本发明涉及检测领域，尤其涉及一种脑蛋白水解物口服液的检验方法。
背景技术：
：“脑蛋白水解物”是健康猪脑组织酶解后经纯化的提取物，主要含多种氨基酸、神经多肽基因、核苷酸、神经递质、神经营养因子及脑磷脂、卵磷脂等生物活性成分，是调控神经发育、决定神经细胞分化及轴索伸展方向的物质。“脑蛋白水解物”能以多种方式作用于中枢神经，调节和改善神经元的代谢，促进突触形成，诱导神经元的分化，并进一步保护神经细胞，使其免受各种缺血、低氧和神经毒素的损害。经纯化的“脑蛋白水解物”易通过血-脑脊液屏障，促进脑内蛋白质的合成，影响呼吸链，具有抗低氧能力，改善脑内能量代谢，激活腺苷酸环化酶和催化其他激素系统，提供神经递质肽类激素及辅酶前体，具有促进神经纤维生长的类神经生长因子功能，改善病变区脑细胞功能，是一种治疗脑神经功能障碍的药物。“脑蛋白水解物”主要成分是动物脑脱脂后再经蛋白酶降解产生的含有游离氨基酸和分子量在10000以下的小分子肽等的混合物。究其药理，“脑蛋白水解物”由于其分子小能够透过血脑屏障，可促进脑细胞DNA合成、修复与再生，刺激脑蛋白合成，影响脑神经细胞的呼吸偶联；激活腺苷酸环化酶并催化其他激素系统；参与α-酮酸的氧化脱羧和葡萄糖代谢，提高脑氧及葡萄糖利用度，供给脑细胞修复再生所需的作为神经递质本身或神经递质和生物胺类的前体的各种氨基酸，调节脑神经活动，促进中枢递质γ-氨基丁酸，多巴胺和5-羟色胺等生物合成；与游离氨结合成无毒的谷氨酰胺，降低血氨；同时改善肾上腺皮质机能，促进全身代谢。临床用于治疗脑发育不全，脑萎缩，神经衰弱、脑外伤综合症，中枢神经系统感染，脑膜炎，老年性痴呆、抑郁症，精神病，脑血管代谢失调等多种疾病，同时能有效增强学习记忆力和机体应激能力，疗效显著且安全无毒副作用。由此可见，药物中含有的小分子肽和游离氨基酸物质是产生药效的主要成分。为了提高脑蛋白水解物口服液的疗效以及质量，需要对其游离氨基酸的含量进行测定，以提高药物的质量控制标准，保证药品疗效。但目前的检验方法准确性差，重复性不佳。因此，现有技术还有待于改进和发展。技术实现要素：鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种脑蛋白水解物口服液的检验方法，旨在解决现有的脑蛋白水解物口服液检验方法准确性和重复性不佳的问题。本发明的技术方案如下：一种脑蛋白水解物口服液的检验方法，其中，包括步骤：A、准备衍生试剂：吸取1.0ml无水乙腈并加入到AQC试剂中，然后摇10秒，再放入55℃烘箱加热至粉末完全溶解，得到衍生试剂；B、先将两个250μl内衬管分别放入两个2ml液相样品瓶中，用移液枪吸取氨基酸对照品溶液和脑蛋白水解物口服液各10μl放入内衬管底部，再分别加入70μl硼酸盐缓冲液，放在旋涡振荡器中旋涡1min，再分别加入20μl衍生试剂，放在旋涡振荡器中旋涡5min后，于55℃烘箱放置10分钟后，取出冷至室温，分别吸取10μl注入液相色谱仪进行测定；其中所述液相色谱仪采用C18柱，流速为每分钟1.5ml，流动相包括流动相A、流动相B和流动相C；所述流动相A制备方法如下：将无水醋酸钠11.48g加水溶解并稀释至1000ml，然后用稀磷酸调节pH至4.45；所述流动相B制备方法如下：体积比为60：40的乙腈和水配制而成；所述流动相C制备方法如下：将无水醋酸钠11.48g加水溶解并稀释至1000ml，用稀磷酸调节pH至4.95。所述的脑蛋白水解物口服液的检验方法，其中，所述步骤A之前，还包括：预先制作标准曲线：将250μl内衬管放入2ml液相样品瓶中，用移液枪吸取氨基酸对照品溶液10μl放入内衬管底部，再加入70μl硼酸盐缓冲液，放在旋涡振荡器中旋涡1分钟，再加入20μl衍生试剂，放在旋涡振荡器中旋涡5min后，于55℃烘箱放置10分钟后，取出冷至室温，分别吸取1μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20μl注入液相色谱仪进行测定，得到标准曲线。所述的脑蛋白水解物口服液的检验方法，其中，所述步骤B之后还包括：将6支250μl内衬管分别放入6支2ml液相样品瓶中，用移液枪分别吸取6次氨基酸对照品溶液10μl放入内衬管底部，再分别加入70μl硼酸盐缓冲液，放在旋涡振荡器中旋涡1分钟，再分别加入20μl衍生试剂，放在旋涡振荡器中旋涡5min后，于55℃烘箱放置10分钟后，取出冷至室温，分别吸取10μl注入液相色谱仪进行测定，根据测定结果判断检测方法的精密度。所述的脑蛋白水解物口服液的检验方法，其中，所述步骤B之后还包括：将6支250μl内衬管分别放入6支2ml液相样品瓶中，用移液枪分别吸取6次供试品溶液10μl放入内衬管底部，再分别加入70μl硼酸盐缓冲液，放在旋涡振荡器中旋涡1分钟，再分别精密加入20μl衍生试剂，放在旋涡振荡器中旋涡5min后，于55℃烘箱放置10分钟后，取出冷至室温，分别吸取10μl注入液相色谱仪进行测定，根据测定结果判断检测方法的重复性。有益效果：本发明所提供的检验方法不仅能够有效检验脑蛋白水解物口服液中氨基酸的种类以及含量，同时检验精密度高、重复性好，有利于快速准确的检验脑蛋白水解物口服液。具体实施方式本发明提供一种脑蛋白水解物口服液的检验方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明所提供的一种脑蛋白水解物口服液的检验方法，其包括步骤：S1、准备衍生试剂：吸取1.0ml无水乙腈并加入到AQC试剂中，然后摇10秒，再放入55℃烘箱加热至粉末完全溶解，得到衍生试剂；S2、先将两个250μl内衬管分别放入两个2ml液相样品瓶中，用移液枪吸取氨基酸对照品溶液和脑蛋白水解物口服液各10μl放入内衬管底部，再分别加入70μl硼酸盐缓冲液，放在旋涡振荡器中旋涡1min，再分别加入20μl衍生试剂，放在旋涡振荡器中旋涡5min后，于55℃烘箱放置10分钟后，取出冷至室温，分别吸取10μl注入液相色谱仪进行测定；其中所述液相色谱仪采用C18柱，流速为每分钟1.5ml，流动相包括流动相A、流动相B和流动相C；所述流动相A制备方法如下：将无水醋酸钠11.48g加水溶解并稀释至1000ml，然后用稀磷酸调节pH至4.45；所述流动相B制备方法如下：体积比为60：40的乙腈和水配制而成；所述流动相C制备方法如下：将无水醋酸钠11.48g加水溶解并稀释至1000ml，用稀磷酸调节pH至4.95。脑蛋白水解物口服液可按如下方法进行鉴别：取脑蛋白水解物口服液10ml加水20ml溶解，作为供试品溶液。(1)取供试品溶液5ml，加茚三酮试液数滴，加热，溶液应显蓝紫色。(2)取供试品溶液2ml，加氢氧化钠溶液(6→10)2ml，加碱性枸橼酸铜试液0.2ml，混匀，室温放置15分钟，溶液应显蓝紫色或紫色。脑蛋白水解物口服液的pH值应为6.0～8.0。本发明中的液相色谱仪为高效液相色谱仪。具体用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂【AcclaimC18,120A,(4.6*150nm*5μm)】；流速为每分钟1.5ml；柱温为37℃；检测波长为248nm。洗脱梯度如下表1：表1洗脱梯度对照品溶液的制备：精密称取谷氨酸、缬氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、门冬氨酸、丙氨酸、色氨酸对照品各10mg,分别加水或0.1mol/l盐酸溶液溶解并稀释至10ml，再分别吸取0.5ml置一个容量瓶内，加水稀释至10ml，制成每1ml中各含50μg的溶液。一个具体实例中，对照品的取样量：(g)对照品溶液的浓度为1.0686mg/ml。步骤S1中，衍生试剂可按如下方法准备：WatersAccQTagFluorReagentKit(试剂盒)试剂盒有5组试剂，每组包括3个试剂瓶，1#瓶为pH8.8硼酸盐缓冲溶液，2A瓶为AQC粉末，2B瓶为无水乙腈。临用前，吸1.0ml2B瓶中无水乙腈于2A瓶中(事前将瓶震荡，使粉末完全置于瓶底)，拧紧瓶盖，摇10秒，放入55℃烘箱加热至粉末完全溶解(不得超过10分钟)。然后按照步骤S2的方法进行测定。首先，可确定脑蛋白水解物口服液氨基酸的种类，具体如下：取18种氨基酸对照品，按照对照品溶液制备方法同法操作，再取供试品溶液按照测定方法进行衍生测定，在与对照品图谱中各相应氨基酸对照品保留时间相同的位置，共出现17个峰。由此可知，供试品中共含有17种氨基酸，分别为缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、胱氨酸、赖氨酸、门冬氨酸、组氨酸、谷氨酸。另外，还对本发明的检验方法进行专属性判断，可以先制备阴性对照液：用移液枪吸取水10μl放入内衬管底部，再加入70μl硼酸缓冲液，放在旋涡振荡器中旋涡1分钟，再精密加入20μl衍生试剂，迅速盖紧瓶盖旋涡5min后，于55℃烘箱放置10分钟后，取出冷至室温，作为阴性对照液。吸取阴性对照液10μl注入液相色谱仪进行测定，另外用流动相为空白，并与对照品溶液进行比较。从检测结果可知，阴性对照液对含量测定无影响，方法的专属性良好。进一步，所述步骤S1之前，还包括：预先制作标准曲线：将250μl内衬管放入2ml液相样品瓶中，用移液枪吸取氨基酸对照品溶液10μl放入内衬管底部，再加入70μl硼酸盐缓冲液，放在旋涡振荡器中旋涡1分钟，再加入20μl衍生试剂，放在旋涡振荡器中旋涡5min后，于55℃烘箱放置10分钟后，取出冷至室温，分别吸取1μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20μl注入液相色谱仪进行测定，得到标准曲线，结果如下表2。表2标准曲线测定结果以峰面积为纵坐标，以对照品溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，得标准曲线Y＝204.39X+2.2435，r＝0.9995。说明样品浓度在0.10686μg～2.13720μg之间，与峰面积呈良好的线性关系。进一步，所述步骤S2之后还包括：将6支250μl内衬管分别放入6支2ml液相样品瓶中，用移液枪分别吸取6次氨基酸对照品溶液10μl放入内衬管底部，再分别加入70μl硼酸盐缓冲液，放在旋涡振荡器中旋涡1分钟，再分别加入20μl衍生试剂，放在旋涡振荡器中旋涡5min后，于55℃烘箱放置10分钟后，取出冷至室温，分别吸取10μl注入液相色谱仪进行测定，根据测定结果判断检测方法的精密度，峰面积结果见表3。表3精密度试验结果从上表3可以看出，本发明检验方法的精密度良好。进一步，所述步骤S2之后还包括：将6支250μl内衬管分别放入6支2ml液相样品瓶中，用移液枪分别吸取6次供试品溶液10μl放入内衬管底部，再分别加入70μl硼酸盐缓冲液，放在旋涡振荡器中旋涡1分钟，再分别精密加入20μl衍生试剂，放在旋涡振荡器中旋涡5min后，于55℃烘箱放置10分钟后，取出冷至室温，分别吸取10μl注入液相色谱仪进行测定，根据测定结果判断检测方法的重复性。峰面积结果见表4。表4重复性试验结果从上表4可以看出，本发明检验方法的重复性良好。进一步，所述步骤S2之后还包括：将6支250μl内衬玻璃管分别放入6支2ml液相样品瓶中，用移液枪分别吸取6份已知游离氨基酸含量(1.055mg/ml)的供试品溶液5μl放入内衬管底部，再分别精密加入对照品溶液(1.0686mg/ml)5μl。再分别加入70μl硼酸缓冲液，放在旋涡振荡器中旋涡1分钟，再分别精密加入20μl衍生试剂，迅速盖紧瓶盖旋涡5min后，于55℃烘箱放置10分钟后，取出冷至室温，分别精密吸取10μl注入液相色谱仪进行测定，计算回收率。结果见表5。表5加样回收率试验结果从表5可以看出，回收率均在95％以上，RSD％在3％以内，本发明检验方法的准确性良好。最后取十批供试品(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)，按照此方法分别测定游离氨基酸的含量，结果见表6。表6供试品游离氨基酸含量结果序号批号含量(mg/ml)序号批号含量(mg/ml)1(1)0.666(6)0.962(2)0.847(7)0.943(3)0.848(8)0.964(4)0.869(9)0.905(5)1.0110(10)1.04从表6可以看出，十批样品的游离氨基酸含量均在6.0mg/支以上，所以将游离氨基酸含量测定限度定为每支含游离氨基酸不得少于6.0mg。应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。当前第1页1 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