一种快速测定精氨酸接枝率的方法与流程

本发明涉及测定接枝率的技术领域，特别是一种测定精氨酸接枝率的方法。

背景技术：

胍基，是目前自然界发现的正电性最强的生物活性有机碱，在中性、酸性和碱性条件下均能形成带正电的基团。强正电性的胍基可以与细菌带负电的表面相互作用或能与细菌内部带负电的功能性蛋白、dna、rna等相互作用，从而表现出显著的抑菌性。精氨酸是构成蛋白质的二十余种氨基酸中唯一具有胍基、且碱性最强的氨基酸。以壳聚糖为例，将精氨酸固载到壳聚糖上，不仅可以依赖胍基强的正电性，与带负电细菌本身作用，从而起到提高壳聚糖等吸附材料对分解菌的抵抗能力。同时，由于精氨酸具有最长，且不含刚性基团的柔性侧基。因此，它的引入可使接枝于壳聚糖基体上的柔性氨基酸臂与溶质的接触空间位阻较吡喃葡萄糖环-c2伯胺基明显降低，从而更有利于对金属离子的吸附。可见，以精氨酸对天然壳聚糖进行接枝改性，不仅可以提高壳聚糖吸附材料对金属离子的螯合和捕集能力，还可以提高壳聚糖吸附材料的耐微生物分解性和稳定性，从而扩展其在污水处理中的应用领域，延长其使用寿命，达到一举两得的目的。

常用于测定精氨酸接枝率的方法为凯氏定氮和元素分析法，其中元素分析法测定结果精确，但是存在操作复杂，周期长等缺点；而凯氏定氮法不仅操作复杂，安全系数较低，且对测定氮含量较低的物质结果误差较大。考虑到精氨酸中特有的胍基可与坂口试剂进行反应，产生橙红色沉淀，所以本发明就利用坂口试剂法来测定精氨酸的含量，不仅操作简单，流程短，且结果误差小。

技术实现要素：

本发明的目的就是针对上述存在的问题而提供一种快速测定精氨酸接枝率的方法。通过本发明测定方法，可以高效地测定精氨酸的接枝率。

附图说明

1、图1为精氨酸浓度和吸光度值的标准曲线

2、图2为精氨酸含量不同的溶液坂口反应图

提取工艺

本发明是利用坂口反应，测定精氨酸固载壳聚糖(ca)后精氨酸的接枝率。

具体操作工艺如下：

1.精氨酸标准曲线的制定

坂口试剂测定法是根据精氨酸δ-胍基与坂口试剂反应后可产生橙红色颜色的特殊性质，用分光光度计检测不同标准浓度精氨酸的光密度读数，绘制精氨酸浓度与光密度读数关系的函数线，从而在所制备的标准曲线上查得被检对象对应的精氨酸浓度。

表1为精氨酸浓度为0mg/ml为基准线(0轴)样品，精氨酸浓度分别为0.015mg/ml、0.03mg/ml、0.045mg/ml、0.06mg/ml、0.075mg/ml的在光波长为506.5nm紫外吸收光值。

表1：不同浓度精氨酸坂口反应后的吸光度值

根据所测数据做出精氨酸浓度和吸光度读数的函数曲线，见图1。

由此可得精氨酸浓度和吸光度值的函数关系为y＝0.0934x-0.002，r²＝0.9966。

2.精氨酸接枝壳聚糖的制备

称取三份2g的壳聚糖，用100ml蒸馏水分散，并转移至250ml烧瓶中，分别加入l-精氨酸，l-精氨酸与壳聚糖的摩尔比分别为1∶1、1∶2、1∶3。随后分别加入一定摩尔比的缩合剂edc与偶联剂nhs。用0.1n的盐酸调节ph为5，使包括壳聚糖在内的各反应物充分溶解，形成均一的反应体系，随后于30℃下反应12小时。反应结束后，用0.5n的naoh溶液将体系ph调至8，待产物充分析出后，装入透析袋中，于蒸馏水中透析五天，期间每隔6小时更换一次蒸馏水，以充分去除未反应的氨基酸、缩合剂、偶联剂以及副产物异脲。随后在18％浓度的peg溶液中浓缩24小时，取出产物冷冻干燥，得到最终产物精氨酸接枝壳聚糖ca1、ca2、ca3。

3.水解精氨酸接枝壳聚糖(ca1、ca2、ca3)

分别称取0.1g绝干的精氨酸接枝壳聚糖(ca1、ca2、ca3)，加入50ml2n盐酸溶液中，将溶液转移至250ml平底烧瓶，95℃下加热回流3h，使得精氨酸接枝壳聚糖大分子彻底水解。

4.水解液中精氨酸含量测定

分别取ca1、ca2、ca3水解液1ml，标号1、2、3置于试管中，分别加入4ml蒸馏水稀释5倍，按上述方法做显色反应，如图2所示。测定溶液的吸光度值并计算其接枝率，并与凯氏定氮和元素分析测定的接枝率作出对比，如表2所示。

计算公式如下：

式中：gr％为ca的接枝率；m1为样品水解中精氨酸的含量，单位为毫克；m2为样品质量，单位为克。

表2：不同方法测定不同反应条件下精氨酸的接枝率

由表2可知，与凯氏定氮法相比，水解法测定的接枝率更接近元素分析法测定的接枝率，且相差不大于0.1％；说明水解法是一种可以准确测定精氨酸接枝率的方法，并且此操作简单快捷，在精氨酸接枝优化过程中是一种较好的选择。

技术特征：

技术总结
本发明公布了一种快速测定精氨酸接枝率的方法：测定精氨酸的接枝率常用的方法是凯氏定氮法，通过测定N元素含量的变化来计算求得接枝率，但是此方法误差较大，周期长，操作存在安全隐患等缺点。精氨酸分子中独有的胍基可发生坂口反应，所以提出利用坂口反应测定精氨酸的接枝率。本发明以精氨酸接枝壳聚糖为研究对象，将其用盐酸溶液彻底水解，然后利用坂口反应测定水解液中精氨酸的含量，并计算其接枝率，水解法测定精氨酸接枝率的方法具有操作简单，周期短，结果误差小等优点，是一种快速测定精氨酸接枝率的优先选择。

技术研发人员：张毅;张转玲;刘叶
受保护的技术使用者：天津工业大学
技术研发日：2016.09.14
技术公布日：2018.03.20