本发明涉及药物分析技术领域，特别是涉及一种静注人免疫球蛋白Fc段活性检测方法。
背景技术：
静注人免疫球蛋白(Human intravenous immunoglobulin，IVIG)为人新鲜冰冻血浆纯化制备，临床用于治疗。主要成分为immunoglobulin G(IgG)，《中国药典》2015年版三部(以下简称“药典”)规定IgG纯度＞95％。一个完整的IgG分子，包括一个Fc段和由二硫键结合在一起的两个Fab段，Fab段为主要的抗原结合部位，Fc段则与调理功能(促进吞噬细胞对微生物的接触和吞噬)、自身免疫性疾病的免疫性调节(效应细胞Fc受体的竞争性抑制、抑制性FcγR IIB受体的诱导、FcRn受体饱和作用等)相关。因此，IVIG中IgG的结构完整性对IVIG产品临床有效性至关重要，逐步成为衡量IVIG质量的重要指标。1982年，WHO即要求IVIG制剂中Fc相关功能(激活补体和结合Fc受体的功能)不得受到影响。目前检测人免疫球蛋白Fc段生物学活性的方法主要有激活补体试验、结合Fc受体的调理活性试验、巨噬细胞吞噬细菌作用试验、红细胞玫瑰花形成抑制试验、人免疫球蛋白与葡萄球菌A蛋白结合试验、人免疫球蛋白与Fc特异单抗结合试验及单向散射扩散溶血试验等。
《欧洲药典》和中国药典均推荐了Fc的常规检测方法，其原理为：IgG分子F(ab’)2段和红细胞多价抗原结合，结合抗原的IgG分子Fc段结合补体C1复合物，激活后续补体系统形成C5膜攻击复合物，造成红细胞膜破碎，发生溶血反应，表现为OD540处吸收光逐渐降低，通过绘制红细胞溶血反应动力学曲线，得到静丙Fc段功能活性指数IFc。
该方法存在以下限制：
1)敏化红细胞所用抗原为细菌类毒素或病毒(中国药典推荐白喉类毒素或腮腺炎病毒，欧洲药典推荐风疹病毒)，具有一定的环境危害，较难获得，且抗原成分活性均一度差，批次间质量难以控制，差异性大，造成敏化效果不稳定。
2)仅采用单点标准品数据进行比对，缺乏标准品的校正或系统适用性实验，不能保证每次数据准确有效。
3)通过OD540处吸收光侧面反映红细胞溶血情况，澄明度差的样本易造成初始吸收度(用于校正溶血动力学曲线斜率)高于标准品，从而造成结果偏低。
4)红细胞溶血后产生血红蛋白，在OD540处有光吸收，可能导致检测结果偏低。
5)补体作为必须添加的反应体系试剂，在OD540处有光吸收，在更换补体批次或更换厂家时易造成实验数据波动，影响多检测样本间回顾性分析。
6)实验体系要求空白对照OD540读数上下波动不超过0.05，对检测设备的基线稳定度有较高要求。
7)实验采用石英比色杯，非一次性使用，比色杯承装红细胞后难以清洁干净，红细胞在不光洁的内壁表面聚集，造成初始吸收度偏高结果偏低，或初始吸收度上下波动，严重影响同一样品的重复性。清洗后未及时吹干的比色杯内壁有水稀释样品，造成初始吸收度偏低结果偏高。另外，一次性比色杯经验证透光率、灵敏度差，不能用于Fc活性动力学曲线的绘制。
8)药典常规方法，检测体系为1ml，单个样本检测需样品及标准品900μl，敏化红细胞100μl，补体200μl，国内标准品为1ml冻干制剂仅可用于一个批次样品检测，试剂尤其是标准品成本巨大。
9)药典常规方法，需单个样品测定，耗时平均为30min/样，通量低。
技术实现要素：
本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种静注人免疫球蛋白Fc段活性检测方法，采用更易获得的稳定抗原，添加系统适用性验证，采用细胞计数法直观的检测红细胞溶血，降低传统OD值间接检测时样本澄明度、杂蛋白、试剂、设备耗材等造成的结果波动，提高检测结果的精密度。同时缩小检测体系、提高通量，操作更为便捷。
本发明的一种静注人免疫球蛋白Fc段活性检测方法，包括以下步骤：
【1】材料准备：
1.1试剂：
NaH2PO4·2H2O；Na2HPO4·12H2O；NaCl；CaCl2；MgCl2·6H2O；NaOH；浓盐酸；巴比妥钠；牛白蛋白；鞣酸；豚鼠补体；重组白喉CRM197或重组风疹抗原E1；人新鲜O型血红细胞；中检院Fc标准品。
1.2耗材：
15ml无热原管；5ml无热原管；2ml无热原管(无菌冻存管)；1.5ml EP管；50ml注射器；5ml注射器；细胞计数板；一次性真空采血管。
1.3设备：
台式冷冻离心机；恒温水浴；台式离心机；细胞计数器。
【2】实验前准备：
2.1新鲜血液的采集：
一次性真空采血管收集新鲜O型血3～5ml。新鲜血液不开封状态下可保存1～2周，一旦开启后，进入PBS洗涤阶段则24h内用完。
2.2试剂配制：
1)0.5M NaOH：称取NaOH 2g，加99.5ml纯化水溶解。
2)PBS缓冲液(pH7.2)：Na2HPO4·12H2O 1.285g；NaH2PO4·2H2O0.2185g；NaCl 4.385g，加入496ml无菌水，溶解后，加0.5mol/l NaOH800μl调整pH到7.2，终体积为500ml。
3)巴比妥钠-钙镁贮备液(pH7.3)：NaCl 8.3g；巴比妥钠1.031g；CaCl2 0.0222g；MgCl2·6H2O 0.2172g，加入196ml无菌水，溶解后，用浓盐酸调整pH到7.3，定容至200ml，用0.22μm膜除菌过滤，4℃保存备用。
4)牛白蛋白-巴比妥缓冲液：取0.3g牛白蛋白溶于40ml巴比妥钠-钙镁贮备液(pH7.3)，加入160ml无菌水，现配现用。
5)1.3mg/L鞣酸溶液：A液：取1mg鞣酸，用10ml PBS缓冲液(pH7.2)溶解；B液：取A液0.1ml，用7.5ml PBS缓冲液(pH7.2)溶解，现配现用。
6)豚鼠补体：0.5ml冻干粉，用0.5ml无菌水溶解，现配现用。CH50数值100～110U/ml。
7)F(ab’)2片段溶液：取纯度＞96％的IgG制品，采用Thermo市售试剂盒F(ab’)2Preparation Kits，按照说明书进行酶切和纯化，纯化后溶液浓缩为40mg/ml，SDS检测纯度＞98％，HPLC检测纯度＞95％为符合要求，冻存备用。
8)质控品溶液：牛白蛋白-巴比妥缓冲液稀释IFc％＝100％的标准品至40mg/ml，稀释后标准品与F(ab’)2片段溶液按1:1比例混合，并按照欧洲药典规定方法，新鲜标准品标定质控品IFc％10次，取平均值为质控品溶液IFc％值(标定后IFc％＝48.31％)，一次标定可分装冻存多次使用。
【3】实验操作步骤：
3.1敏化红细胞的制备
1)取O型血三份红细胞混合，PBS洗涤红细胞三次。
2)用PBS配制为2％红细胞悬液。
3)2％红细胞悬液中1:1(V:V)加入1.3mg/L鞣酸B液混匀。37℃水浴15min。
4)PBS洗涤3)中鞣化红细胞一次。并用PBS将红细胞稀释为1％。
5)每100μl 1％鞣化红细胞悬液中加入重组白喉CRM197或重组风疹抗原E1 0.02mg，37℃水浴30min。
6)牛白蛋白-巴比妥缓冲液洗涤5)制备的敏化红细胞两次。
7)牛白蛋白-巴比妥缓冲液调整6)洗涤后红细胞浓度为1％～1.5％。稀释10倍后，细胞计数总细胞数为2500±500个。
至此，敏化红细胞制备完成，4℃保存备用，24h内用完。
3.2样品及标准品的处理：
1)标准品：
复溶后新鲜标准品(pH＝6.0～7.0)加牛白蛋白-巴比妥缓冲液，调节蛋白浓度为40g/L，4℃保存备用，24h内用完。
2)质控品：冻存质控品溶液取出，4℃温和解冻备用，24h内用完。
3)样品：
取新鲜样品，加0.5M NaOH溶液调节为pH6.8～7.0，再加牛白蛋白-巴比妥缓冲液稀释蛋白浓度为40g/L，4℃保存备用，24h内用完。
3.3样品Fc功能检测：
1)取90μl标准品和样品(pH＝7.0，蛋白浓度40g/L)，加入10μl敏化的红细胞。吸打混匀。
2)37℃水浴30min。以1000g 10℃离心10min。200μl/管牛白蛋白-巴比妥缓冲液洗涤两次。最后一次洗涤吸取并废弃上清，尽量吸取完全。
3)加入80μl预热至37℃的牛白蛋白-巴比妥缓冲液，加入20μl补体。吸打混匀，操作尽量轻柔并确保细胞吹散。
4)迅速加入细胞计数板中，细胞计数器读数，每间隔1min读取细胞总数一次。
【4】数据处理：
计算公式如下：
S’＝Sexp/As (a)
IFc＝100％×[(Ss’-Sc’)/(Sr’-Sc’)] (b)
公式中：S’为用As修正Sexp得到的总细胞数最大差值；
As分别为样品、标准品及阴性对照的起始细胞总数；
Sexp分别为根据样品、标准品及阴性对照各自的溶血反应动力学曲线分别计算出相邻3点间的总细胞数最大差值；
IFc为样品激活补体的功能指数；
Ss’为样品总细胞数最大差值；
Sc’为阴性对照总细胞数最大差值；
Sr’为标准品总细胞数最大差值；
按公式(a)分别计算出标准品、样品和阴性对照总细胞数最大差值。按公式(b)计算样品激活补体的功能指数(IFc)。
本发明检测方法的有益效果具体如下：
1)改变敏化红细胞所用抗原类型，淘汰具有致病性的病毒，采用重组合成肽段(蛋白)类抗原，无环境毒害和致病性，批次间性状稳定易于量化，易于获得，敏化过程可以定量操作，大大提高敏化的成功率和稳定性。
2)加入质控品(新鲜标准品十次标定)，质控品检测结果为48.31±5％范围时，认为检测体系无问题，结果有效可信。作为每次实验中的标准品校正和系统适用性实验，确保不出现由于单点标准品存放、复溶等原因造成的检测结果误差。
3)采用直观的细胞计数法替代传统的吸光度法绘制溶血动力学曲线，红细胞在细胞计数板中平铺为一个薄层，通过细胞计数仪进行细胞成像，进而由软件自动统计学运算计数，红细胞完整结构时为红色(完全折光)可进行计数，发生溶血后彻底破裂(完全透光)不进行计数，界限鲜明、分辨率高、准确度高、速度快。光学系统的干扰几乎不存在，对比标准品澄明度较差的样品也能得到准确结果，同时避免了补体、溶血后血红蛋白等对结果的影响。
4)空白稳定性好，单个样品多次计数上下波动＜50。
5)实验采用细胞计数仪配套的一次性细胞计数板，洁净度高、均一性高，避免使用比色杯时洁净度等对单个样本重复性的影响，且操作更为便捷。
6)本发明方法，检测体系为20μl，单个样本检测需样品及标准品90μl，敏化红细胞10μl，补体20μl，国内标准品为1ml冻干制剂可用于10个批次样品检测，仅为药典方法使用量的1/10，显著节约成本。
7)可多个样品同时检测，提高通量。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例1
1.材料准备：
1.1试剂：
NaH2PO4·2H2O；Na2HPO4·12H2O；NaCl；CaCl2；MgCl2·6H2O；NaOH；浓盐酸；巴比妥钠；牛白蛋白(Sigma)；鞣酸；豚鼠补体(京泰生物)；重组白喉CRM197(兴华科创)；人新鲜O型血红细胞；中检院Fc标准品。
1.2耗材：
15ml无热原管；5ml无热原管；2ml无热原管(无菌冻存管)；1.5ml EP管；50ml注射器；5ml注射器；细胞计数板；一次性真空采血管。
1.3设备：
台式冷冻离心机；恒温水浴；台式离心机；细胞计数器。
2.实验前准备：
2.1新鲜血液的采集：
一次性真空采血管收集新鲜O型血3～5ml。
2.2试剂配制：
1)0.5M NaOH：称取NaOH 2g，加99.5ml纯化水溶解。
2)PBS缓冲液(pH7.2)：Na2HPO4·12H2O 1.285g；NaH2PO4·2H2O0.2185g；NaCl 4.385g，加入496ml无菌水，溶解后，加0.5mol/l NaOH800μl调整pH到7.2，终体积为500ml。
3)巴比妥钠-钙镁贮备液(pH7.3)：NaCl 8.3g；巴比妥钠1.031g；CaCl2 0.0222g；MgCl2·6H2O 0.2172g，加入196ml无菌水，溶解后，用浓盐酸调整pH到7.3，定容于200ml，用0.22μm膜除菌过滤，4℃保存备用。
4)牛白蛋白-巴比妥缓冲液：取0.3g牛白蛋白溶于40ml巴比妥钠-钙镁贮备液(pH7.3)，加入160ml无菌水，现配现用。
5)1.3mg/L鞣酸溶液：A液：取1mg鞣酸，用10ml PBS缓冲液(pH7.2)溶解；B液：取A液0.1ml，用7.5ml PBS缓冲液(pH7.2)溶解，现配现用。
6)豚鼠补体：0.5ml冻干粉，用0.5ml无菌水溶解，现配现用。CH50数值100～110U/ml。
7)F(ab’)2片段溶液：取纯度＞96％的IgG制品，采用Thermo市售试剂盒F(ab’)2Preparation Kits，按照说明书进行酶切和纯化，纯化后溶液浓缩为40mg/ml，SDS检测纯度＞98％，HPLC检测纯度＞95％为符合要求，冻存备用。
8)质控品溶液：牛白蛋白-巴比妥缓冲液稀释IFc％＝100％的标准品至40mg/ml，稀释后标准品与F(ab’)2片段溶液按1:1比例混合，并按照欧洲药典规定方法，新鲜标准品标定质控品IFc％10次，取平均值为质控品溶液IFc％值(标定后IFc％＝48.31％)，一次标定可分装冻存多次使用。
3.实验操作步骤：
3.1敏化红细胞的制备
1)O型血采血管垂直静置，吸取沉降红细胞500μl，三份红细胞混合后吸取250μl备用。
2)10ml/管PBS洗涤红细胞，轻震翻转混匀(V:V≥3)。1000g 10℃离心10min。洗涤三次。最后一次洗涤吸取并废弃上清，尽量吸取完全。
3)加入12.5ml/管PBS，配制为2％红细胞悬液。
4)2％红细胞悬液5ml加1.3mg/L鞣酸B液5ml混匀。37℃水浴15min。
5)10ml/管加入PBS，轻震翻转混匀(V:V≥3)。1000g 10℃离心10min。洗涤一次。吸取并废弃上清，尽量吸取完全。
6)加PBS 10ml将红细胞重悬为1％。取500μl 1％的红细胞悬液，加入重组白喉CRM197 40μl。
7)37℃水浴30min。每隔10min轻震翻转混匀一次，防止红细胞沉积。
8)1000g 10℃离心10min。加1ml/管牛白蛋白-巴比妥缓冲液，轻震翻转混匀。
9)吸取并废弃上清，再1000g 10℃离心10min。
10)吸取并废弃上清，再加1ml/管牛白蛋白-巴比妥缓冲液，轻震翻转混匀。洗涤两次。最后一次洗涤吸取并废弃上清，尽量吸取完全。
11)牛白蛋白-巴比妥缓冲液重悬红细胞，并调整红细胞浓度为1％～1.5％。稀释10倍后细胞计数总细胞数为2500±500个。
至此，敏化红细胞制备完成，4℃保存备用，24h内用完。
3.2样品及标准品的处理：
1)标准品：
复溶后新鲜标准品(pH6.0～7.0)加牛白蛋白-巴比妥缓冲液，调节蛋白浓度为40g/L，4℃保存备用，24h内用完。
2)质控品：冻存质控品溶液取出，4℃温和解冻备用，24h内用完。
3)样品：
取新鲜样品，加0.5MNaOH调节为pH6.8～7.0，再加牛白蛋白-巴比妥缓冲液稀释蛋白浓度为40g/L，4℃保存备用，24h内用完。
3.3样品Fc功能检测：
1)取90μl标准品和样品(pH7.0，蛋白浓度40g/L)，加入10μl重组白喉CRM197敏化红细胞。吸打混匀。
2)37℃水浴30min。1000g 10℃离心10min。200μl/管牛白蛋白-巴比妥缓冲液洗涤两次。最后一次洗涤吸取并废弃上清，尽量吸取完全。
3)加入80μl预热至37℃的牛白蛋白-巴比妥缓冲液，加入20μl补体。吸打混匀，操作尽量轻柔并确保细胞吹散。
4)迅速加入细胞计数板中，读数，每间隔1min读取细胞总数一次。
4.数据处理：
计算公式如下：
S’＝Sexp/As(a)
IFc＝100％×[(Ss’-Sc’)/(Sr’-Sc’)](b)
公式中：S’为用As修正Sexp得到的总细胞数最大差值；
As分别为样品、标准品及阴性对照的起始细胞总数；
Sexp分别为根据样品、标准品及阴性对照各自的溶血反应动力学曲线分别计算出相邻3点间的总细胞数最大差值；
IFc为样品激活补体的功能指数；
Ss’为样品总细胞数最大差值；
Sc’为阴性对照总细胞数最大差值；
Sr’为标准品总细胞数最大差值。
按公式(a)分别计算出标准品、样品和阴性对照总细胞数最大差值。按公式(b)计算样品激活补体的功能指数(IFc)。
具体结果见表1-1和表1-2：
表1-1
表1-2
5.与药典传统方法的比较：
欧洲药典传统方法检测结果见表2-1和表2-2
表2-1
表2-2
本发明检测方法与欧洲药典规定检测方法相比，同一样品检测结果一致不存在差异性，但本方法CV％仅为3.074远低于传统方法的17.313，已达到CV％＜15的精密试验标准。且本方法选用抗原便于获得性状稳定可控，体系小通量大，相较于传统方法优势明显。