为阳性结果，水稻品种TP309和Ttl代转空载体水稻株系的xa5PGl基因为阴性結果。五、转基因植物的抗病性(抗白叶枯病)鉴定对水稻品种TP309 (TP309)，水稻品种IRBB5 (IRBB5)、8个Ttl代转空载体水稻株系(CKI、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7 和 CK8)、6 个 Ttl 代转基因水稻株系(0EI、0E2、0E3、0E4、0E5和0E6)的植株分别进行白叶枯病抗病性鉴定(接种方法參考“Testifying the ricebacterial blignt resistance gene xa5 by genetic complementation and furtheranalyzing xa5 (Xa5) in comparison with its homo log TFI IAgammal，.又早(Mo I GenetGenomics. 2006,275(4) :354-66)):在分蘖期用剪叶法在水稻的叶片上接种菲律宾小种PX086，接种后7天到15天进行连续观察。结果发现，6个转基因株系和水稻品种IRBB5具有显著的水稻白叶枯病抗性。水稻品种TP309和8个Ttl代转空载体水稻株系具有明显的发病表型。接种15天后部分植物的照片见图6。
权利要求
1.一种培育转基因植物的方法，是将xa5PGl蛋白的编码基因导入目的植物中，得到抗病性高于所述目的植物的转基因植物； 所述xa5PGl蛋白是如下(a)或(b) (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由序列I衍生的蛋白质。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述xa5PGl蛋白的编码基因是如下I)至5)中任一所述的DNA分子 1)序列表中序列2自5’末端第131至694位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)序列表中序列3所示的DNA分子； 4)在严格条件下与I)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码植物抗病性相关蛋白的DNA分子； 5)与I)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物抗病性相关蛋白的DNA分子。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述xa5PGl蛋白的编码基因通过重组表达载体导入所述目的植物中；所述重组表达载体为在植物双元表达载体PZHOl的多克隆位点插入序列表的序列2自5’末端第131至694位核苷酸所示DNA得到的重组质粒。
4.如权利要求I至3中任一所述的方法，其特征在于所述抗病为抗白叶枯病；所述目的植物为单子叶植物；所述单子叶植物优选为水稻。
5.如权利要求I至3中任一所述的方法，其特征在于所述抗病为抗菲律宾小种PX086引起的病害。
6.一种蛋白质，是如下(a)或(b) (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由序列I衍生的蛋白质。
7.编码权利要求6所述蛋白的基因，是如下I)至5)中任一所述的DNA分子 1)序列表中序列2自5’末端第131至694位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)序列表中序列3所示的DNA分子； 4)在严格条件下与I)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码植物抗病性相关蛋白的DNA分子； 5)与I)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物抗病性相关蛋白的DNA分子。
8.含有权利要求7所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
9.扩增权利要求7所述基因的全长或其任一片段的引物对。
10.权利要求6所述蛋白或权利要求7所述基因在培育抗病植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种植物抗病相关蛋白xa5PG1及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白如序列表的序列1所示。将所述蛋白的编码基因导入目的植物中，可以得到抗病性高于所述目的植物的转基因植物。用本发明提供的基因构建重组质粒，并转化到感病水稻，可以获得抗病性明显增强的转基因水稻，打破了传统上利用隐性抗原的限制，极大地提高了隐性抗病基因的利用效率。本发明对于培育抗病水稻具有重大应用前景。
文档编号C12N5/10GK102676572SQ20111006046
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月14日 优先权日2011年3月14日
发明者尹德东, 江光怀, 翟文学 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所